山茱萸提取物、其提取方法以及在制备药物及保健品中的用途的制作方法

专利名称：山茱萸提取物、其提取方法以及在制备药物及保健品中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及山茱萸提取物、其提取方法和其在制备防治神经损伤及神经系统疾病的药物及保健品中的用途，也涉及由本发明提取方法所得山茱萸提取物配制的药物和保健品组合物。
背景技术：
神经系统疾病包括脑、脊髓和外周神经的功能和结构异常改变，常见血循环障碍引起的脑血管病、脑缺氧、机械性损伤引起的脑震荡、脑水肿、神经系统手术损伤、神经压迫症或神经炎症，以及神经退行性疾病(变性病)、Alzheimer病，帕金森病、血管性痴呆等。这些疾病的主要病理机制是神经系统内自由基产生过多、细胞内钙离子含量过高等因素造成神经细胞水肿或死亡的病理过程。针对这些机制研制有效的防治神经系统疾病和症状的药物具有十分重要的意义。因此，本发明人经过大量研究发现，山茱萸提取物动物模型上表现出明显的减少神经细胞丢失，增强神经营养因子表达，促进伤口周围神经生长相关蛋白的表达，有利于轴突的生长；减轻受损神经组织水肿，减少自由基损伤；抑制神经细胞内钙离子超载；抑制单胺氧化酶B活性，改善受损神经功能，提高M-胆碱能受体结合力，增强胆碱乙酰基转移酶活性，抑制乙酰胆碱酯酶等活性；改善学习记忆功能；对神经元的各种损伤有良好的保护作用，基于该发现，实现了本发明。特别是本发明独特的方法得到的山茱萸提取物，提高了莫诺苷和马钱素含量，而大大提高了其在治疗神经系统疾病方面的效果。

发明内容
本发明的目的因此是提供山茱萸提取物及其制备方法和在防治神经损伤和神经系统疾病的药物及保健品中的用途。
所述神经损伤是指脑、脊髓和外周神经在受到血循环障碍、机械性损伤、内原性自由基损伤、神经退行性改变等因素所导致的功能和结构异常改变。
所述神经系统疾病包括脑、脊髓和外周神经的功能和结构异常改变，常见血循环障碍引起的脑血管病、脑缺氧、机械性损伤引起的脑震荡、脑水肿、神经系统外伤或手术损伤、神经压迫症或神经炎症，以及神经退行性疾病(变性病)、Alzheimer病，帕金森病、血管性痴呆等疾病。
本发明采用独特的提取方法所得到的山茱萸提取物，经分析，以提取物总重量计，含莫诺苷25-50wt％、马钱素25-40wt％，二者总含量占总提取物的50-90wt％，完全不同于现有技术的该提取物。
本发明的山茱萸提取物的制备方法包括以下步骤(A)水提或水提醇沉；(B)大孔吸附树脂分离；和(C)精制。
所述水提优选包括山茱萸药材用水煎煮2-4遍，加水量3-14倍，时间1-4小时，合并煎煮液，过滤后减压浓缩。
所述水提醇沉优选包括山茱萸药材用水煎煮2-4遍，加水量3-14倍，时间1-4小时，合并煎煮液，过滤后减压浓缩，加乙醇调至醇浓度为50％-90％，冷藏12-48小时，过滤，滤液减压回收乙醇。
所述大孔吸附树脂分离优选包括以下步骤取浓缩的山茱萸水提取或水提醇沉提取液，上大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、5％-95％乙醇进行梯度洗脱，减压浓缩成流浸膏。
所述精制优选包括将大孔吸附树脂分离的流浸膏上Al2O3层析柱，用乙醇洗脱，冻干获得固体产物。
有效成分的测定方法对上述提取物制品应用薄层层析进行定性分析。并且对上述提取物制品应用高效液相色谱仪进行定量分析，色谱条件Lichrospher-C18色谱柱，流动相甲醇-水(3070)，检测波长240nm，流速1.0ml/分钟。检测分析结果莫诺苷含量占25-50％、马钱素含量占25-40％，二者总含量占50-90％。
本发明提供了山茱萸提取物在制备治疗神经系统疾病的药物或保健品中的用途，所述神经系统疾病包括神经系统损伤和神经系统退行性病变，尤其脑、脊髓和外周神经的功能和结构异常改变，常见血循环障碍引起的脑血管病、脑缺氧、机械性损伤引起的脑震荡、脑水肿、神经系统手术损伤、神经压迫症或神经炎症，以及神经退行性疾病(变性病)、Alzheimer病，帕金森病、血管性痴呆等。
有关上述山茱萸提取物在制备治疗神经系统疾病的药物或保健品中的应用中所说的提取物，既包括用本发明提取方法所得到的山茱萸提取物，也包括利用本领域任何已知技术所获得的山茱萸提取物。就是说也包括选自水提取、有机溶剂提取、液相色谱技术、气相色谱技术、层析技术等常规提取法之一或多项技术结合所获得的山茱萸提取物。
本发明还提供了含有上述提取物的药物组合物和保健品组合物。所述治疗各种神经系统疾病的药物组合物，含有10-100％，优选20-90％，更优选50-90％本发明山茱萸提取物，根据需要还可含0-90％，优选10-80％，更优选10-40％常规药用载体。而所述保健品组合物一般含有5-80％，优选10-50％本发明山茱萸提取物，根据需要还可含20-95％，优选50-90％常规食用载体或添加剂。
本发明中提到的百分数均为重量百分数。
所述本发明提取物中莫诺苷(morroniside)、马前素(loganin即番木鳖苷)含量较高。在本发明的提取物中，莫诺苷含量占25-50％、马钱素含量占25-40％，二者总含量占50-90％。但在本发明的提取物中，除了以上成分以外，并不排除有其它活性成分的存在，例如包括山茱萸甙(Cornin即马鞭草甙Verbenalin)、甲基莫诺甙(methylmorroniside)、脱氢马前素(dehydrologanin)、环烯醚萜甙(iridoid glycosides)、獐牙菜甙(sweroside)、5-羟甲基糠醛、皂甙等中的一种或多种，它们的含量例如可以是0.1-20％。
本发明的药物组合物和保健品组合物剂型可以是片剂、丸剂、粉剂、胶囊、口服液等。制备这些剂型的方法是本领域的常规方法，这对本领域的技术人员来说是公知的，并且描述在许多文献中。其药用量根据病人的年龄，体重，疾病的性质，病情轻重，医生的选择等因素决定。作为指导，以本发明提取物浓缩剂计，用量通常为1-500mg/公斤体重·日。
具体实施例方式
以下结合实施例来说明本发明的提取物的制备方法，应该理解的是，这些实施例仅为本发明实践中的较佳实施方案，它们决不构成对本发明范围的限制。本领域的技术人员清楚，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以做出一些变化和修改，这些变化和修改均包涵在本发明的范畴内。
实施例1
水提山茱萸药材用水煎煮3遍，加水量6倍，时间2小时，合并3次煎煮液，过滤后减压浓缩，冷藏备用。
大孔吸附树脂分离取浓缩的山茱萸水提取物，上大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、30％乙醇进行梯度洗脱，减压浓缩成流浸膏。
精制将大孔吸附树脂分离的流浸膏上Al2O3层析柱，用乙醇洗脱进行精制，冻干获得固体产物，得率2.3％。经高效液相色谱仪分析，所述产物中莫诺苷含量占山茱萸提取物25-50％、马钱素含量占山茱萸提取物25-40％，二者总含量占50-90％。
实施例2水提醇沉山茱萸药材用水煎煮3遍，加水量6倍，时间2小时。合并3次煎煮液，过滤后减压浓缩，加乙醇调至醇浓度为70％，冷藏24小时，过滤，滤液减压回收乙醇后，冷藏备用。
大孔吸附树脂分离取浓缩的山茱萸水提取液或水提醇沉提取液，上大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、50％乙醇进行梯度洗脱，减压浓缩成浸膏。
精制将大孔吸附树脂分离的流浸膏上Al2O3层析柱，用乙醇洗脱进行精制，冻干获得固体产物，得率2.5％。经高效液相色谱仪分析，所述产物中莫诺苷含量占山茱萸提取物25-50％、马钱素含量占山茱萸提取物25-40％，二者总含量占50-90％。
实施例3 片剂的制备将实施例2的山茱萸提取物50mg，乳糖70mg，玉米淀粉350mg，硬脂酸镁5mg，聚乙烯吡咯烷酮5mg按常规方法制成片剂。
实施例4 口服液的制备实施例1的山茱萸提取物10g，蔗糖90克，柠檬酸8克，阿斯巴甜3克，山梨酸钾0.2克加水至1000毫升，加热溶解，加入香精，搅拌均匀，分装到灭菌的100小瓶中，每瓶10ml，包装即可。
实施例5 胶囊的制备实施例2的山茱萸提取物100g，滑石粉4克，玉米淀粉50g，乳糖50g，混合均匀，分装到胶囊中，包装，制成1000粒胶囊。
实施例6 缓释片剂的制备实施例1的提取物100g，加入5％PVP，25％酒精溶液混合均匀，软材用18目制粒，烘干，加入HPMC、硬脂酸镁整粒，压片，包装。
实施例7 输液的制备实施例2的山茱萸提取物10g加生理盐水定容至1000毫升，再加热溶解，检验，分装入灭菌的瓶中，包装。
本发明提取物的药效学试验一、山茱萸提取物对隔海马穹隆伞切断致神经损伤和痴呆模型大鼠的影响老年痴呆是一种慢性脑退行性疾病，临床以记忆力衰退为首发症状，逐渐发展成为记忆完全丧失、语言障碍、运动功能障碍。研究发现老年痴呆患者的脑皮质和海马中胆碱能神经元减少、胆碱乙酰基转移酶和乙酰胆碱含量减少40％-90％。给轻中度老年痴呆患者以中枢性拟胆碱药治疗，可以提高患者的认知功能。切断大鼠隔海马穹窿伞可造成机械性神经损伤，并阻断海马胆碱能通路，既可用作神经损伤的动物模型，又可用作老年痴呆或认知损害的动物模型，本研究观察了山茱萸提取物在防治神经损伤老年痴呆和认知损害中的疗效。
(一)山茱萸提取物提高隔海马穹隆伞切断模型大鼠的学习记忆能力1、实验目的现已证明隔海马胆碱能通路在学习记忆中发挥了重要的作用。本实验通过切断大鼠隔海马穹隆伞，造成胆碱能神经通路阻断、胆碱能系统功能低下的动物模型，观察山茱萸提取物在防治神经损伤及老年痴呆中的疗效。
2、实验方法雄性SD大鼠，自术前半小时灌胃给药开始，至术后6周，每日灌药1次。以脑复康(匹拉西坦)为阳性对照药。
(1)隔海马穹隆伞切断大鼠模型的制备雄性SD大鼠，腹腔麻醉。脑立体定位仪定位，钻孔，调整刀片及调节钮至前后标记点为0位。再后移2mm，侧移1mm，至脑表面后向下5mm。上下缓慢抽刀4mm两次，然后外移3mm，再上下缓慢抽刀两次，留置刀片2分钟，退出刀片。移至对侧进行同样操作。
(2)学习记忆测试方法Morris水迷宫测试术后第四周开始Morris水迷宫测试。每个测试持续1分钟，测试间隔约1分钟。如鼠在1分钟内不能找到平台，引导它达到平台，并把它放在平台上10秒种，共测6天。
通道式水迷宫测试术后6周开始测通道式水迷宫。测定前使每只大鼠在出口处游上平台，然后开始进行两盲端测试，次日进行三盲端测试，从第三日开始进行四盲端测试，共测试6天。每次测试时间定为180秒。如鼠不能找到出口，引导鼠到达出口。记录鼠游出时间和错误次数，大鼠每进入一个盲区或反向游泳定为一次错误。
3、实验结果两种水迷宫行为学方法的测试结果发现，山茱萸提取物能明显减短模型大鼠的游出时间(表1，表2)，表明该药对痴呆大鼠模型的学习记忆功能具有改善作用，同时表明该药使神经损伤大鼠的功能有明显好转。
表1.山茱萸提取物对模型大鼠Morris水迷宫游出时间的影响组别 动物数游出时间(秒)正常对照(假手术) 1413.49±10.72**模型 1445.60±14.54模型+脑复康(阳性对照药) 1235.70±14.53*山茱萸提取物 1.5g/kg 1532.78±18.29**山茱萸提取物 3g/kg 1637.22±17.28*山茱萸提取物 6g/kg 1237.79±12.93M±SD；*P＜0.05；**p＜0.01，与模型组比较。
表2.山茱萸提取物对模型大鼠通道式水迷宫游出时间的影响组别 动物数游出时间(秒)正常对照(假手术) 142.19±2.17**模型 1418.94±8.80模型+脑复康 1112.27±7.58**山茱萸提取物 1.5g/kg 1514.46±8.60**山茱萸提取物 3g/kg 1414.21±7.36**山茱萸提取物 6g/kg 9 15.31±8.26M±SD；*P＜0.05；**p＜0.01，与模型组比较。
(二)山茱萸提取物对隔海马穹隆伞切断模型大鼠脑神经元的保护作用1、实验目的老年痴呆、帕金森病等神经退行性疾病和多种原因引起的神经损伤的重要病理特点之一是神经元的萎缩和丢失。本研究观察山茱萸提取物对模型大鼠神经元的影响。
2、实验方法在隔海马穹隆伞切断并灌胃给药6周后，每组随机选4-7只大鼠灌杀，经固定后，冰冻切片，经尼氏染色后，选取同样的数量图片数，进行图像分析。分别在内侧隔核和海马齿状回多形层进行神经细胞记数。
3、实验结果在内侧隔核区和海马齿状回多形层，山茱萸提取物能明显减少神经元的丧失(表3)，表明山茱萸提取物对隔海马穹隆伞切断模型大鼠脑神经元有较好的保护作用。
表3、山茱萸提取物对模型大鼠海马齿状回多形层神经元的影响组别 N 图片数神经元数量正常对照(假手术) 720 21.00±5.30模型 520 19.50±6.25模型+脑复康 420 21.20±6.96山茱萸提取物 1.5g/kg 420 23.65±4.49*山茱萸提取物 3g/kg 520 22.00±7.59山茱萸提取物 6g/kg 420 21.15±7.31M±SD；*P＜0.05，与模型组比较。
(三)山茱萸提取物增强隔海马穹隆伞切断模型大鼠神经生长因子的表达1.实验目的在中枢神经或外周神经损伤时，神经生长因子(NGF)对神经元的存活和功能起着重要作用。老年痴呆、帕金森病等神经退行性疾病患者脑内神经生长因子明显减少。本研究观察山茱萸提取物对模型大鼠神经生长因子的影响。
2.实验方法雄性SD大鼠，隔海马穹隆伞切断造模，灌胃给药6周，每日灌药1次。术后6周，用免疫组化的方法测定脑组织切片的NGF含量，并进行图象分析。
3.实验结果山茱萸提取物能明显增强模型大鼠内侧隔核、海马齿状回多形层、内嗅皮层/下托区NGF的表达(表4)，表明该药对多种神经系统疾病具有神经营养和神经保护作用。。
表4.山茱萸提取物对模型大鼠内侧隔核神经生长因子的影响组别N 图片数 阳性细胞数正常对照(假手术)7 10 67.1±49.4模型5 10 50.2±48.6模型+脑复康 4 10 212.0±01.9**山茱萸提取物 1.5g/kg4 10 145.1±57.7**山茱萸提取物 3g/kg 5 10 161.3±08.2**山茱萸提取物 6g/kg 4 10 200.6±58.2**M±SD；*P＜0.05；**p＜0.01，与模型组比较。
二、山茱萸提取物对东莨菪碱致痴呆或记忆损害小鼠模型的影响(一)山茱萸提取物提高东莨菪碱致模型小鼠学习记忆能力1.实验目的老年痴呆以基底前脑胆碱能神经元丢失最为严重，造成乙酰胆碱分泌不足。东莨菪碱为M受体阻断剂，能阻断乙酰胆碱对M受体的激动作用，因此模仿了乙酰胆碱分泌不足的结果，是老年痴呆或记忆损害的动物模型之一。Morris水迷宫是有效的评价大鼠行为能力的方法，本研究观察了山茱萸提取物对东莨菪碱小鼠模型学习记忆能力的影响。
2.实验方法雄性昆明小鼠，第一天灌胃给药后30分钟于腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液1mg/kg，20分钟后对动物进行水迷宫测试。共连续给药和测试5天。
Morris水迷宫测试(同实验一)。
3.实验结果山茱萸提取物可以显著减少模型小鼠在Morris水迷宫试验中的游出时间，缩短游泳距离(表5)，表明该药可改善痴呆模型小鼠的学习记忆功能。
表5.山茱萸提取物对东莨菪碱模型小鼠Morris水迷宫测试的影响组别 游出时间(秒) 游泳距离(厘米)对照 67.93±47.52**1146.3±836.1**模型 99.32±38.10 1808.8±869.4模型+脑复康 63.58±48.26**1101.2±872.3**山茱萸提取物 1.7g/kg 84.81±47.42 1476.4±1028.1山茱萸提取物 5g/kg77.95±49.08*1313.0±1036.0*山茱萸提取物 15g/kg 67.30±47.55**1185.2±893.3**M±SD；*P＜0.05；**p＜0.01，与模型组比较。
(二)山茱萸提取物提高东莨菪碱小鼠模型脑组织M-胆碱能受体活性1.实验目的神经递质乙酰胆碱需与受体结合才能发挥其功能作用，因此脑组织M-胆碱能受体是影响学习记忆的重要因素。本研究观察山茱萸提取物对模型小鼠脑组织M-胆碱能受体的影响。
2.实验方法雄性昆明小鼠，第一天灌胃给药后30分钟于腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液1mg/kg，连续测试水迷宫4天后取脑组织，制备脑突触膜，按Lowry法测定膜蛋白含量。进行受体结合实验从-70℃冰箱取出突触膜，调整蛋白浓度。取100μl稀释液加入200μl 50mMPB，每管加入0.1μCi3H-QNB。在25℃孵浴60min，反应结束后用预冷的50mMPB 5ml，抽滤于纤维滤膜上，并用预冷的50mMPB20ml分3次洗涤。将滤膜置于闪烁杯内加入Tritom甲苯闪烁液5ml于液体闪烁仪上测定cpm值，结合突触膜蛋白量计算出3H-QNB的结合量(以每毫克蛋白所结合的3H-QNBfmol数表示)。
3.实验结果山茱萸提取物可以显著提高东莨菪碱小鼠模型脑组织M-胆碱能受体活性(表6)。
表6.山茱萸提取物对东莨菪碱模型M-胆碱能受体活性的影响3H-QNB特异性结合量组别 动物数(fmol/mgprot)对照 6 247.37±36.88*模型 7 218.38±39.04模型+脑复康 6 250.07±58.96山茱萸提取物 1.7g/kg 9 198.68±52.05山茱萸提取物 5g/kg 9 310.98±48.60**山茱萸提取物 15g/kg 7 282.25±46.55**M±SD；*P＜0.05；**p＜0.01，与模型组比较。
(三)山茱萸提取物提高东莨菪碱小鼠模型脑组织胆碱乙酰基转移酶活性1.实验目的脑内胆碱乙酰基转移酶(ChAT)的活性下降可以导致神经递质乙酰胆碱生成减少，造成学习记忆功能减退。本研究观察山茱萸提取物对模型小鼠脑内ChAT活性的影响。
2.实验方法将小鼠脑组织按1∶20(w/v)比例加入4℃ 10mM EDTA溶液，冰浴下匀浆，测定匀浆液的蛋白浓度，用放免法测定ChAT。计算ChAT活性＝(样品cpm-空白cpm)/总计数cpm×每管配基的克分子数/样品蛋白的mg数。
3.实验结果山茱萸提取物可以使模型小鼠脑内胆碱乙酰基转移酶(ChAT)的活性显著提高(表7)，使乙酰胆碱合成增多，有利于改善学习记忆功能。
表7.山茱萸提取物对东莨菪碱小鼠模型脑组织ChAT的影响ChAT活性组别 动物数(pmol/mg prot/min)对照 7 37.46±8.55模型 7 37.79±9.17模型+山茱萸提取物 1.7g/kg 9 44.99±14.26山茱萸提取物 5g/kg9 45.82±8.20*山茱萸提取物 15g/kg 7 59.96±19.93**M±SD；*P＜0.05；**p＜0.01，与模型组比较。
三、山茱萸提取物对神经损伤模型大鼠的影响1、实验目的中枢及外周神经组织水肿是神经组织损伤的典型表现，本实验过程观察山茱萸提取物对机械性神经损伤引起脑水肿的影响。
2、实验方法SD大鼠，体重200-250g，以山茱萸提取物灌胃给药7天，仿Feeney’s自由落体皮层挫伤模型制作方法，10％水合氯醛0.4ml/kg体重腹腔麻醉，剪去顶部皮毛，碘伏消毒。沿顶正中线左侧切开头皮，分离骨膜，以骨钻在冠状缝后1mm，正中缝左旁2mm钻一直径为5mm的圆形骨窗。将一自制的硬塑打击垫放入骨窗，将砝码沿玻璃导管在30cm高处垂直自由坠落在打击垫上，取走砝码，缝合头皮。3小时后迅速断头取脑，分离伤侧与健侧皮层各100mg左右脑组织，放在已称重的小玻璃瓶中，置110℃干燥箱干燥48小时，称量至恒重时取出。以(湿重-干重)/湿重×100％计算含水量，并以各组右侧(健侧)含水量进行校正后，作组间比较。
3、实验结果山茱萸提取物可有效降低神经损伤大鼠脑含水量，说明该药对神经损伤及神经组织水肿具有良好治疗作用。(表8)表8 药物干预对神经损伤SD大鼠脑含水量的影响(n＝6)皮层含水百分率组别(％)正常对照78.43±0.33*模型(神经损伤) 79.90±0.43模型+山茱萸提取物 1.5g/kg 79.17±0.23山茱萸提取物 3g/kg 79.02±0.26*M±SD；*P＜0.05，与神经损伤模型组比较四、山茱萸提取物对抗自由基增高诱导的神经损伤小鼠模型的影响实验目的自由基增高是多种神经系统疾病(如脑血管病、神经损伤、神经炎症、老年痴呆、帕金森病等)的重要发病机制。由氧自由基增高引起血管内皮细胞损伤，血小板聚集，形成血栓，导致局部组织缺血坏死是缺血性心脑血管病和周围血管病的共同病理变化。光化学诱导急性脑梗塞的造模原理是将光敏物质(玫瑰红)注入小鼠尾静脉，以560nm波长的冷光源照射小鼠颅部，发生光化学反应，生成大量氧自由基，引起血管内皮细胞损伤，血小板聚集，在照射区内形成血栓，局部皮层缺血坏死。本研究旨在观察山茱萸提取物对自由基增高诱导的神经损伤的影响。
实验方法给小鼠灌服不同剂量山茱萸提取物，15天后造模。将光敏物质(玫瑰红)注入小鼠尾静脉，以560nm波长的冷光源照射小鼠颅部。在造模后3小时经舌静脉注入伊文斯兰染料，1小时后处死动物。处死后取脑组织制成匀浆，并以比色法测定平均脑组织的光密度。梗塞严重者，染色深，光密度大，脑组织缺血半暗区面积大。
实验结果灌服山茱萸提取物可降低光化学诱导急性脑梗塞模型小鼠脑组织伊文斯兰的光密度，并减少模型小鼠缺血半暗区的面积(表9)。表明山茱萸提取物可减轻由于氧自由基增高而引起血管损伤和血栓形成，有利于防治缺血性血管病的血管损伤和组织坏死，并有利于防治与自由基增高有关的多种疾病。
表9 山茱萸提取物对光化学诱导脑梗塞小鼠模型的影响组别 动物数 伊文斯兰(OD值) 缺血半暗带面积模型组 6 0.1333±0.0759 ++++模型+山茱萸提取物 0.167g/kg6 0.1097±0.0259 ++山茱萸提取物 0.5g/kg 8 0.1072±0.0303 +山茱萸提取物 1.5g/kg 8 0.0547±0.0260*+M±SD；*p＜0.05，与模型组相比缺血半暗带+，++，+++，++++代表面积依次由小到大。
五、山茱萸提取物对抗神经细胞钙超载损伤1.实验目的神经细胞内钙超载是多种神经系统疾病(如脑血管病、神经损伤、神经炎症、老年痴呆、帕金森病等)的重要发病机制。由缺血引起的胞浆钙离子浓度异常增高是缺血性心脑血管病和周围血管病的共同病理变化，钙离子增高也可引起血管收缩或痉挛。MCAO是常用的模拟临床疾病的局灶性脑缺血模型。细胞内钙离子稳态失调在细胞缺血损害中起重要作用。由缺血引起的胞浆钙离子浓度异常增高，可使得受钙离子调节的磷脂酶、蛋白酶、核酸内切酶等被激活导致膜磷脂分解和细胞骨架破坏，细胞产生不可逆性损伤。本研究旨在观察山茱萸提取物对缺血后神经细胞胞浆内钙离子浓度的影响。
2.实验方法(1)大脑中动脉闭塞大鼠模型制作实验大鼠于第14天给药30分钟后行腹腔麻醉，于右外耳道与右外眦连线中点作一上下的斜行切口，分离至充分暴露大脑中动脉，以浸有50％三氯化铁的滤纸条贴于大脑中动脉与大脑前静脉交叉处，30分钟后用显微镜观察大脑中动脉血流确已阻断，去滤纸，生理盐水冲洗、缝合。
(2)海马细胞内钙离子荧光强度的测定大鼠造模后24小时，断头取脑后置于人工脑脊液中，于视交叉水平切300微米厚的脑片。加入含5uMFluo-3/AM的人工脑脊液400微升，孵育1小时后激光共聚焦显微镜测定海马区细胞内钙离子荧光强度。
3.实验结果每组右侧为缺血侧，钙离子浓度比健侧(左侧)增高。左右脑钙离子浓度差值比较，模型组海马细胞内钙离子荧光强度增高较对照组明显，模型是成立的。山茱萸提取物用药组较模型组海马细胞内钙离子浓度降低(表10)。表明该药可降低神经细胞胞浆内钙离子浓度，有利于保护神经组织，提高细胞存活率，对多种神经系统疾病和缺血性血管病的防治具有重要意义。
表10 山茱萸提取物对模型大鼠海马细胞胞浆钙离子浓度的影响组别钙离子荧光强度缺血侧 健侧 (缺血侧-健侧)差值正常对照(假手术)47.99±26.2836.72±6.93 11.27±22.38*模型105.27±41.30 60.31±32.3444.96±12.44模型+海得琴(对照药) 86.02±35.1056.15±27.3029.88±29.13山茱萸提取物 0.33g/kg 99.20±13.5258.33±19.1040.86±18.23山茱萸提取物 1g/kg 89.57±15.6754.57±17.7534.60±3.92山茱萸提取物 3g/kg 95.22±29.4264.40±23.4430.82±17.39M±SD；*p＜0.05，与对照组相比六、山茱萸提取物对缺血缺氧致神经损伤和痴呆大鼠模型的影响(一)山茱萸提取物提高大鼠模型学习记忆功能1.实验目的神经组织缺血缺氧可造成功能障碍、学习记忆功能减退即为脑组织损伤的重要表现。长期脑缺血可造成血管性痴呆，而且脑缺血与老年性痴呆的发病机理也有密切关系。本研究观察山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎致神经损伤和痴呆大鼠模型学习记忆功能的影响。
2.实验方法(1)双侧颈总动脉结扎大鼠模型的制备SD大鼠，腹腔注射麻醉，分离双侧颈总动脉，用1号丝线永久结扎，缝合肌肉皮肤。术前预防灌胃给山茱萸提取物2周，术后灌胃给药8周。
(2)避暗法检测被动回避记忆功能。采用大鼠避暗箱，于术后第8周进行实验，第一天进行训练，将大鼠放入明室中，使其进入暗室受电击2次，24小时后进行测试，记录大鼠进入暗室的次数和潜伏期，并分级。两前肢进入暗室记为1分；三前肢进入暗室记为2分；四肢同时进入暗室记为3分。结果组间比较，进行t检验。
(3)通道式水迷宫法于术后第8周开始训练。实验分4天进行，第1天训练2盲端2次，第2天训练3盲端2次；第3天训练4盲端2次，第4天测4盲端。每次训练时间限定在2min。每只大鼠每次训练和测试均记录到达终点的时间(到达时间)和进入盲端的次数(错误数)。以4盲端训练期到达时间和错误数的均值作为学习成绩，4盲端测试期到达时间和错误数作为记忆成绩，结果组间比较，进行t检验。
(4)Morris水迷宫法于术后第8周开始训练。实验分5天进行，每天训练2次。第1天训练2次，入池位置为站台所对象限及所邻象限。于象限边1/2弧度处将大鼠头朝池壁入水。训练时间限定在2min。每只大鼠每次训练均记录游出时间、距离、搜索站台的轨迹。结果组间比较，进行t检验。
3.实验结果双侧颈总动脉长期结扎的方法可使大鼠产生学习记忆障碍。山茱萸提取物可改善大鼠的学习记忆功能，表现在可缩短水迷宫试验中的游出时间和距离、减少错误次数(表11-13)，在避暗试验中可延长潜伏期，减少错误次数(表14)。
表11.山茱萸提取物对模型大鼠Morris水迷宫游出时间(秒)的影响组别 例数 第二天 第三天 第四天正常对照 14 25.78±23.3612.82±15.22*9.50±5.73*模型 12 46.38±34.5635.36±24.17 25.75±20.20模型+山茱萸提取物 9 32.85±22.5610.52±7.04**16.55±10.983g/kgx±SD，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01表12.山茱萸提取物对大鼠模型Morris水迷宫游出距离(厘米)的影响组别 例数 第二天 第三天 第四天正常对照 14 532.51±485.17 307.46±382.49*190.06±108.84*模型 12 934.25±759.87 746.41±540.72 612.66±505.56模型+山茱萸提 9 710.44±457.20 227.11±134.18*366.78±251.87取物 3g/kgx±SD，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
表13 山茱萸提取物对模型大鼠通道式水迷宫学习记忆的影响组别学习成绩(4盲端) 记忆成绩(4盲端)游泳时间(s) 错误次数 游泳时间(s)错误次数正常 59.43±16.191.19±0.61**28.64±20.55**0.39±0.77*模型 74.41±31.022.92±1.83 66.33±28.85 1.83±2.02模型+山茱萸提取物 63.22±36.833g/kg 2.78±2.38 35.33±24.47*0.61±0.82*x±SD.与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01表14.山茱萸提取物对模型大鼠避暗实验的影响组别 例数 潜伏期(秒) 错误次数 分级正常对照 14 234.64±20.04*0.07±0.27*0.07±0.27*模型 12 169.75±99.34 0.92±1.31 1.17±1.59模型+山茱萸提取物 9 211.25±58.42 0.25±0.46 0.38±0.743g/kgx±SD，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01(二)山茱萸提取物抑制大鼠模型大脑皮层乙酰胆碱酯酶活性1.实验目的脑内乙酰胆碱酯酶(AchE)是水解神经递质乙酰胆碱的酶类。AchE抑制剂可减缓乙酰胆碱的分解代谢，提高学习记忆能力。本研究观察山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎致模型大鼠大脑皮层AchE活性的影响。
2.双侧颈总动脉结扎大鼠模型的制备SD大鼠，腹腔注射麻醉，分离双侧颈总动脉，用1号丝线永久结扎，缝合肌肉皮肤。术前预防灌胃给山茱萸提取物2周，术后灌胃给药8周。大鼠脑组织匀浆离心后，取上清液用生化方法测定AchE活性。
3.实验结果山茱萸提取物可明显抑制双侧颈总动脉结扎模型大鼠大脑皮层AchE活性(表15)，可能减缓乙酰胆碱的分解，有利于提高学习记忆功能。
表15.山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎模型大鼠大脑皮层AchE活性的影响组别 例数AchE(umol/mg蛋白)正常对照 12 0.430±0.073*模型 8 0.623±0.189山茱萸提取物 3g/kg 6 0.329±0.077**x±SD，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01(三)山茱萸提取物抑制模型大鼠大脑皮层单胺氧化酶B活性1.实验目的神经老化、脑血管、老年痴呆、血管性痴呆、帕金森病、抑郁症、神经炎症等多种神经系统疾病患者单胺氧化酶B(MAO-B)活性增高，MAO-B抑制剂可用于治疗多种神经系统疾病，本研究观察山茱萸提取物对双侧颈总动脉结扎模型大鼠神经组织MAO-B活性的影响。
2.实验方法双侧颈总动脉结扎模型及给药方法同前，大鼠脑组织匀浆离心后，取上清液用生化方法测定MAO-B活性。
3.实验结果山茱萸提取物可明显抑制双侧颈总动脉结扎致痴呆模型大鼠大脑皮层MAO-B活性(表16)。
表16.山茱萸提取物对模型大鼠大脑皮层MAO-B活性的影响组别例数MAO-B(U/mg/h)正常对照12 899.2±190.4*模型8 1214.0±230.1山茱萸提取物 3g/kg 6 851.3±263.5*x±SD，与模型组比较*P＜0.05结论山茱萸提取物在多种神经损伤及神经系统疾病动物模型上表现出明显的减少神经细胞丢失，增强神经营养因子表达，促进伤口周围神经生长相关蛋白的表达，有利于轴突的生长；减轻受损神经组织水肿，减少自由基损伤；抑制神经细胞内钙离子超载；抑制单胺氧化酶B活性，改善受损神经功能，提高M-胆碱能受体结合力，增强胆碱乙酰基转移酶活性，抑制乙酰胆碱酯酶等活性；改善学习记忆功能；对神经元的各种损伤有良好的保护作用。表明该药物组合具有防治各种因素导致的神经损伤和多种神经系统疾病的用途。
权利要求
1.一种山茱萸提取物，按山茱萸提取物的总重量计，含有莫诺苷25-50wt％、马钱素25-40wt％，二者总含量占50-90％。
2.根据权利要求1的山茱萸提取物，按山茱萸提取物的总重量计，还含有0.1-50％的选自山茱萸甙(Cornin即马鞭草甙Verbenalin)、甲基莫诺甙(methylmorroniside)、脱氢马前素(dehydrologanin)、环烯醚萜甙(iridoidglycosides)、獐牙菜甙(sweroside)、5-羟甲基糠醛、皂甙中的一种或多种成分。
3.一种山茱萸提取物的提取方法，包括以下步骤(A)水提或水提醇沉；(B)大孔吸附树脂分离；和(C)精制。
4.根据权利要求3的制备方法，所述水提包括山茱萸药材用水煎煮2-4遍，加水量3-14倍，时间1-4小时，合并煎煮液，过滤后减压浓缩，
5.根据权利要求3的制备方法，所述水提醇沉包括山茱萸药材用水煎煮2-4遍，加水量3-10倍，时间1-4小时，合并煎煮液，过滤后减压浓缩，加乙醇调至醇浓度为50％-90％，冷藏12-48小时，过滤，滤液减压回收乙醇。
6.根据权利要求3-5的任一项的制备方法，所述大孔吸附树脂分离包括以下步骤取浓缩的山茱萸水提取或水提醇沉提取液，过大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、10％-95％乙醇进行梯度洗脱，减压浓缩成浸膏。
7.根据权利要求3-6的任一项的制备方法，所述精制包括包括将大孔吸附树脂分离的流浸膏过Al2O3层析柱，用乙醇洗脱，冻干，获得精制固体产物。
8.山茱萸提取物在制备防治神经损伤或神经系统疾病的药品及保健品中的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中所述神经系统疾病选自脑血管病、脑缺氧、脑震荡、脑水肿、神经系统外伤或手术损伤、脑或脊髓肿瘤、脊髓压迫症、营养与代谢性神经脑病(如糖尿病性脑病及周围神经病等)、Wernicke脑病、癫痫、中枢神经放射性损伤、神经退行性疾病(变性病)、Alzheimer’s病、帕金森氏病、血管性痴呆、认知功能损害等。
10.根据权利要求8或9的用途，其中所述山茱萸提取物包括利用水提取，有机溶剂提取，液相色谱技术，气相色谱技术或层析技术的任何一种或多种常规提取技术所获得的提取物。
11.根据权利要求8或9的用途，其中所述山茱萸提取物为本发明提取方法所获得的提取物，按山茱萸提取物的总重量计，含有莫诺苷25-50wt％、马钱素25-40wt％，二者总含量占50-90％。
12.根据权利要求11的用途，其中所述山茱萸提取物，还含有按山茱萸提取物的总重量计，0.1-50％的选自山茱萸甙(Cornin即马鞭草甙Verbenalin)、甲基莫诺甙(methylmorroniside)、脱氢马前素(dehydrologanin)、环烯醚萜甙(iridoid glycosides)、獐牙菜甙(sweroside)、5-羟甲基糠醛、皂甙中的一种或多种成分。
13.一种治疗神经损伤或神经系统疾病的药物组合物，含有5-100wt％，优选50-90wt％山茱萸提取物，还含有0-95wt％，优选10-50wt％常规药用载体；所述山茱萸提取物中，莫诺苷含量占25-50％、马钱素含量占25-40％，二者总含量占50-90％。
14.一种防治神经损伤或神经系统疾病的的保健品组合物，含有5-80％山茱萸提取物，还含有20-95％常规食用载体和食品添加剂；所述山茱萸提取物中，莫诺苷含量占25-50％、马钱素含量占25-40％，二者总含量占50-90％。
全文摘要
本发明涉及山茱萸提取物及其提取方法、其在制备防治神经损伤或神经系统疾病的药物及保健品中的用途以及其药物组合物。经试验证明，山茱萸提取物药物组合在多种神经损伤动物模型上表现出明显的促进伤口周围神经生长相关蛋白的表达、有利于轴突的生长、减少脑内自由基损伤、神经元钙离子超载、提高M－胆碱能受体结合力、增强胆碱乙酰基转移酶活性、抑制乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶B等活性；可减少神经元的丢失、改善学习记忆功能、对神经元的各种损伤有良好的保护作用。
文档编号C07H1/08GK1510037SQ20031012183
公开日2004年7月7日 申请日期2003年12月19日 优先权日2002年12月20日
发明者李林, 张兰, 魏海峰, 赵玲, 张如意, 李 林 申请人:首都医科大学宣武医院