专利名称：利用蛤蚌毒素－生物素偶联物检测和鉴别亲蛤蚌毒素蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种麻痹性贝毒素偶联物。尤其是，本发明涉及麻痹性贝毒素偶联物在检测、表征、分离和/或纯化所感兴趣的分子，特别是亲蛤蚌毒素蛋白及其配体方面的应用，虽然其应用并不限于此。
背景技术：
所谓的“亲蛤蚌毒素蛋白(saxiphilins)”是不同种类的多肽，其是通过它们与蛤蚌毒素结合的能力来加以表征的，其中蛤蚌毒素是麻痹性贝毒素(或PSTs)之一。术语“亲蛤蚌毒素蛋白”是一个创造的术语，包括来自蛤蚌毒素的前缀“蛤蚌(saXi)”和后缀“philic”，其表示比作(或亲)蛤蚌毒素。亲蛤蚌毒素蛋白并不共享任何特定的化学结构或生理功能，亲蛤蚌毒素蛋白的生理作用似乎也不一定是结合蛤蚌毒素。例如，所谓的“牛蛙亲蛤蚌毒素蛋白”是一种分子，其与铁结合蛋白的运铁蛋白类共享50％以上的氨基酸序列同一性，因此也被认为是运铁蛋白。钠通道也结合蛤蚌毒素，因而可以被称作“亲蛤蚌毒素蛋白”。所谓的亲蛤蚌毒素蛋白已经被分离自不同的来源，如河豚的血液。这种蛋白，和钠通道一样，结合蛤蚌毒素和河豚毒素，但与钠通道不同的是，河豚蛋白是亲水的。
钠通道、河豚亲蛤蚌毒素蛋白、以及运铁蛋白各自是不同类型的亲蛤蚌毒素蛋白的成员。在三种类型的亲蛤蚌毒素蛋白之间没有可辨别的氨基酸序列同源性。然而，基于它们的物理性能可以对它们进行描述。钠通道是疏水的，因为它被固定在脂质膜中，而其他的类型是亲水的。运铁蛋白类的亲蛤蚌毒素蛋白结合蛤蚌毒素但不结合河豚毒素，而钠通道和河豚亲蛤蚌毒素蛋白结合蛤蚌毒素和河豚毒素。可以用来区别这些分子的另外的性能是结合新蛤蚌毒素(neoSTX)的能力。此外，存在许多相关的毒素，称作麻痹性贝毒素，结构上类似于蛤蚌毒素，这类分子在不同的程度上结合于蛤蚌毒素。
由摄取含有衍生自腰鞭毛虫的毒素的鱼、甲壳(贝)类动物或软体动物而引起的麻痹性贝中毒是导致严重的人类病症的世界性的问题，其经常导致死亡。该中毒是由麻痹性贝毒素(PSTs)所引起的。此外，毒性淡水藻类的菌绒可以用相同的引起麻痹性贝中毒的神经毒素污染水源。这种毒素污染的水对于人类、家畜以及野生生物会具有可怕的后果。
PSTs具有以下结构，如由通式(I)所示的
此毒素家族可以分成四个主要种类蛤蚌毒素，其是高度有效力的神经毒素并且其不被硫酸化；膝沟藻毒素(gonyautoxins)(GTXs)，其被单独硫酸化；N-磺基氨基甲酰基-13-硫酸化物C-毒素，其比STXs或GTXs具有较小的毒性；以及GC毒素，其在C13上具有酚基。
PSTs的毒性是它们结合于电位依赖性钠通道的结果，其阻断钠离子的流入，因而阻断了神经肌肉的传递。这引起了呼吸麻痹，对于此没有可行的治疗方法。在某些麻痹性贝中毒爆发的情况下，高达40％的受害者已经死亡。作为PSTs来源的腰鞭毛虫周期性地形成藻类菌绒，称作赤潮。软体动物、鱼、以及甲壳类动物，包括具有商业重要性的物种或利用水产养殖技术饲养的物种，会以这些腰鞭毛虫为食，并积聚毒素。通过粗略的检查不可能检测到单个海生动物是否含有毒素，因此存在人类偶然食用含毒素动物的风险。因此对于要食用的物种必须监测PSTs的存在，以便避免中毒的危险，从而避免社会损失和经济损失。
一种改进的用于蛤蚌毒素的测定方法披露于同系列的未决国际申请第WO 02/48671号中。该国际申请披露了一种检测和/或测量存在于样品中的麻痹性贝毒素的量的方法，其是通过将麻痹性贝毒素结合于经分离和纯化的亲蛤蚌毒素蛋白分子如分离自蜈蚣Ethmostigmus rubripes(巨型蜈蚣)的亲蛤蚌毒素蛋白的方式来进行的。因此可以希望获得来自其他来源的亲蛤蚌毒素蛋白，其对于蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白表现出相当或更好的结合性能。然而，已经证明亲蛤蚌毒素蛋白是一组难以分离和纯化的化合物，并且到现在为止仅有牛蛙亲蛤蚌毒素蛋白得到了很好的表征。因此，也需要能够标记PSTs或将它们固定在固体载体上，用于对亲蛤蚌毒素蛋白或其配体进行检测和表征。
发明内容
本发明人已经开发了一种技术，借此PST如蛤蚌毒素被生物素化，以便可以采用抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白系统，从而能够检测、表征、分离和/或纯化所感兴趣的分子，如亲蛤蚌毒素蛋白以及其配体。在分子中PST和生物素功能性的结合使得许多应用成为可能，其中涉及(链霉)抗生物素蛋白/生物素的结合，其可以和PST/亲蛤蚌毒素蛋白结合活性一起用于测定法的设计。
因此，本发明的一个方面提供了一种用于俘获亲蛤蚌毒素蛋白的方法，以便于检测、表征、分离和/或纯化所述亲蛤蚌毒素蛋白或其配体，该方法包括(1)提供一种PST偶联物，该PST偶联物包括一PST部分，该PST部分经过一连接子，并通过一亲蛤蚌毒素蛋白的非结合部位的部位结合于一生物素部分；
(2)将该PST偶联物暴露于假定含有所述亲蛤蚌毒素蛋白的样品，以便产生反应混合物，并且暴露于(链霉)抗生物素蛋白；以及(3)允许通过该PST部分结合到亲蛤蚌毒素蛋白上，并且通过该生物素部分结合到(链霉)抗生物素蛋白，以便形成俘获的PST复合物。
本发明的另一个方面提供了一种用于检测、表征、分离和/或纯化亲蛤蚌毒素蛋白的方法，包括(1)提供一种PST偶联物，该PST偶联物包括一PST部分，其经过一连接子，并通过一亲蛤蚌毒素蛋白的非结合部位的部位结合于一生物素部分；(2)将该PST偶联物暴露于假定含有亲蛤蚌毒素蛋白的样品，以便产生反应混合物，并且暴露于(链霉)抗生物素蛋白；(3)允许通过该PST部分结合到该亲蛤蚌毒素蛋白，并且通过该生物素部分结合到(链霉)抗生物素蛋白上，以便形成一种俘获的PST复合物；以及(4)通过该俘获的PST复合物对亲蛤蚌毒素蛋白进行检测、表征、分离和/或纯化。
有利的是，该生物素部分结合于一种固定的(链霉)抗生物素蛋白分子，用作一种亲和纯化介质。在该具体实施方式
中，通过结合暴露之前的(链霉)抗生物素蛋白，并通过该固定的PST偶联物暴露于该样品所产生的反应混合物中，该PST偶联物可以固定在样品上。可选替换的是，该PST偶联物可以暴露于样品中，用以同时在溶液中形成反应混合物，并且将该反应混合物暴露于被固定的链霉抗生物素蛋白，例如在亲和柱或亲和珠粒上，以便俘获已经在溶液中形成的PST复合物。
可以使用任何合适的亲和基质。合适的亲和凝胶应该具有较高的孔隙度，以便允许最多的大分子接近被固定的配体，它应该具有均匀的尺寸和刚度，用以为良好的流动特性、以及机械和化学稳定性创造条件。典型的不溶性载体材料包括纤维素、聚苯乙烯凝胶、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、多孔硅石和琼脂糖及其衍生物如琼脂糖凝胶。可以利用如本领域技术人员所了解的标准技术进行柱制备。结合了亲蛤蚌毒素蛋白的洗脱可以通过改变条件，如缓冲液的pH、离子强度、或温度来完成，使得基质对于结合了亲蛤蚌毒素蛋白的亲和力被降低和/或如本领域技术人员所熟知的通过将竞争性配体加入到洗脱缓冲液中。也可以以类似的方式使用任何适宜的珠粒载体，其包括磁珠或树枝状大分子(dendrimer)载体。有利的是，将生物素部分结合于固定的(链霉)抗生物素蛋白分子，供在PST生物传感装置中用作俘获探针。在该具体实施方式
中，通过将暴露之前的(链霉)抗生物素蛋白结合，并通过将固定的PST偶联物暴露于含有已知量的亲蛤蚌毒素蛋白和PST的样品所产生的反应混合物，可以将该PST偶联物固定在固相上。可选替换的是，可以将该PST偶联物暴露于样品中，用以同时在溶液中形成反应混合物，并且将该反应混合物暴露于固定的链霉抗生物素蛋白，例如在膜、微杆、电极或化学活化的玻璃表面上，以便俘获已经在溶液中形成的PST复合物。然后将吸附在固相上的PST-亲蛤蚌毒素蛋白复合物的量通过结合的(链霉)抗生物素蛋白可以与样品中的PST的量相关。典型的装置(platform)包括电化学、光学、表面等离子体共振、声波、微悬臂、以及离子通道转换生物传感器。
在一
具体实施例方式
中，本发明的PST偶联物可以用作探针来检测在组织、细胞中、或在其它地方的亲蛤蚌毒素蛋白及其配体的存在。结合于亲蛤蚌毒素蛋白是通过PST部分发生的，而检测是通过生物素部分以传统方式进行的。例如，可以使用(链霉)抗生物素蛋白的荧光、放射性或化学发光偶联物。其他可以应用于(链霉)抗生物素蛋白的可检测标记物包括(链霉)抗生物素蛋白的CMNB-笼形荧光素偶联物，其可以用作光中介标记物或荧光共振能量传递试剂、荧光微球体标记物、胶态金、胶乳珠、脂质体、树枝状大分子、寡核苷酸、肽核酸以及类似物。此外，酶联方法可以用于检测，因而采用的(链霉)抗生物素蛋白可以是酶偶联物如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶以及β-半乳糖苷酶的(链霉)抗生物素蛋白偶联物。所有的抗(链霉)抗生物素蛋白抗体(标记的或未标记的)也可以用于检测。
可选替换地，亲蛤蚌毒素蛋白可以结合到固相上去，例如，在膜、微杆、电极或化学活化的玻璃表面上，然后可以俘获标记的PST复合物。然后可以如本领域技术人员所熟知的那样进行竞争实验。
此外，该偶联物可以用来筛选针对PSTs的特异性抗体或结合PSTs的DNA或RNA适配子。
因此，本发明的另一方面提供了俘获PST的抗体或结合PSTs的DNA或RNA适配子的方法，包括(1)提供一种PST偶联物，该PST偶联物包括一PST部分，其经过一连接子，并通过一亲蛤蚌毒素蛋白的非结合部位的部位结合于一生物素部分；(2)将该PST偶联物暴露于假定含有所述抗体或适配子的样品中，用以产生反应混合物，并且暴露于(链霉)抗生物素蛋白中；以及
(3)允许通过该PST部分结合到抗体或适配子上，并通过该生物素部分结合到(链霉)抗生物素蛋白上，用以形成一种俘获的PST复合物。
有利地，PST是分类为蛤蚌毒素类的PSTs之一，尤其是蛤蚌毒素本身。
本发明的另一方面提供了PST偶联物，供生物素/(链霉)抗生物素蛋白系统之用，其包括经过一连接子，并通过一亲蛤蚌毒素蛋白的非结合部位的部位结合于生物素的PST。
有利的是，该连接子通过蛤蚌毒素的C12或C13或在其他PSTs中的等效位置，优选通过C13连接到PST上。键合可以是通过任何合适的连接基团并且可以通过与在PST上预先存在的官能团的反应或通过与由修饰PST所引入的基团的反应而形成。
可以采用任何合适的方式来引入合适长度的连接子，并且在延长连接子时可以利用不同的化学性质。
在本发明的特别优选的具体实施方式
中，键合是在脱甲氨酰化作用以后通过蛤蚌毒素本身的C13进行的。
在一
具体实施例方式
中，反应涉及形成酯键的形成。有利的是，dcSTX与二元羧酸(或相应的酸酐)进行反应。在本发明的特别优选的形式中，二元羧酸是琥珀酸/酸酐以便形成半琥珀酸dcSTX酯。有利的是，二元羧酸衍生物与生物素的肼衍生物进行反应用以将生物素连接到PST上。
可选替换的是，dcSTX与异氰酸酯进行反应，该异氰酸酯含有能够连接到生物素衍生物上的官能团，如异氰酸N-(对-马来酰亚胺苯基)酯，其能够与生物素的硫氢基衍生物进行反应。
应当明了，连接子可以包括可以由官能团和/或杂原子和/或环状结构中断的碳链，包括环烷基、杂环以及芳环结构，并且可选被取代。在本发明特别优选的具体实施方式
中，连接子的长度大于4个原子(或相等长度，其中环状结构存在于连接子中)以便促进亲蛤蚌毒素蛋白整个范围的结合。然而，通过延长连接子可以显著改善结合亲和力，并且长度为5个或更多原子的连接子是优选的。虽然仅出于经济原因的考虑和缺少实际合成，对连接子长度给出了上限，但连接子长度优选为5至20个原子。连接子长度更优选为8至18个原子并且连接子长度最优选为11至18个原子。虽然不希望受到理论的限制，但被认为在结合PST时某些亲蛤蚌毒素蛋白经历构象变化，其对结合反应施加空间限制，虽然这些限制的程度在亲蛤蚌毒素蛋白之间将依赖于它们的特性而有所不同。
根据本发明另外的方面，提供了包括一种PST偶联物的复合物，其通过该PST部分复合到亲蛤蚌毒素蛋白上。
根据本发明另外的方面，提供了一种包括PST偶联物的复合物，其通过生物素部分复合到(链霉)抗生物素蛋白上。
根据本发明另外的方面，提供了一种包括如上所述的PST偶联物的亲和纯化介质。
根据本发明的又一个方面，提供了一种包括如上所述的PST偶联物的PST生物传感装置。
根据本发明的又一个方面，提供了一种PST生物传感装置，其包括共价连接于一种固体载体的亲蛤蚌毒素蛋白，以及用于检测PST偶联物结合于其上的设备。
通常该PST偶联物结合于(链霉)抗生物素蛋白，其使得可以对结合进行检测，例如，通过结合后质量的变化进行检测。
如本文中所使用的，术语“麻痹性贝毒素”或PST是指具有如上所述的通式I的化合物或其变异体，由于它们能够结合于电位依赖性钠通道，其对于哺乳动物具有毒性。
如在本文中所使用的，术语“PST残基”或“PST部分”是指连接反应以后的PST残基，该连接反应包括这类反应，其中官能团被除去作为前体物(如在C13的脱甲氨酰化作用或在C12的还原作用用以产生蛤蚌毒素醇(saxitoxinol))，因此由该PST构成了那些仍保留在反应产物中的原子。
如在本文中所使用的，术语“生物素”是指化合物生物素本身及其衍生物，其保留了结合抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的能力，如脱硫生物素及其衍生物，其能够可逆地结合于(链霉)抗生物素蛋白。
如在本文中所使用的，术语“(链霉)抗生物素蛋白”是指多肽链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白本身、或链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的修饰形式(包括其片段)，其保留了结合生物素的能力。尤其是，可以设想已去糖基化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，如中性抗生物素蛋白生物素-结合蛋白(Invitrogen)和选择性硝化的抗生物素蛋白衍生物(CaptAvidin，Invitrogen)，其亲和力被显著降低，用以使生物素的可逆结合成为可能。
如在本文中所使用的，术语“生物素残基”或“生物素部分”是指连接反应以后生物素本身或其衍生物(如由上述定义的术语“生物素”所包括的)的残基。
“生物素/(链霉)抗生物素蛋白系统”或等效术语，是指任何系统，包括测定、标记反应、纯化以及合成，其涉及如本文中所定义的(链霉)抗生物素蛋白和如本文中所定义的生物素之间的结合相互作用，其中可以涉及不管什么其他部分。作为(链霉)抗生物素蛋白的一种可选替换，可以采用抗生物素抗体用来检测生物素。
如在本文中所使用的，术语“亲蛤蚌毒素蛋白”是指具有不同功能的一类蛋白的任何成员，其特点在于它们结合蛤蚌毒素的能力。该亲蛤蚌毒素蛋白包括具有这种性能的运铁蛋白，具有这种性能的钠通道和其他的疏水蛋白或膜结合蛋白，以及一组亲水蛋白，该亲水蛋白结合蛤蚌毒素和河豚毒素如河豚亲蛤蚌毒素蛋白，不管知道或不知道它们的来源、化学性质或结构，只要蛋白质发挥其通常的生理作用。鉴于本发明的各个方面，涉及先前未知的亲蛤蚌毒素蛋白的检测、分离、以及表征，应当明了，通过使用所述术语可以设想具有这种性能的已知的和先前未发现的分子。
在整个说明书和权利要求中，单词“包括”是在非排他性意义上加以使用的，除非在上下文中另有要求。
可以清楚地理解，虽然在本文中引用了许多现有技术出版物，但这种引用并不是承认任何这些文献在澳大利亚或在任何其他国家形成了本技术领域的一般公知常识的一部分。
附图简要说明
图1是在实施例1中所制备的蛤蚌毒素偶联物生物素-连接11-STX的质谱。
图2是在实施例2中所制备的蛤蚌毒素偶联物生物素-连接4-STX的质谱。
图3示出了图形形式的数据，图示说明了在亲蛤蚌毒素蛋白受体结合测定中在实施例1中所合成的化合物和放射性蛤蚌毒素之间的有效竞争，其表明了本发明的化合物结合亲蛤蚌毒素蛋白。
图4是曲线图，图示说明了在亲蛤蚌毒素蛋白受体结合测定中在实施例2中所合成的复合物和放射性蛤蚌毒素之间的有效竞争，其表明了本发明的复合物结合亲蛤蚌毒素蛋白，并且连接子的长度影响它们对于亲蛤蚌毒素蛋白的亲和力。
图5示出了通过表面等离子体共振并利用生物素-连接11-STX对于标准蛤蚌毒素的检测结果，其中生物素-连接11-STX被固定在涂布了链霉抗生物素蛋白的膜上，作为用于亲蛤蚌毒素蛋白的俘获探针。
具体实施例方式
实施例1生物素-连接11-STX的合成以及生物素-连接4-STX的合成在密封、抽真空的玻璃管中，在110℃下，通过在6M的HCl中水解4小时，将分离自甲壳类的蛤蚌毒素转化成脱甲氨酰基-蛤蚌毒素(dcSTX)。将该溶液冷冻干燥。将残留物再溶解于0.05M的乙酸中，并将该溶液通过C18固相萃取柱柱体。将dcSTX通过凝胶过滤剂-P2层析法加以纯化，并冷冻干燥。
然后将dcSTX再溶解于0.1M pH为6.8的磷酸钠缓冲液中，并通过在10℃下与两次连续加入的琥珀酸酐(比率为dcSTX∶琥珀酸酐＝1∶20)反应2小时而转化成半琥珀酸dcSTX酯，同时保持温度为10℃以及pH为5.7±0.1。然后将半琥珀酸dcSTX酯从dcSTX中分离出来并加以纯化，其中通过阴离子交换层析法并利用0.01M的磷酸钠缓冲液作为洗脱溶剂，并且通过Carbograph石墨化炭黑进行固相提取，并利用超纯水作为洗脱溶剂。
然后将半琥珀酸dcSTX酯充分冷冻干燥，并在室温下、在4摩尔当量的HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲阳离子六氟磷酸盐，O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N，N，N′，N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate)存在下与4摩尔当量的生物素-酰肼或生物素-LC-酰肼反应过夜，用以分别产生生物素-连接4-STX和生物素-连接11-STX。
然后通过亲水相互作用色谱-质谱测定法(HIC LC-MS)并利用Agilent 1100系列LC对生物素-连接4-STX和生物素-连接11-STX进行表征并纯化，其中LC是偶联于装备有电喷雾电离界面(HV毛细管+4kV，分离器(skimmer)电压40V)的Esquire 3000+四极离子阱质谱仪(Bruker Daltonics，Billerica MA，美国)。LC分离是在保持在40℃的TSK-凝胶酰胺-80柱(5μm，250mm×4.6mm的内径；TosoHass)上用2mM的甲酸铵、3.6mM的甲酸在50％的乙腈水中的等度溶液，以1mL/min的速度实现的。将纯化后的化合物进行冷冻干燥，并且储存供进一步试验用。生物素-连接11-STX的质谱(图1)表明了在m/z＝710.0±0.5Da处存在单电荷离子，并且在m/z＝355.5±0.5Da处存在双电荷离子。生物素-连接4-STX的质谱(图2)表明了在m/z＝597.0±0.5Da处存在单电荷离子，以及在m/z＝298.9±0.5Da处存在双电荷离子。
示于图3的数据证实了生物素-连接11-STX结合亲蛤蚌毒素蛋白。所采用的受体结合测定法描述于共同提出的未决国际申请第WO 02/48671号中，其内容以引用方式结合于本文中加以参考。将过滤用96孔微量滴定板用0.3％的聚1，2-亚乙基亚胺(polyethyleneimmine)预涂布1小时。将制备自生物巨型蜈蚣(Ethmostigmusrubripes，E.r.SXFN)的野生亲蛤蚌毒素蛋白在室温下并在氚标记的蛤蚌毒素[3H]STX以及几次稀释的半琥珀酸dcST酯和生物素-连接11-STX存在的情况下温育1小时。将溶液过滤，而亲蛤蚌毒素蛋白保留在过滤器上。所测得的信号相应于在过滤器上的残留放射性，并直接与结合于亲蛤蚌毒素蛋白的[3H]STX浓度相关。所示出的数据表明生物素-连接11-STX和半琥珀酸dcSTX酯均能够与[3H]STX竞争亲蛤蚌毒素蛋白的结合。通过分别试验超纯水和游离的非放射性蛤蚌毒素而得到阳性和阴性对照。
实施例2生物素-连接18-STX的合成在密封、抽真空的玻璃管中，在110℃下，通过在6M的HCl中水解4小时，将分离自甲壳类的蛤蚌毒素转化成脱甲氨酰-蛤蚌毒素(dcSTX)。将该溶液冷冻干燥。将残留物再溶解于0.05M的乙酸中，并将该溶液通过C18固相萃取柱柱体。将dcSTX通过凝胶过滤剂-P2层析法加以纯化并冷冻干燥。将残留物再溶解于无水DMF中，并在室温下与过量的PMPI(异氰酸N-(对-马来酰亚胺苯基)酯)反应过夜，用以产生PMPI-STX。通过反相HPLC-MS来纯化PMPI-STX。在室温下将NHS-LC-生物素与10mM pH为7.7的磷酸钠缓冲液中的半胱胺反应3分钟。将最终产物(生物素的硫氢基衍生物)通过C18固相提取加以纯化，并冷冻干燥过夜。将PMPI-STX再溶解于10mM pH为6.8的磷酸钠缓冲液中，并在室温下和过量的硫氢基生物素反应15分钟，从而产生生物素-连接18-STX，随后通过LC-MS来加以纯化。生物素-连接18-STX的特点在于反相色谱和亲水相互作用色谱测定均偶联于电喷雾电离-串联质谱测定(ESI-MS/MS)上。该质谱表明在m/z＝444.2Da处存在双电荷离子。
实施例3制备抗生物素蛋白.生物素-连接4-STX、链霉抗生物素蛋白.生物素-连接4-STX、抗生物素蛋白.生物素-连接11-STX、以及链霉抗生物素蛋白.生物素-连接11-STX复合物链霉抗生物素蛋白.生物素-连接4-STX和链霉抗生物素蛋白.生物素-连接11-STX将324.8pmol的生物素-连接4-STX和90.4pmol的生物素-连接11-STX各自与10mM的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)中的30μg的免疫纯链霉抗生物素蛋白混合，并在+4℃下温育2小时。在溶液中加入400μL 0.1％的甲酸，然后利用5,000截止(cutoff)微透析离心管将溶液过滤少至30μL。重复相同的步骤一次。然后加入200μL 0.1％的甲酸，并再次将溶液过滤少至30μL。用水将生物素-连接4-STX的最终容积调节到65μL(最终浓度为5μM)，而对于生物素-连接11-STX用水将最终容积调节到90μL(最终浓度为1μM)。
抗生物素蛋白.生物素-连接4-STX和抗生物素蛋白.生物素-连接11-STX将324.8pmol的生物素-连接4-STX和90.4pmol的生物素-连接11-STX各自与10mM的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)中的50μg的免疫纯抗生物素蛋白混合，并在+4℃温育2小时。在溶液中加入400μL 0.1％的甲酸，然后利用5,000截止微透析离心管将溶液过滤少至30μL。重复相同的步骤一次。然后加入200μL 0.1％的甲酸，并再次将溶液过滤少至30μL。对于生物素-连接4-STX用水将最终容积调节到65μL(最终浓度为5μM)，而对于生物素-连接11-STX用水将最终容积调节到90μL(最终浓度为1μM)。
实施例4竞争实验在加入试剂以前，将96孔GF/B微滴定过滤板(Millipore)用0.3％(w/v)的PEI预涂布至少1小时。所有反应都是在150μl的总容积中进行，其中包括20mM的MOPS-NaOH(pH为7.4)、200mM的NaCl、2nM的[3H]STX和稀释70倍的粗制亲蛤蚌毒素蛋白提取液(总蛋白质浓度为约10mg/mL)。在通过膜吸入之前允许对实验进行1小时的平衡。用200μl的水对孔冲洗两次。允许对未标记的STX、抗生物素蛋白.生物素-连接4-STX、链霉抗生物素蛋白.生物素-连接4-STX进行连续稀释直到500nM，允许对抗生物素蛋白.生物素-连接11-STX和链霉抗生物素蛋白.生物素-连接11-STX进行连续稀释直到100nM，以便与1.8nM的[3H]STX对于亲蛤蚌毒素蛋白的结合部位进行竞争(图4)。
IC50的计算利用方程粘合分数＝[STX]n/([STX]n+IC50n)，来拟合竞争曲线(图1)，其中斜坡的斜率n＝1(除了抗生物素蛋白.生物素-连接4-STX，其中n＝0.85，以及链霉抗生物素蛋白.生物素-连接4-STX，其中n＝0.7)，IC50是引起50％抑制的浓度，并且[STX]是蛤蚌毒素或蛤蚌毒素类似物的浓度。
虽然通过延长连接子至11个原子可以显著改善亲和力(IC50大约低5倍)，但是在生物素和STX之间使用大于4原子长度的连接子可以使得抗生物素蛋白-生物素-连接子-STX结合于亲蛤蚌毒素蛋白连接子。使用链霉抗生物素蛋白代替抗生物素蛋白时，连接子的长度的影响甚至更明显。事实上，众所周知，由于其结合部位的特定构象的结果，空间位阻由于链霉抗生物素蛋白而增加。在浓度高达500nM时，链霉抗生物素蛋白.生物素-连接4-STX不可能取代放射性标记的STX，这显示了对于亲蛤蚌毒素蛋白的弱亲和力(估计的IC50＞1.5μM)。与之相反，使用11个原子的连接子使得链霉抗生物素蛋白.生物素-连接11-STX可以牢固地结合于亲蛤蚌毒素蛋白，并具有和抗生物素蛋白.生物素-连接子11-STX(IC50＝4.5nM)类以的IC50。
实施例5通过表面等离子体共振检测蛤蚌毒素利用Biacore X系统，以1μL/min的流速，将140μL的生物素-连接11-STX固定在涂布了链霉抗生物素蛋白的膜上(SA芯片，Biacore，Uppsala)。通过将纯生物素-LC-酰肼结合到在同样芯片上的相同的链霉抗生物素蛋白的膜而得到参比膜。然后将在pH为7.4的生理缓冲液中的巨型蜈蚣(Ethmostigmus rubripes)的亲蛤蚌毒素蛋白的制剂注射并用缓冲液彻底洗涤。注射标准的蛤蚌毒素并通过与参比信号比较来测量亲蛤蚌毒素蛋白的绝对取代。图5上的柱状示说明通过表面等离子体共振并利用生物素-连接11-STX作为俘获探针可以检测100ppb至1ppm的蛤蚌毒素。
权利要求
1.一种用于俘获亲蛤蚌毒素蛋白的方法以便于检测、表征、分离和/或纯化所述亲蛤蚌毒素蛋白或其配体，该方法包括(1)提供一种PST偶联物，所述PST偶联物包括一PST部分，所述PST部分经过一连接子并通过一亲蛤蚌毒素蛋白的非结合部位的部位，直接或间接结合于一生物素部分；(2)将所述PST偶联物暴露于假定含有所述亲蛤蚌毒素蛋白的样品，用以产生反应混合物，并且暴露于(链霉)抗生物素蛋白；以及(3)允许通过所述PST部分结合到所述亲蛤蚌毒素蛋白上，并且通过所述生物素部分结合到(链霉)抗生物素蛋白上，以便形成一种俘获的PST复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述(链霉)抗生物素蛋白共价连接于固体载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述固体载体是一种用于亲和纯化的介质。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述固体载体适用于生物传感装置。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述(链霉)抗生物素蛋白携带一种可检测的标记物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲蛤蚌毒素蛋白共价连接于一种固体载体。
7.根据权利要求1至6中任一权项所述的方法，其中所述PST是一种蛤蚌毒素。
8.一种用于检测、表征、分离和/或纯化亲蛤蚌毒素蛋白的方法，包括(1)提供一种PST偶联物，所述PST偶联物包括PST部分，所述PST部分经过一连接子并通过一亲蛤蚌毒素蛋白的非结合部位的部位结合于一生物素部分；(2)将所述PST偶联物暴露于假定含有所述亲蛤蚌毒素蛋白的样品，用以产生反应混合物，并且暴露于(链霉)抗生物素蛋白；(3)允许通过所述PST部分结合到所述亲蛤蚌毒素蛋白上，并且通过所述生物素部分结合到(链霉)抗生物素蛋白上，以便形成一种俘获的PST复合物；以及(4)通过所述俘获的PST复合物对所述亲蛤蚌毒素蛋白进行检测、表征、分离和/或纯化。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述(链霉)抗生物素蛋白共价连接于一种固体载体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述固体载体是一种用于亲和纯化的介质。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述PST偶联物在暴露于所述样品之前固定于所述介质上。
12.根据权利要求10所述的方法，其中将所述PST偶联物暴露于所述样品中，以便形成一种通过所述介质用于俘获的PST复合物。
13.根据权利要求9至12中任一权项所述的方法，进一步包括从所述介质中洗涤所述亲蛤蚌毒素蛋白以便分离和/或纯化所述亲蛤蚌毒素蛋白的步骤。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述固体载体适用于生物传感装置。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述(链霉)抗生物素蛋白携带一种可检测的标记物。
16.根据权利要求8所述的方法，其中所述亲蛤蚌毒素蛋白共价连接于一种固体载体。
17.根据权利要求8至16中任一权项所述的方法，其中所述PST是蛤蚌毒素。
18.一种用于俘获PST的抗体或结合PST的RNA适配子的方法，包括(1)提供一种PST偶联物，所述PST偶联物包括一PST部分，所述PST部分经过一连接子并通过一亲蛤蚌毒素蛋白的非结合部位的部位结合于一生物素部分；(2)将所述PST偶联物暴露于假定含有所述抗体或适配子的样品，用以产生反应混合物，并且暴露于(链霉)抗生物素蛋白；以及(3)允许通过所述PST部分结合到所述抗体或适配子上，并且通过所述生物素部分结合到(链霉)抗生物素蛋白上，以便形成一种俘获的PST复合物。
19.一种用于生物素/(链霉)抗生物素蛋白系统的PST偶联物，包括经过一连接子并通过一亲蛤蚌毒素蛋白的非结合部位的部位结合于一生物素部分的PST部分。
20.根据权利要求19所述的PST偶联物，其中所述连接子通过蛤蚌毒素的C12或C13或在其他PSTs中的等效位置连接到所述PST部分。
21.根据权利要求20所述的PST偶联物，其中所述连接子是通过脱甲氨酰蛤蚌毒素的C13进行连接的。
22.根据权利要求19至21中任一权项所述的PST偶联物，其中所述连接子含有4个或更多的原子。
23.根据权利要求22所述的PST偶联物，其中所述连接子具有5至20个原子。
24.根据权利要求23所述的PST偶联物，其中所述连接子具有11至18个原子。
25.一种包括权利要求21至24中任一权项所述的PST偶联物的复合物，所述复合物通过所述PST部分复合到亲蛤蚌毒素蛋白上。
26.一种包括权利要求21至权利要求24中任一权项所述的PST偶联物的复合物，所述复合物通过所述生物素部分复合到(链霉)抗生物素蛋白上。
27.根据权利要求26所述的复合物，其中所述(链霉)抗生物素蛋白携带一种可检测的标记物。
28.根据权利要求26所述的复合物，其中所述(链霉)抗生物素蛋白共价连接于一种固体载体。
29.一种亲和纯化介质，包括一种根据权利要求28所述的复合物。
30.一种PST生物传感装置，包括一种根据权利要求28所述的复合物。
31.一种PST生物传感装置，包括共价连接于一种固体载体的亲蛤蚌毒素蛋白以及用于检测根据权利要求21至24中任一权项所述的PST偶联物结合于其上的设备。
32.根据权利要求31所述的PST生物传感装置，其中所述PST偶联物结合于(链霉)抗生物素蛋白。
33.根据权利要求32所述的PST生物传感装置，其中质量的增加被检测。
全文摘要
本发明涉及用于俘获亲蛤蚌毒素蛋白的方法以便于检测、表征、分离和/或纯化所述亲蛤蚌毒素蛋白或其配体，该方法包括(1)提供一种PST偶联物，该PST偶联物包括PST部分，该PST部分经过连接子并通过一亲蛤蚌毒素蛋白的非结合部位的部位直接或间接地结合于生物素部分；(2)将该PST偶联物暴露于假定含有所述亲蛤蚌毒素蛋白的样品，用以产生反应混合物，并且暴露于(链霉)抗生物素蛋白；以及(3)允许通过该PST部分结合到亲蛤蚌毒素蛋白，并且通过该生物素部分结合到(链霉)抗生物素蛋白上，用以形成俘获的PST复合物。
文档编号C07D487/14GK1774632SQ200480003991
公开日2006年5月17日 申请日期2004年2月12日 优先权日2003年2月12日
发明者塞德里克·埃米尔·弗朗索瓦·罗比约 申请人:克利夫兰生物传感器私人有限公司