专利名称：二苯基醚类化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)，该菌株已于2005年12月16日保藏在武汉中国菌种保藏中心(保藏编号是CCTCC M 205148)制备二苯基醚类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞周期抑制剂、细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
二苯基醚类化合物是水杨酸的衍生物。水杨酸是目前为止发现的第一个非蛋白类的endothelin(ET)结合抑制剂。该类化合物是一类常见的真菌代谢产物。通常认为这类化合物是蒽醌类化合物借助sulochrin和grisandienes(如geodin)得来的。已有一些文献报道，该类化合物显示了许多独特的生物活性，如能够抑制血管生成因子(VEGF)诱导的血管生成以及endothelin(ET)结合抑制作用。
该类化合物的结构特征是均具有水杨酸化合物的二苯基醚类母核，如T.Ogawa，；K.Ando，Y.Aotani，K.Shinoda，T.Tanaka，E.Tsukuda，M.Yoshida & Y.MatsudaRES-1214-1 and -2，novel non-peptidic endothelin type A receptorantagonists produced by Pestalotiopsis sp.J.Antibiotics，1995，481401～1406；H.J.Lee，J.H.Lee，B.Y.Hwang，H.S.Kim and J.J.Lee，Fungal Metabolites，AsterricAcid Derivatives Inhibit Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)-induced TubeFormation of HUVECs.J.Antibiotics，2002，55(6)552～556等曾分别报道了相关该类化合物，但尚未见该类化合物具有细胞周期抑制抗肿瘤活性的报道。本发明人研究发现曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的肿瘤细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行了研究，结果发现了新的二苯基醚类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见对该化合物的化学结构及细胞周期抑制、细胞增殖抑制及细胞凋亡诱导活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。
发明内容
本发明旨在提供一种结构独特的具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性的新化合物。
本发明的目的还在于提供一类新化合物的制备方法及其新化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
本发明首次从曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)发酵物中发现了结构新颖的二苯基醚类化合物，如式I
式I其结构特征是R1和R2为氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R3为烃基、氢或氨基。
本发明的式I化合物优选其中化合物1中R1为氢，R2为羟基，R3为甲基。
上述发明中最优选的化合物是由海洋来源的曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)的液体发酵物经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，氯仿-甲醇95∶5的洗脱物，再经SephadexLH20凝胶柱层析，100％甲醇洗脱产物再经制备HPLC分离纯化，以甲醇-水60∶40洗脱得式I化合物1。
本发明采用四氮唑盐(MTT)还原法和流式细胞术结合显微镜下检测细胞形态特征的方法，测试评价了本发明式I化合物对人白血病K562细胞的细胞增殖抑制、细胞周期抑制和细胞凋亡诱导以及对肿瘤细胞的直接杀伤等作用。实验证实，式I化合物对肿瘤细胞可通过抑制细胞周期周转、诱发癌细胞凋亡或直接的杀伤等方式，显示抑制肿瘤细胞增殖的生物学活性，从而发挥其抗肿瘤作用。
因此本发明的式I化合物可用作细胞周期抑制剂、细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。
式I化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。
式I化合物还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，式I化合物可溶于甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。
本发明的式I化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离纯化而得到；也可由上述优选化合物经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。
需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I化合物的方法可采用其它任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为生产菌用于制备式I化合物。
本发明的实施例中列举了利用曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)制备优选的本发明式I化合物的实例。
该真菌B-F-2株由从海底沉积物中分离，并经分类学研究鉴定为曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)。该菌株已于2005年12月16日保藏在中国菌种保藏中心(保藏编号CCTCC M205148)要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I化合物的方法可采用其它任何能生产二苯基醚类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可用作生产菌用于制备式I化合物。
具体实施例方式在如下的实施例中所指的化合物1的化学结构是(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位) 式I实施例1化合物1的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，取曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)适量，接种到PDA斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。
取斜面培养4天的曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)适量，接种到装有120mL培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH 7.0]的500mL锥型瓶中，在28℃、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获得曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)的种子培养液。将该种子培养液按10％接种量分别接种于装有300毫升生产培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH 7.0]的1000mL三角烧瓶中，进行为期25天24℃的静置生产发酵，获得菌丝体和发酵液。
2浸膏的获得用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓缩至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏。发酵液减压浓缩为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共22.0克。
3化合物的分离精制浸膏(22.0克)用氯仿-甲醇(9∶1)混合溶剂溶解后，加70克200-300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为12个流份。Fr-5(2克，氯仿-甲醇95∶5洗脱物)，再经Sephadex LH20凝胶柱层析，100％甲醇洗脱产物再经HPLC，以甲醇-水6∶4洗脱得化合物1(7mg)。
化合物1无色针晶，mp 159～161℃，分子式C19H20O8，HRESI-MS m/z375.1094[M-H]+，计算值375.1080.UV λmaxnm in CHCl3(logε)255(2.30)，308(2.35).IR vmaxcm-1(KBr)3322，3014，1732，1725，1606，1467，1275，1202，1082，1056，996，.1H及13C NMR数据见表1。
表1化合物1的1H(600MHz)和13C NMR(150MHz)数据
aSpectra recorded in CDCl3.
实施例2抗肿瘤活性的测试1实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物1。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。
细胞系及细胞的继代培养活性测试采用K562细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在37℃通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。
活性测试时，取对数生长期的K562细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升5×104个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，在37℃下培养24小时后，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培养4小时，移出150μL培养液后加入150μLDMSO溶解formazan，在540nm处测定其吸收度。按照IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。
流式细胞术取对数生长期的K562细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔0.5毫升接种于24孔板中，每孔加入5微升不同浓度的样品溶液，37℃下培养17小时。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，必要时进行拍照。继而将细胞分别从24孔板转移至1.5毫升Eppendorf离心管中，4℃下3000转/分离心3分钟，吸去上清液，加0.5毫升磷酸缓冲溶液(PBS)震荡洗涤一次，相同条件下离心收集细胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克柠檬酸钠和200毫克NP-40)，4℃下染色30分钟后，加入150微升PBS稀释，用流式细胞仪分析测定细胞中DNA的含量分布。细胞在细胞周期各时相中的分布利用库尔特公司产计算机软件WinCycle进行分析计算。
2实验结果化合物1的细胞增殖抑制活性化合物1对K562细胞具有增殖抑制活性，其IC50值为76.5μM。
化合物1的流式细胞术检测分析结果K562细胞经化合物1处理17小时后测得的流式细胞术结果见表2和
，如“图1是化合物1的流式细胞直方图”，化合物1当在每毫升10微克以上浓度时可将K562细胞的细胞周期显著阻滞在S期，在每毫升100微克时显示了细胞凋亡诱导活性。
表2K562细胞经化合物1处理17小时后在细胞周期各时相中的相对分布*
3结论化合物1对包括人在内的哺乳动物来源的癌细胞具有抗肿瘤作用。因此，本发明的式I化合物可作为抗肿瘤剂(即抗肿瘤药物)用于肿瘤的治疗，也可作为细胞周期抑制细胞增殖抑制的低分子生物探针用于探索生命现象本质的生命科学实验研究中。
权利要求
1.式I化合物 式I其中式I R1和R2为氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R3为烃基、氢或氨基。
2.权利要求1所述的式I化合物，其中R1为氢，R2为羟基，R3为甲基。
3.权利要求2所述式I化合物的制备方法，其特征是发酵培养曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)，获取含有上述式I化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出式I化合物。
4.权利要求3所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，氯仿-甲醇95∶5的洗脱物，再经Sephadex LH20凝胶柱层析，100％甲醇洗脱产物再经制备HPLC分离纯化，以甲醇-水60∶40洗脱得式I化合物。
5.权利要求4所述的制备方法，其中所述二苯基醚类化合物的生产菌是曲霉B-F-2(Aspergillus sp.B-F-2)。
6.权利要求1所述的式I化合物在制备细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。
7.权利要求1所述的式I化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的用途。
8.权利要求1所述的式I化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及二苯基醚类化合物及其制备方法和用途。本发明用从海洋样品中分离得到的曲霉B－F－2(Aspergillus sp.B－F－2)生产出结构新颖的上述类型的化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞周期抑制剂、细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。
文档编号C07C217/00GK1896043SQ20061006504
公开日2007年1月17日 申请日期2006年3月17日 优先权日2006年3月17日
发明者朱天骄, 刘睿, 顾谦群, 朱伟明, 刘红兵, 方玉春, 张亚鹏 申请人:中国海洋大学, 中国大洋矿产资源研究开发协会