专利名称：几丁寡糖制备方法
技术领域：
本发明涉及一种几丁寡糖，尤其是涉及一种采用发酵产酶法降解几丁质胶体制备生物活性几丁寡糖的方法。
背景技术：
几丁质是以N-乙酰-2-脱氧-D葡萄糖(GlcNAc)及少量的2-氨基和2-脱氧葡萄糖与β(1，4)糖苷键接连而成的线性高聚物，它是自然界中仅次于纤维素的天然高聚物，几丁质是几丁质酶的良好底物。因它不溶于一般溶剂中，故限制了它的应用。
由于在现有的文献中对几丁质、壳聚糖、壳寡糖和几丁寡糖等所确切指的成份各有不同，现对本专利申请中所用的各名词定义如下几丁质又称甲壳素，是2-乙酰氨基-2脱氧-D-葡萄糖以β-1，4糖苷键连接的聚合物。
壳聚糖是由几丁质部分或完全脱乙酰后所得到的壳聚糖。
几丁寡糖是指聚合度为2～10的低分子量的几丁质降解产物。
壳寡糖是指聚合度为2～10的低分子量的壳聚糖降解产物。
以上定义参见以下文献1.郑建仙，功能性低聚糖[M]，北京化学工业出版社，2004.215。
2.蒋挺大，甲壳素[M]，北京化学工业出版社，2003.1～4。
郑建仙(郑建仙，功能性低聚糖[M]，北京化学工业出版社，2004.251-266)归纳出目前制备低聚壳聚糖的方法，可大致分为化学降解法、物理降解法、酶水解法、酶合成法和基因工程法等5种。
化学降解法是采用酸或氧化剂对壳聚糖进行降解，可分为酸降解法和氧化降解法，这是目前工业上应用的主要方法，但这些方法或者是环境污染较严重、不易控制反应终点，或者是易产生副产物。
酶合成法是利用一些酶的转糖苷作用，催化聚合度较低的低聚糖合成聚合度较高的低聚糖，因此对于合成高生理活性的低聚壳聚糖有重大意义，目前处于试验阶段。
基因工程法是将生物体体内合成低聚壳聚糖过程涉及的酶基因转化到工程菌中，进行表达生产，也尚处于试验阶段。
酶解法生产在整个降解过程中无其他反应试剂加入，无其它反应副产物产生，充分体现了其优越性。目前，利用酶解法水解壳聚糖生产低聚壳聚糖的酶分为两类。一类是采用专一性酶水解甲壳素或壳聚糖，专一性酶包括壳聚糖酶、甲壳素酶和溶菌酶。另一类是采用非专一性酶水解，现已发现酶水解法中能用于壳聚糖/壳寡糖生产的各种酶有30多种(SKJAK-BRAEK，G.；ANTHONSEN，T.；SANDFORD，P.，Chitin and chitosan-sources，chemistry，biochemistry，physical properties and aplications，Carbohydrate Research，1995，268143-149，)。
申请号为01126457.8的发明专利申请提供一种低壳糖和壳寡糖的工业化生产方法，采用复合酶对壳聚糖进行降解而获得低壳糖和壳寡糖。
申请号为03112619.7的发明专利申请提供一种甲壳低聚糖的制备方法及应用，以非专一性酶组成复合酶制备甲壳低聚糖，但还有待开发廉价、高效的酶及合适的反应系统以实现大规模工业化生产。
壳聚糖的专一性水解酶，对壳聚糖表现出极大的亲和性，酶用量小，水解中溶液的粘度下降速率也相当大。因此用专一性酶对壳聚糖进行水解速率较快，效果较好。酶法降解壳聚糖条件温和，降解过程及降解产物分子量分布都易于控制，酶法水解中高聚合度的低聚糖的得率比酸水解高，另外，酶法生产过程不对环境造成污染，是比较理想的几丁寡糖/壳寡糖生产方法。壳聚糖酶和甲壳素酶还不能大量生产，因此应用受到限制。采用专一性水解酶酶解法制备几丁寡糖的方法至今未见报道。
申请人在申请号为200410005111.8的发明专利申请中提供一种高效几丁质降解菌豚鼠气单胞菌及其产生的几丁质酶系，其中培养物豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeQ2)已于2003年12月14日由申请人保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM203097。
发明内容
本发明的目的在于针对国内外几丁寡糖生产中遇到的普遍难点------高活力酶的获得和几丁质胶体大量制备这两大瓶颈，提供一种工艺路线简单，可有效抑制活性几丁寡糖在酶作用下进一步降解，降解酶可重复使用，酶的使用效率高，可根据需要获得不同聚合度的产品，污染少，分离效率高，有利于规模化工业生产的几丁寡糖制备方法。
为此本发明采用的技术方案是采用本申请人从海洋中筛选出的一株能被诱导产生高活性几丁酶系的菌株豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeQ2)，又用基因操作技术获得可不经诱导而分泌出高活性的酶系，将酶法降解几丁质胶体与膜分离相结合，使该酶系在水解几丁质胶体后获得可溶性的几丁寡糖。
本发明的具体步骤为1)菌株培养和酶液制备将菌株豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeQ2)在培养基中培养；然后将培养得到的发酵菌液离心分离，得到发酵液上清；再用超滤法去除酶液中残余菌体和其他固形物，分离得到酶液备用。所述的培养基的组份及其按百分比含量为甘油 1％～10％酵母提取物0.5％～5％玉米浆1％～5％豆饼粉1％～10％NaCl 0.5％～3％余为水。
培养温度为25～37℃，通气量为5～200l/min，培养时间为10～40h。
2)制备几丁质胶体(1)、将几丁质与无机酸混合，制成几丁质酸溶液，按重量与体积配比，几丁质(Kg)∶无机酸(L)＝1∶(8～20)，优选几丁质(Kg)∶无机酸(L)＝1∶10；所述的浓无机酸为磷酸、硫酸或盐酸等中的一种，磷酸浓度为60％～85％，硫酸浓度为60％～98％，盐酸浓度为20％～35％；(2)、将几丁质酸溶液滴加到水或碱溶液中，使其胶体沉淀，成为胶状液；所述的碱液选自氨水、钾碱、钠碱等中的一种；所述的钾碱选自氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾等中的一种，所述的钠碱选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠等中的一种；(3)、将几丁胶与含几丁寡聚糖的无机盐肥料分离；(4)、将分离后的几丁胶用水洗涤，即得几丁质胶体。
3)酶解反应在酶反应罐中，将几丁质胶体混悬于浓度为20mM的缓冲液中，配制成终浓度为几丁质干重0.1％～10％的几丁质胶体溶液，蒸汽灭菌后冷却至室温，将步骤1)得到的几丁质酶液无菌传输至灭过菌的酶反应罐体内的几丁质胶体溶液中，几丁质酶液相对几丁质胶体的用量为1～10mU/ml，反应温度为10～60℃，pH为3.0～8.9，保温，得几丁寡糖酶解液。
4)一级膜分离待步骤3)所获得的几丁寡糖酶解液中几丁质胶体的固相成份含量降低至0.05％～2％时，将几丁寡糖酶解液从酶反应罐泵入微滤膜分离装置，压力控制范围为0.15～0.8MPa，温度控制范围为10～50℃，除去酶解液中的悬浮物、几丁质胶体和部分有机物等物质，未透过的部分返回酶反应罐继续参与酶解，透过液为活性几丁寡糖滤液，经管道进入二级膜分离料罐。
5)二级膜分离二级膜分离选用超滤膜分离装置，以压力为推动力，利用高分子薄膜的选择渗透性，在常温下依靠一定的压差和流速，使小于膜孔径的活性几丁寡糖等低分子量物质透过膜，而使高分子量的蛋白质、氨基酸、多肽和酶等组分物质被有效截留，操作压力控制范围为0.3～1.5MPa，温度控制范围为10～50℃，分离分子量范围为2,000～20,000Da。透过超滤膜的含活性几丁寡糖透过液进入三级膜分离料罐进行产品的进一步分离纯化。
6)三级膜分离三级膜分离采用纳滤膜分离装置，膜分离的截留分子量为800～2,000Da，操作压力控制范围为0.5～5.0MPa，pH为2.5～7.5，将截留的浓缩液喷雾干燥后得到活性几丁寡糖及低聚糖混合物产品，透过液进入四级膜分离料罐。
7)四级膜分离四级膜分离采用纳滤膜分离装置，分离的截留分子量为100～300Da，操作压力控制范围为0.5～5.0MPa，pH为2.5～7.5，将截留的浓缩液喷雾干燥后得到活性几丁寡糖产品，透过液主要含单糖、二糖和水，可作为副产品。
在步骤1)中，培养得到的发酵菌液可用连续流离心机进行离心分离。
在步骤2)第(2)项中，在几丁质酸溶液与碱液混合中和过程中最好在有超声波下进行，即将几丁质酸溶液滴加到超声波清洗槽中。
在步骤2)第(3)项中，所述的分离可选用过滤、压滤或离心等方法，在过滤、压滤或离心过程中，最好加温，温度为20～60℃。或利用中和时的放热现象及时处理也可不必人为加温。用温水20～60℃使附在几丁胶体中的盐溶解，也使洗涤下来的含几丁寡糖的无机肥料浓度更高，减少运输这些肥料的成本。
在步骤3)中，所述的缓冲液为pH 5.8～8.0的磷酸氢二钠--磷酸二氢钠缓冲液(以下简称PB)，pH为3.6～5.8的乙酸—乙酸钠缓冲液，pH为3.0～6.6的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液或pH为7.1～8.9的Tris-盐酸缓冲液。
在步骤4)中，所述的微滤膜选自管式膜、Ultra-flow平板膜或中空纤维膜等，微滤膜分离装置以管式膜效果最佳，微滤膜截留悬浮微粒物质的分离截留分子量为10,000～750,000Da。
在步骤7)中，所述的透过液可经过第五级膜反渗透浓缩得含几丁单糖、二糖的副产品。
所述的微滤膜、超滤膜、纳滤膜可为高分子材料膜，或无机材料膜，或高分子材料膜和无机材料膜的共混膜或复合膜；所述的高分子材料膜，或无机材料膜，或高分子材料膜和无机材料膜的共混膜或复合膜具有成膜性，均可以选自有机氟材料膜，有机氯材料膜，聚砜膜，聚芳砚膜及其改性材料膜等等。例如聚酯膜、聚碳酸酯纤维素膜、聚酰胺膜、聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚氯乙烯膜、聚砜醋酸纤维素膜、芳香聚酰胺膜、聚呱嗪类膜、磺化聚芳醚胺膜、纤维素膜、改性纤维素膜、聚芳醚酮膜或聚甲基化聚砜聚醚酮膜，或者聚酯膜、聚碳酸酯纤维素膜、聚酰胺膜、聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚氯乙烯膜、聚砜醋酸纤维素膜、芳香聚酰胺膜、聚呱嗪类膜、磺化聚芳醚胺膜、纤维素膜、改性纤维素膜、聚芳醚酮膜和聚甲基化聚砜聚醚酮膜的共混物膜或复合物膜。无机材料膜可以是多孔性陶瓷膜、多孔性玻璃膜或多孔性金属膜等。
本发明的酶解反应与膜分离设备是互相耦联的，操作方式可以是连续操作，也可以是间歇操作；原料补加方式可以是间歇补料，也可以是连续补料。间歇补料是在膜分离器排出一定量后，向酶反应罐中滴加原料液，但补加速率须与滤出速率相等。用酶反应罐与各种滤器(包括超滤、纳滤等)连通在一起成为一个半封闭的循环系统，使酶降解反应与几丁寡糖的分离同时进行，提高生产率。这个过程也就是膜循环酶反应器。简单讲，就是将酶反应罐中酶解液通过膜分离器返回酶反应罐，同时取出产物的过程。在这过程中产物随着透过液离开酶反应罐，底料可连续补充。
本发明针对国内外几丁寡糖生产中遇到的普遍难点------高活力专一性几丁质酶的获得、低成本几丁质胶体大量制备这两大瓶颈，采用申请人从海洋中筛选出的一株能被诱导产生高活性几丁酶系的菌株豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeQ2)，又用基因操作技术获得可不经诱导而分泌出高活性的酶系，将酶法降解几丁质胶体与膜分离相结合，使该酶系在水解几丁质胶体后获得可溶性的几丁寡糖。其工艺路线简单，可有效抑制活性几丁寡糖在酶作用下进一步降解，降解酶可连续重复使用，酶的使用效率高，可根据需要通过选择不同孔径的膜和调控操作条件获得不同聚合度的几丁寡糖产品。同时制备过程简捷，减少了分离过程引起的污染，提高了分离效率。过程可连续进行，有利于实现工业化生产。
具体实施例方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
实施例11、菌株培养和高活力酶液制备将豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeQ2)菌种由斜面取一环接入装有100ml培养液的500ml摇瓶中，35℃振荡培养24h即为摇瓶种子液，摇瓶种子培养基为含蛋白胨1％、酵母提取物5％、玉米浆5％，NaCl 1％以5％接种量接入含甘油1％、酵母提取物5％、玉米浆5％、NaCl 1％和豆饼粉7％的培养基的10L种子发酵罐中，于35℃发酵24h，得种子培养液。在100L发酵罐中加入培养基溶液，其中含甘油1％，酵母提取物2.5％、玉米浆2.5％、NaCl 1％、豆饼粉5％，于121℃灭菌20min，加入种子培养液10L，在35℃，转速为100～300r/min，通气量为100l/min的条件下，培养24h，得含几丁质酶系的发酵菌液，经离心机离心，分离收集上清酶液，超滤后得到无菌酶液，经测定酶活力之后，按10mU/ml的比例加入酶反应罐中进行几丁寡糖的制备。
2.制备几丁胶体取10Kg市售几丁质(几丁质，以细颗粒为佳，≥10目)，溶于100L工业用浓磷酸(75％)内，常温下，经12h的搅拌、溶解，生成几丁质磷酸溶液。在搅拌下逐渐将几丁质磷酸溶液加入到220L的工业用浓氨水(～21％)内，使中和至pH6.5～6。中和后几丁质以胶状析出，趁热(温度为20～60℃)压滤(或离心)使之与浓的磷酸铵盐分开。所得的几丁胶用热水洗出残留在胶内的盐，此洗涤液加入到压滤后的磷酸铵溶液内，即为含有可溶的几丁寡糖的磷酸铵肥料。此胶可作为几丁酶(系)的底物，应在湿态下保存。
3、几丁寡糖生产(1)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合于20mM PB缓冲液(pH为6.0)中，总体积为150L，最终浓度为2％，蒸汽灭菌。将10mU/ml的几丁质酶加入到反应体系中，在40℃搅拌，待固相成份降低至1.5％时开始启动一级膜分离。
(2)一级膜分离采用膜面积7m2的中空纤维膜滤器，控制压力0.50MPa，在20℃下运行。膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为10,000Da，被截留的料液返回酶反应罐继续反应，分离至原液料液体积为1/2时，加纯水顶洗至截留料液检测无几丁寡糖组分即停止。透过液转入二级膜分离装置的料罐备用。
(3)启动二级膜分离装置，采用卷式平板膜，膜的切割分子量为5000Da，控制压力0.3MPa，在20℃下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级纳滤膜分离装置，截留料液返回二级膜分离装置的料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加纯水顶洗至截留部分料液无几丁寡糖组分检出即终止。将含活性几丁寡糖透过液转入三级膜分离装置的料罐备用。
(4)启动三级膜分离装置，用2寸的巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为1000Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力0.8MPa，pH6.0，截留料液返回三级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。收集三级膜分离装置的料罐中浓缩截留的活性几丁寡糖及低聚糖混合物，再喷雾干燥。将含活性低分子量几丁寡糖透过液转入四级膜分离装置的料罐备用。
(5)启动四级膜分离装置，用巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为300Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力0.8MPa，pH6.0，截留料液返回四级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集四级膜分离装置料罐中浓缩截留的活性低分子量几丁寡糖，喷雾干燥后得到所需的几丁寡糖产品。
透过液主要含单糖、二糖和水，转入其它料罐作为副产品。
实施例21、菌株培养和高活力酶液制备将豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeQ2)菌种由斜面取一环接入装有100ml培养液的500ml摇瓶中，35℃振荡培养24h即为摇瓶种子液，摇瓶种子培养基为含蛋白胨1％、酵母提取物5％、玉米浆5％，NaCl 1％以5％接种量接入含甘油1％、酵母提取物5％、玉米浆5％、NaCl 1％和豆饼粉7％的培养基的10L种子发酵罐中，于35℃发酵24h，得种子培养液。在100L发酵罐中加入培养基溶液，其中含甘油1.5％，酵母提取物0.5％、玉米浆1％、NaCl 0.5％、豆饼粉10％，于121℃灭菌20min，加入种子培养液10L，在25℃，300r/min，通气量为5l/min的条件下，培养40h，得含几丁质酶系的发酵菌液，经离心机离心，分离收集上清酶液，超滤后得到无菌酶液，经测定酶活力之后，按1mU/ml的比例加入酶反应罐中进行几丁寡糖的制备。
2.制备几丁质胶体取10Kg市售几丁质(几丁质，以细颗粒为佳，≥10目)，溶于80L工业用浓磷酸(85％)内，常温下，经12h的搅拌、溶解，生成几丁质磷酸溶液。取工业用浓氨水200L加入于200L纯水内，再把几丁质溶液逐渐加入稀释后的氨水内，中和成pH为5～6后，析出的几丁质胶用过滤式离心机(即篮式离心机，或管式连续流离心机)分离几丁胶。收集含几丁寡聚糖的磷酸铵溶液为肥料/农药。几丁胶用温度为20～60℃热水洗出残留在胶内的磷酸铵盐，即为产品几丁胶。
3、几丁寡糖生产(1)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合于20mM柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液中(pH为3.0)中，总体积为150L，最终浓度为0.1％，蒸汽灭菌。将1mU/ml的几丁质酶加入到反应体系中，在60℃搅拌，固相成份降低至0.05％时启动一级膜分离装置。
(2)一级膜分离采用膜面积1m2的管式膜，控制压力0.15MPa，在10℃下运行。膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为100,000Da，被截留的料液返回酶反应罐继续反应，分离至原液料液体积为1/2时，加纯水顶洗至截留料液检测无几丁寡糖组分即停止。透过液转入二级膜分离装置的料罐备用。
(3)启动二级膜分离装置，采用巻式平板膜，膜的切割分子量为2000Da，控制压力0.6MPa，在10℃下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级纳滤膜分离装置，截留料液返回二级膜分离装置的料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加纯水顶洗至截留部分料液无几丁寡糖组分检出即终止。将含活性几丁寡糖透过液转入三级膜分离装置的料罐备用。
(4)启动三级膜分离装置，用2寸的巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为800Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力0.5MPa，pH2.5，截留料液返回三级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集三级膜分离装置的料罐中浓缩截留的活性几丁寡糖及低聚糖混合物，再喷雾干燥。
将含活性低分子量几丁寡糖透过液转入四级膜分离装置的料罐备用。
(5)启动四级膜分离装置，用巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为100Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力0.5MPa，pH2.5，截留料液返回四级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集四级膜分离装置料罐中浓缩截留的活性低分子量几丁寡糖，喷雾干燥后得到所需的几丁寡糖产品。
透过液主要含单糖、二糖和水，转入其它料罐作为副产品。
实施例31、菌株培养和高活力酶液制备将豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeQ2 )菌种由斜面取一环接入装有100ml培养液的500ml摇瓶中，37℃振荡培养20h即为摇瓶种子液，摇瓶种子培养基为含蛋白胨1％、酵母提取物5％、玉米浆5％，NaCl 1％以5％接种量接入含甘油4％、酵母提取物5％、玉米浆3％、NaCl 1％和豆饼粉5％的培养基的10L种子发酵罐中，于37℃发酵20h，得种子培养液。在100L发酵罐中加入培养基溶液，其中含甘油4％，酵母提取物3％、玉米浆2％、NaCl 0.5％、豆饼粉3％，于121℃灭菌20min，加入种子培养液10L，在37℃，200r/min，通气量为150l/min的条件下，培养20h，得含几丁质酶系的发酵菌液，经离心机离心，分离收集上清酶液，超滤后得到无菌酶液，经测定酶活力之后，按4mU/ml的比例加入酶反应罐中进行几丁寡糖的制备。
2.制备几丁质胶体取10Kg市售几丁质(几丁质，以细颗粒为佳，≥10目)，溶于150L工业用浓磷酸内(60％)，在保温90℃的PE罐中，搅拌2h，使几丁质溶解于磷酸中，取工业用的氢氧化钾配制成5.5M浓度的溶液200L。在搅拌下缓慢地把几丁质溶液加入碱液内使之中和至pH约为6.5。析出的几丁质胶体经分离后得几丁胶；再用少量的热水洗涤此胶，即为产品(几丁胶)，而分离出的溶液为含几丁寡糖的钾、磷肥料。此肥料可与氮肥配合应用。
3、几丁寡糖生产(1)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合于20mMTris-盐酸缓冲液(pH为8.9)中，总体积为150L，最终浓度为4％，蒸汽灭菌。将4mU/ml的几丁质酶加入到反应体系中，在10℃搅拌，固相成份降低至0.5％时启动一级膜分离装置。
(2)一级膜分离采用膜面积1m2的管式膜，控制压力0.3MPa，在30℃下运行。膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为200,000Da，被截留的料液返回酶反应罐继续反应，分离至原液料液体积为1/2时，加纯水顶洗至截留料液检测无几丁寡糖组分即停止。透过液转入二级膜分离装置的料罐备用。
(3)启动二级膜分离装置，采用巻式平板膜，膜的切割分子量为4000Da，控制压力1.0MPa，在30℃下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级纳滤膜分离装置，截留料液返回二级膜分离装置的料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加纯水顶洗至截留部分料液无几丁寡糖组分检出即终止。将含活性几丁寡糖透过液转入三级膜分离装置的料罐备用。
(4)启动三级膜分离装置，用2寸的巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为1500Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力1.5MPa，pH4.0，截留料液返回三级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集三级膜分离装置的料罐中浓缩截留的活性几丁寡糖及低聚糖混合物，再喷雾干燥。
将含活性低分子量几丁寡糖透过液转入四级膜分离装置的料罐备用。
(5)启动四级膜分离装置，用巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为300Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力3MPa，pH4.0，截留料液返回四级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集四级膜分离装置料罐中浓缩截留的活性低分子量几丁寡糖，喷雾干燥后得到所需的几丁寡糖产品。
透过液主要含单糖、二糖和水，转入其它料罐作为副产品。
实施例4
1、菌株培养和高活力酶液制备将豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeQ2)菌种由斜面取一环接入装有100ml培养液的500ml摇瓶中，28℃振荡培养24h即为摇瓶种子液，摇瓶种子培养基为含蛋白胨1％、酵母提取物5％、玉米浆5％，NaCl 1％以5％接种量接入含甘油4％、酵母提取物5％、玉米浆3％、NaCl 1％和豆饼粉5％的培养基的10L种子发酵罐中，于28℃发酵24h，得种子培养液。在100L发酵罐中加入培养基溶液，其中含甘油10％，酵母提取物1.5％、玉米浆3％、NaCl 2％、豆饼粉1％，于121℃灭菌20min，加入种子培养液10L，在28℃，100r/min，通气量为200l/min的条件下，培养30h，得含几丁质酶系的发酵菌液，经离心机离心，分离收集上清酶液，超滤后得到无菌酶液，经测定酶活力之后，按5mU/ml的比例加入酶反应罐中进行几丁寡糖的制备。
2.制备几丁质胶体与实施例1类似，其区别在于无机酸采用80L的浓硫酸(98％)，常温下，经12h的搅拌、溶解，生成几丁质硫酸溶液。几丁质溶液与氢氧化钠溶液混合中和过程中最好在超声波下进行，即将几丁质酸溶液滴加到超声波清洗槽中，且在压滤时加温至40～60℃，pH为6.5。
3、几丁寡糖生产(1)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合于乙酸-乙酸钠缓冲液(pH为4.0)中，总体积为150L，最终浓度为5％，蒸汽灭菌。将5mU/ml的几丁质酶加入到反应体系中，在20℃搅拌，固相成份降低至1％时启动一级膜分离装置。
(2)一级膜分离采用膜面积1m2的Ultra-flow平板膜，控制压力0.6MPa，在40℃下运行。膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为400,000Da，被截留的料液返回酶反应罐继续反应，分离至原液料液体积为1/2时，加纯水顶洗至截留料液检测无几丁寡糖组分即停止。透过液转入二级膜分离装置的料罐备用。
(3)启动二级膜分离装置，采用巻式平板膜，膜的切割分子量为8000Da，控制压力1.5MPa，在40℃下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级纳滤膜分离装置，截留料液返回二级膜分离装置的料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加纯水顶洗至截留部分料液无几丁寡糖组分检出即终止。将含活性几丁寡糖透过液转入三级膜分离装置的料罐备用。
(4)启动三级膜分离装置，用2寸的巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为2000Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力3MPa，pH5.0，截留料液返回三级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集三级膜分离装置的料罐中浓缩截留的活性几丁寡糖及低聚糖混合物，再喷雾干燥。
将含活性低分子量几丁寡糖透过液转入四级膜分离装置的料罐备用。
(5)启动四级膜分离装置，用巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为300Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力4MPa，pH5.0，截留料液返回四级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集四级膜分离装置料罐中浓缩截留的活性低分子量几丁寡糖，喷雾干燥后得到所需的几丁寡糖产品。
透过液主要含单糖、二糖和水，转入其它料罐作为副产品。
实施例51、菌株培养和高活力酶液制备将豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeQ2)菌种由斜面取一环接入装有100ml培养液的500ml摇瓶中，30℃振荡培养24h即为摇瓶种子液，摇瓶种子培养基为含蛋白胨1％、酵母提取物5％、玉米浆5％，NaCl 1％以5％接种量接入含甘油4％、酵母提取物5％、玉米浆3％、NaCl 1％和豆饼粉5％的培养基的10L种子发酵罐中，于30℃发酵24h，得种子培养液。在100L发酵罐中加入培养基溶液，其中含甘油6％，酵母提取物5％、玉米浆4％、NaCl 3％、豆饼粉2％，于121℃灭菌20min，加入种子培养液10L，在30℃，250r/min，通气量为30l/min的条件下，培养24h，得含几丁质酶系的发酵菌液，经离心机离心，分离收集上清酶液，超滤后得到无菌酶液，经测定酶活力之后，按6mU/ml的比例加入酶反应罐中进行几丁寡糖的制备。
2.制备几丁质胶体与实施例2类似，其区别在于无机酸采用180L的硫酸(60％)，在保温60℃的PE罐中，搅拌4h，使几丁质溶解于硫酸中，几丁质溶液与浓碳酸钾溶液混合中和过程中在超声波下进行，即将几丁质酸溶液滴加到超声波清洗槽中，中和成pH为5～6，压滤，余下步骤同实施例2。
3、几丁寡糖生产(1)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合于乙酸—乙酸钠缓冲液(pH为5.0)中，总体积为150L，最终浓度为10％，蒸汽灭菌。将6mU/ml的几丁质酶加入到反应体系中，在30℃搅拌，固相成份降低至2％时启动一级膜分离装置。
(2)一级膜分离采用膜面积1m2的Ultra-flow平板膜，控制压力0.8MPa，在50℃下运行。膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为750,000Da，被截留的料液返回酶反应罐继续反应，分离至原液料液体积为1/2时，加纯水顶洗至截留料液检测无几丁寡糖组分即停止。透过液转入二级膜分离装置的料罐备用。
(3)启动二级膜分离装置，采用巻式平板膜，膜的切割分子量为20,000Da，控制压力1.5MPa，在50℃下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级纳滤膜分离装置，截留料液返回二级膜分离装置的料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加纯水顶洗至截留部分料液无几丁寡糖组分检出即终止。将含活性几丁寡糖透过液转入三级膜分离装置的料罐备用。
(4)启动三级膜分离装置，用2寸的巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为2000Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力5MPa，pH7.5，截留料液返回三级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集三级膜分离装置的料罐中浓缩截留的活性几丁寡糖及低聚糖混合物，再喷雾干燥。
将含活性低分子量几丁寡糖透过液转入四级膜分离装置的料罐备用。
(5)启动四级膜分离装置，用巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为200Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力5MPa，pH7.5，截留料液返回四级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集四级膜分离装置料罐中浓缩截留的活性低分子量几丁寡糖，喷雾干燥后得到所需的几丁寡糖产品。
透过液主要含单糖、二糖和水，转入其它料罐作为副产品。
实施例61、菌株培养和高活力酶液制备将豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeQ2)菌种由斜面取一环接入装有100ml培养液的500ml摇瓶中，37℃振荡培养24h即为摇瓶种子液，摇瓶种子培养基为含蛋白胨1％、酵母提取物5％、玉米浆5％，NaCl 1％以5％接种量接入含甘油4％、酵母提取物5％、玉米浆3％、NaCl 1％和豆饼粉5％的培养基的10L种子发酵罐中，于37℃发酵24h，得种子培养液。在100L发酵罐中加入培养基溶液，其中含甘油8％，酵母提取物4％、玉米浆5％、NaCl 1％、豆饼粉4％，于121℃灭菌20min，加入种子培养液10L，在37℃，300r/min，通气量为50l/min的条件下，培养10h，得含几丁质酶系的发酵菌液，经离心机离心，分离收集上清酶液，超滤后得到无菌酶液，经测定酶活力之后，按8mU/ml的比例加入酶反应罐中进行几丁寡糖的制备。
2.制备几丁质胶体与实施例2类似，其区别在于无机酸采用180L的硫酸(60％)，在保温60℃的PE罐中，搅拌4h，使几丁质溶解于硫酸中，几丁质溶液与浓碳酸钾溶液混合中和过程中在超声波下进行，即将几丁质酸溶液滴加到超声波清洗槽中，中和成pH为5～6，压滤，余下步骤同实施例2。
3、几丁寡糖生产(1)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合于PB缓冲液(pH为7.0)中，总体积为150L，最终浓度为8％，蒸汽灭菌。将8mU/ml的几丁质酶加入到反应体系中，在30℃搅拌，固相成份降低至1％时启动一级膜分离装置。
(2)一级膜分离采用膜面积1m2的管式膜，控制压力0.8MPa，在20℃下运行。膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为600,000Da，被截留的料液返回酶反应罐继续反应，分离至原液料液体积为1/2时，加纯水顶洗至截留料液检测无几丁寡糖组分即停止。透过液转入二级膜分离装置的料罐备用。
(3)启动二级膜分离装置，采用巻式平板膜，膜的切割分子量为15,000Da，控制压力0.8MPa，在20℃下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级纳滤膜分离装置，截留料液返回二级膜分离装置的料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加纯水顶洗至截留部分料液无几丁寡糖组分检出即终止。将含活性几丁寡糖透过液转入三级膜分离装置的料罐备用。
(4)启动三级膜分离装置，用2寸的巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为1000Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力4MPa，pH7.5，截留料液返回三级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集三级膜分离装置的料罐中浓缩截留的活性几丁寡糖及低聚糖混合物，再喷雾干燥。
将含活性低分子量几丁寡糖透过液转入四级膜分离装置的料罐备用。
(5)启动四级膜分离装置，用巻式平板膜纳滤器，膜的切割分子量为300Da，膜的截留率为80％～95％，膜面积1.7m2，控制压力1.5MPa，pH7.5，截留料液返回四级膜分离装置的料罐进入循环分离，至循环料液无几丁单糖组分检出时终止。
收集四级膜分离装置料罐中浓缩截留的活性低分子量几丁寡糖，喷雾干燥后得到所需的几丁寡糖产品。
透过液主要含单糖、二糖和水，转入其它料罐作为副产品。
实施例7
与实施例1类似，其区别在于(1)酶液制备方法同实施例1。
(2)制备几丁质胶体与实施例2类似，其区别在于无机酸采用120L的浓盐酸(含盐酸量≥35％)，在保温40℃的PE罐中，搅拌2h，使几丁质溶解于盐酸中，几丁质溶液与浓碳酸氢钾溶液混合中和过程可放在超声波清洗器的槽中进行，余下步骤同实施例2。
(3)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合在柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液(pH为6.0)中，总体积为150L，最终浓度为1％，几丁质酶的加量至1mU/ml，在40℃下反应，得几丁寡糖酶解液，待此几丁寡糖酶解液中几丁寡糖中固相成份降低至0.5％时，启动一级膜分离装置，微滤膜选自中空纤维膜滤器，膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为20,000Da。
实施例8与实施例1类似，其区别在于(1)酶液制备方法同实施例2。
(2)制备几丁质胶体与实施例2类似，其区别在于无机酸采用200L的盐酸(含盐酸量≥20％)，在保温60℃的PE罐中，搅拌4h，使几丁质溶解于盐酸中，几丁质溶液与浓氨水混合中和过程中可在超声波下进行，余下步骤同实施例2。
(3)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合在乙酸—乙酸钠缓冲液(pH为5.0)中，总体积为150L，最终浓度为10％，几丁质酶的加量至5mU/ml，在35℃下反应，得几丁寡糖酶解液，待此几丁寡糖酶解液中几丁寡糖中固相成份降低至1％时，启动一级膜分离装置，微滤膜选自管式膜，膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为100,000Da。
实施例9与实施例1类似，其区别在于(1)酶液制备方法同实施例3。
(2)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合在Tris-盐酸缓冲液(pH8.9)中，总体积为150L，最终浓度为10％，几丁质酶的加量至10mU/ml，在40℃下反应，得几丁寡糖酶解液，待此几丁寡糖酶解液中几丁寡糖中固相成份降低至0.5％时，启动一级膜分离装置，微滤膜选自Ultra-flow平板膜，膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为200,000Da。
实施例10与实施例1类似，其区别在于(1)酶液制备方法同实施例4。
(2)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合在Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)中，总体积为150L，最终浓度为5％，几丁质酶的加量至10mU/ml，在10℃下反应，得几丁寡糖酶解液，待此几丁寡糖酶解液中几丁寡糖中固相成份降低至0.5％时，启动一级膜分离装置，微滤膜选自中空纤维膜，膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为750,000Da。
实施例11与实施例1类似，其区别在于(1)酶液制备方法同实施例5。
(2)在酶反应罐中，将几丁质胶体混合在Tris-盐酸缓冲液(pH8.5)中，总体积为150L，最终浓度为10％，几丁质酶的加量至10mU/ml，在60℃下反应，得几丁寡糖酶解液，待此几丁寡糖酶解液中几丁寡糖中固相成份降低至1％时，启动一级膜分离装置，微滤膜选自中空纤维膜，膜材料其截留悬浮微粒物质的粒子粒径范围为600,000Da。
权利要求
1.几丁寡糖制备方法，其特征在于其步骤为1)菌株培养和酶液制备将菌株豚鼠气单胞菌在培养基中培养；然后将培养得到的发酵菌液离心分离，得到发酵液上清，再用超滤法去除酶液中残余菌体和其他固形物，分离得到酶液备用；2)制备几丁质胶体(1)、将几丁质与无机酸混合，制成几丁质酸溶液，按重量与体积配比，几丁质∶无机酸＝1∶8～20，其中几丁质的单位为Kg，无机酸的单位为L；(2)、将几丁质酸溶液滴加到水或碱溶液中，使其胶体沉淀，成为胶状液；(3)、将几丁胶与含几丁寡聚糖的无机盐肥料分离；(4)、将分离后的几丁胶用水洗涤，即得几丁质胶体；3)酶解反应在酶反应罐中，将几丁质胶体混悬于浓度为20mM的缓冲液中，配制成终浓度为几丁质干重0.1％～10％的几丁质胶体溶液，蒸汽灭菌后冷却至室温，将步骤1)得到的几丁质酶液无菌传输至灭过菌的酶反应罐体内的几丁质胶体溶液中，保温，得几丁寡糖酶解液；4)一级膜分离待步骤3)所获得的几丁寡糖酶解液中几丁质胶体的固相成份含量降低至0.05％～2％时，将几丁寡糖酶解液从酶反应罐泵入微滤膜分离装置，压力控制范围为0.15～0.8MPa，温度控制范围为10～50℃，除去酶解液中的悬浮物、几丁质胶体和部分有机物，未透过的部分返回酶反应罐继续参与酶解，透过液为活性几丁寡糖滤液，经管道进入二级膜分离料罐；5)二级膜分离二级膜分离选用超滤膜分离装置，以压力为推动力，操作压力控制范围为0.3～1.5MPa，温度控制范围为10～50℃，分离分子量范围为2,000～20,000Da，透过超滤膜的含活性几丁寡糖透过液进入三级膜分离料罐进行产品的进一步分离纯化；6)三级膜分离三级膜分离采用纳滤膜分离装置，膜分离的截留分子量为800～2,000Da，操作压力控制范围为0.5～5.0MPa，pH为2.5～7.5，将截留的浓缩液喷雾干燥后得到活性几丁寡糖及低聚糖混合物产品，透过液进入四级膜分离料罐；7)四级膜分离四级膜分离采用纳滤膜分离装置，分离的截留分子量为100～300Da，操作压力控制范围为0.5～5.0MPa，pH为2.5～7.5，将截留的浓缩液喷雾干燥后得到活性几丁寡糖产品，透过液主要含单糖、二糖和水，作为副产品。
2.如权利要求1所述的几丁寡糖制备方法，其特征在于在步骤1)中，培养得到的发酵菌液用连续流离心机进行离心分离，所述的培养基的组份及其按百分比含量为甘油 1％～10％酵母提取物 0.5％～5％玉米浆 1％～5％豆饼粉 1％～10％NaCl 0.5～3％余为水；培养温度为25～37℃，通气量为5～200l/min，培养时间为10～40h。
3.如权利要求1所述的几丁寡糖制备方法，其特征在于在步骤2)的第(1)项中、将几丁质与浓无机酸混合，制成几丁质酸溶液，按重量与体积配比，几丁质∶无机酸＝1∶10；所述的无机酸为磷酸、硫酸或盐酸中的一种，磷酸浓度为60％～85％，硫酸浓度为60％～98％，盐酸浓度为20％～35％，其中几丁质的单位为Kg，无机酸的单位为L。
4.如权利要求1所述的几丁寡糖制备方法，其特征在于在步骤2)第(2)项中，在几丁质酸溶液与碱液混合中和过程中在有超声波下进行，即将几丁质酸溶液滴加到超声波清洗槽中；所述的碱液选自氨水、钾碱、钠碱中的一种；所述的钾碱选自氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种，所述的钠碱选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种。
5.如权利要求1所述的几丁寡糖制备方法，其特征在于在步骤2)第(3)项中，所述的分离选用过滤、压滤或离心方法，在过滤、压滤或离心过程中加温，温度为20～60℃；或利用中和时的放热现象及时处理，用温水20～60℃使附在几丁胶体中的盐溶解。
6.如权利要求1所述的几丁寡糖制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述的缓冲液为pH5.8～8.0的磷酸氢二钠--磷酸二氢钠缓冲液，pH为3.6～5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH为3.0～6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或pH为7.1～8.9的Tris-盐酸缓冲液；几丁质酶液相对几丁质胶体的用量为1～10mU/ml，反应温度为10～60℃，pH为3.0～8.9。
7.如权利要求1所述的几丁寡糖制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述的微滤膜选自管式膜、Ultra-flow平板膜或中空纤维膜，微滤膜截留悬浮微粒物质的分离截留分子量为10,000～750,000Da。
8.如权利要求1所述的几丁寡糖制备方法，其特征在于在步骤7)中，所述的透过液经过第五级膜反渗透浓缩得含几丁单糖、二糖的副产品。
9.如权利要求1所述的几丁寡糖制备方法，其特征在于所述的微滤膜、超滤膜、纳滤膜为高分子材料膜，或无机材料膜，或高分子材料膜和无机材料膜的共混膜或复合膜；所述的高分子材料膜，或无机材料膜，或高分子材料膜和无机材料膜的共混膜或复合膜具有成膜性，选自有机氟材料膜，有机氯材料膜，聚砜膜，聚芳砚膜及其改性材料膜。
10.如权利要求1或9所述的几丁寡糖制备方法，其特征在于所述的高分子材料膜，或无机材料膜，或高分子材料膜和无机材料膜的共混膜或复合膜具有成膜性，选自聚酯膜、聚碳酸酯纤维素膜、聚酰胺膜、聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚氯乙烯膜、聚砜醋酸纤维素膜、芳香聚酰胺膜、聚呱嗪类膜、磺化聚芳醚胺膜、纤维素膜、改性纤维素膜、聚芳醚酮膜或聚甲基化聚砜聚醚酮膜，或者聚酯膜、聚碳酸酯纤维素膜、聚酰胺膜、聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚氯乙烯膜、聚砜醋酸纤维素膜、芳香聚酰胺膜、聚呱嗪类膜、磺化聚芳醚胺膜、纤维素膜、改性纤维素膜、聚芳醚酮膜和聚甲基化聚砜聚醚酮膜的共混物膜或复合物膜；无机材料膜为多孔性陶瓷膜、多孔性玻璃膜或多孔性金属膜。
全文摘要
几丁寡糖制备方法，涉及一种几丁寡糖，尤其是涉及一种采用发酵产酶法降解几丁质胶体制备生物活性几丁寡糖的方法。提供一种工艺路线简单，可有效抑制活性几丁寡糖在酶作用下进一步降解，降解酶可重复使用，酶的使用效率高，可根据需要获得不同聚合度的产品，污染少，分离效率高，可规模化工业生产的几丁寡糖制备方法。将菌株豚鼠气单胞菌培养得发酵菌液离心分离，得发酵液上清，分离得酶液；再制备几丁质胶体；在酶反应罐中，将几丁质胶体混悬于缓冲液中，配制成几丁质胶体溶液，将几丁质酶液无菌传输至灭过菌的酶反应罐体内的几丁质胶体溶液中，得几丁寡糖酶解液；再经一、二、三、四级膜分离将截留的浓缩液喷雾干燥后得到活性几丁寡糖产品。
文档编号C07H3/00GK1847267SQ20061008009
公开日2006年10月18日 申请日期2006年5月10日 优先权日2006年5月10日
发明者乔兴忠, 李永娴, 王风平, 肖湘 申请人:国家海洋局第三海洋研究所