免疫原性组合物及其使用方法

专利名称：免疫原性组合物及其使用方法
免疫原性组合物及其使用方法 相关申请的交叉引用本申请要求2005年10月25日提交的、申请号为60/729,828的美国临 时申请的优先权，其全文通过引用合并于此。技术领域[1]本发明涉及免疫原性组合物和使用该免疫原性组合物诱导脊椎动 物产生免疫应答的方法。
背景技术：
[2]人们发现，对于某些疾病，机体先与免疫性感染制剂接触后，可抵 抗以后的感染，自此之后疫苗一直在医学领域占据重要地位。多年来人们 一直使用疫苗使个体产生抗病毒、细菌、真菌和寄生虫等特定病原体感染 的免疫性，而且还使用疫苗刺激机体产生抗癌细胞上抗原或抗病理原纤维 形成的免疫应答的能力。疫苗可以通过口服、静脉内、皮下、透皮、舌下、 肌内和鼻内等各种给药方式使用。[3]早期疫苗制备依赖于仍然保留免疫原性的"活"或"死"的病原体。 随着对特定病原体结构和功能及适应性免疫机制的深入了解，设计更安全 可靠、靶向性更强的疫苗已成为可能。例如，目前使用的抗B型肝炎病毒 疫苗仅仅只使用一部分病毒表面抗原接种，而不必使用整个病原体。使用 这类疫苗不仅能降低副作用，而且能避免产生针对抗原的无益免疫应答， 这种应答是非保护性应答，也就是说，不产生长期免疫力。另外，使用重 组DNA技术和基因疗法，还研制出DNA疫苗，在有利情况下使机体产生 保护性免疫应答。[4]使用蛋白质抗原(如病毒蛋白或肿瘤特异性抗原)或来源于蛋白质 抗原的免疫原性多肽制备疫苗，是一种新型策略，因其毒性低、应用广泛 而有巨大的临床潜力。但是，使用蛋白质疫苗获得成功的临床病例极为有 限，部分原因在于该疫苗给药困难。所以，有必要开发制备工程多肽抗原 的更有效方法。[5]目前正在评估合成肽疫苗抗细菌、寄生虫和病毒感染的保护功效。 细菌表位疫苗包括抗霍乱和志贺氏菌感染的疫苗。疟疾合成疫苗已经通过I期和n期临床试验。流感和B型肝炎代表两类病毒系统，合成肽疫苗在这两类系统中的前景尤其看好，而且最近抗人免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)的合 成疫苗的开发也备受关注。[6]疫苗中蛋白质或肽抗原刺激产生的有利的免疫应答包括体液介导 的和细胞介导的免疫。体液部分涉及经刺激产生抗体的B细胞，而细胞介 导的部分包括T淋巴细胞。细胞毒性T-淋巴细胞(CTLs)在细胞介导的免 疫系统中发挥重要作用，可以使被病毒或细菌感染的细胞裂解。尤其是 CTLs具有细胞表面受体，能识别与MHC-I类或II类分子有关的外来肽。[7]所以，需要开发适于将多肽等复合抗原释放到脊椎动物内的方法和 专用释放平台。免疫原性多肽的工程技术和由免疫原性多肽制成的结构体 有望满足这一需求。最好是，所得免疫原性决定簇的提呈将活化适应性免 疫系统的至少某些组成，也就是说，抗原提呈将诱导产生足以抗击特定抗 原的免疫应答，而无论该免疫应答是由抗体、细胞毒性T细胞、辅助性T 细胞、天然杀伤细胞或巨噬体，还是由它们的某些组合介导。发明内容[8]在一实施例中，免疫原性组合物包括含两层或两层以上聚电解质的 多层膜，其中，相邻层含有相反电荷的聚电解质，第一层聚电解质包括抗 原性多肽，该抗原性多肽含有与一个或多个抗原决定区共价连接的一个或 多个表面吸附区。所述抗原性多肽和一个或多个表面吸附区具有相同的极 性。所述一个或多个表面吸附区含有一个或多个氨基酸序列基元(motif)，该基元由5-15个氨基酸构成，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。所述一个或多个抗原决定区含有3到约250个氨基酸残基。所述抗原性多肽不 是均聚体，有至少15个氨基酸长，pH4-10时水溶解度大于50pg/mL。另 外，第二层聚电解质包括分子量大于1,000、每分子至少5个电荷且电荷与 第一层多肽相反的聚阳离子材料或聚阴离子材料。[9]在另一实施例中，诱导脊椎动物产生免疫应答的方法包含给所述脊 椎动物给用上述免疫原性组合物。


[10]图1是带相反电荷多肽的组装体示意图。[11]图2是包含一个抗原决定区(3)和两个表面吸附区(1、 2)的抗 原性多肽， 一个表面吸附区(1)与所述抗原决定区(3)的N-端连接，另 一个表面吸附区(2)与所述抗原决定区(3)的C-端连接。[12]图3是利用水相合成法、固相合成法或多肽重组法独立制备的LBL 抗原性多肽的三个不同区。[13]图4是将抗原性多肽(4)的三个区连在一起的过程。[14]图5是一个含两个表面吸附区(120和130)和一个抗原决定区 (110)的抗原性多肽例。
具体实施方式
[15]本文中，"层"是指厚度增加体，例如用吸附步骤使模板上方厚度 增加以形成膜。"多层"是指多个厚度增加体。"聚电解质多层膜"是指包 含一个或多个由聚电解质构成的厚度增加体的膜。多层膜的各层在沉积后 可能不是离散的层。事实上，尤其是厚度增加体界面间的物质可能会有明 显混合。[16]"聚电解质"包括分子量大于1,000、每分子含至少5个电荷的聚阳离子或聚阴离子材料。合适的聚阳离子材料例如包括聚胺。聚胺例如包 括多肽、聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N,N-二甲基氨基丙烯酸 酯)、聚(N,N-二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N,N-二甲 基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N,N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚 胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(N,N,N-三甲基氨基丙烯酸酯氯化 物)、聚(甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵)、几丁质和包含前述至少一种 或几种聚阳离子材料的组合。合适的聚阴离子材料例如包括多肽、核酸、 海藻酸、卡拉胶、帚叉藻胶、果胶、黄原胶、透明质酸、肝素、硫酸肝素、 硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸葡聚糖、聚(甲基)丙烯酸、氧化纤维素、 羧甲基纤维素、酸性多糖和交联羧甲基纤维素、含有侧链羧基的合成聚合 物和共聚物，以及包含前述至少一种聚阴离子材料的组合。[17]"氨基酸"是指多肽的结构单位。本文中，"氨基酸"包括20种 常见的天然存在的L-氨基酸、其它所有天然氨基酸、所有非天然氨基酸和 所有类氨基酸，如类肽(peptoid)。[18]"天然存在的氨基酸"是指20种常见的天然L-氨基酸，即甘氨酸、 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫 氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨 酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸。[19]"非天然氨基酸"是指除20种常见天然L-氨基酸之外的氨基酸。 非天然氨基酸可以是L-型或D-型。[20]"类肽"或N-取代的甘氨酸是指相应氨基酸单体的类似物，与相 应氨基酸的侧链相同，但侧链是与氨基的氮原子相连，而不是与该残基的a 碳原子相连。所以，聚类肽单体间的化学键不是肽键，可用来限制蛋白质 水解。[21]"氨基酸序列"和"序列"是指至少两个氨基酸长的多肽链的连续长度。"残基"是指多聚体或寡聚体中的氨基酸；它是可形成多聚体的 氨基酸单体的残基。多肽合成涉及脱水反应，也就是说，肽链上每增加一 个氨基酸会失去一个水分子。"氨基酸序列基元"是指含有n个残基的连续氨基酸序列，n是 5-15。在一实施例中，氨基酸序列基元中每个残基的净电荷数量大于或等于 0.4。在另一实施例中，氨基酸序列基元中每个残基的净电荷数量大于或等 于0.5。本文中，净电荷数量是指净电荷的绝对值，也就是说，所述净电荷 可以是正电荷，也可以是负电荷。本文中，"肽"和"多肽"均指通过相邻氨基酸的oi-氨基和a-羧基 之间形成的肽键而相互连接的一系列氨基酸，它们可以含或不含糖基化、 侧链氧化或磷酸化等修饰，不过前提是含有这些修饰或缺少这些修饰不会 其破坏免疫原性。本文中"肽"是指肽和多肽或蛋白质。"设计出的多肽"(以下简称"设计多肽")是指含有一个或多个 氨基酸序列基元的多肽，该多肽有至少15个氨基酸长，pH7.0时，相同极 性的带电残基和与其极性相反的残基的数量差与多肽中残基总数的比值大 于或等于0.4。换句话说，多肽中每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。
在一实施例中，pH7.0时，相同极性的带电残基和与其极性相反的残基的数 量差与多肽中残基总数的比值大于或等于0.5。换句话说，多肽中每个残基 的净电荷数量大于或等于0.5。虽然多肽长度没有绝对上限，但总的来说， 适于ELBL沉积的设计多肽的实际长度上限为1,000个残基。"—级结构"是指多肽链中连续的线性氨基酸序列，"二级结构" 是指多肽链中基本上规则的结构类型，通过非共价相互作用(通常为氢键) 保持稳定。二级结构例如包括a-螺旋、(3-折叠和(3-转角。"多肽多层膜"是指含有上述一条或多条设计多肽的膜。例如， 多肽多层膜包括含设计多肽的第一层和含带有极性与该设计多肽相反的净 电荷的聚电解质的第二层。例如，如果第一层的净电荷为负电荷，则第二层的净电荷为正电荷。第二层含有另一种设计多肽或另一种聚电解质。"基底"是指一种固体材料，具有适于吸附水溶液中聚电解质的 表面。基底表面基本上可以是平面、球形、棒状等任何形状。基底表面可 以是规则或不规则的面。基底可以是晶体，可以是生物活性分子，其尺寸 从纳米级到宏观级大小不等。另外，基底中也可以含一些微小的亚粒子。 基底可以由有机材料、无机材料、生物活性材料或这些材料的组合制成。
基底例如包括但不限于硅晶片；CaC03微粒或三聚氰胺甲醛微粒等带电胶 体粒子；红细胞、肝细胞、细菌细胞或酵母细胞等生物细胞；聚苯乙烯或 苯乙烯共聚物等有机聚合物点阵结构体(polymer lattice);脂质体；细胞器 和病毒。在一实施例中，基底是人工起搏器、人工耳蜗或支架等医疗器械。如果在膜形成期间或形成之后，将基底分离，或用其它方式去除， 这时候将基底称为"模板"(用于膜的形成)。模板粒子可以用合适的溶剂 溶解或加热去除。举例来说，如果使用部分交联的三聚氰胺甲醛模板粒子， 可以用较为温和的化学方法，如使用DMSO或改变pH值来溶解模板。模 板粒子溶解后，留下由聚电解质层交替构成的中空多层外壳。"微胶囊"是指中空外壳形式或包覆核心的涂层形式的聚电解质 膜。所述核心含有各种不同的胶囊填充剂，如蛋白质、药物或其组合。"生物活性分子"是指有生物学效应的分子、大分子或大分子组 装体。利用合适的试验，并经每单位重量或每分子标准化后，可以测出生 物活性分子的特定生物学效应。可以将生物活性分子装入胶囊、固定在后 面或者置于聚电解质膜内。生物活性分子例如包括但不限于药物、药物晶 体、蛋白质、蛋白质功能片段、复合蛋白、脂蛋白、寡肽、寡核苷酸、核 酸、核糖体、活性治疗剂、磷脂、多糖、脂多糖。本文中，"生物活性分子" 进一步包括有生物活性的结构组成，如功能性膜碎片、膜结构组成、病毒、 病原体、细胞、细胞团和细胞器。能被封装在胶囊内或固定在多肽膜后面 的蛋白质例如有血红球蛋白；葡萄糖氧化酶、脲酶和溶菌酶等酶；纤维连 接蛋白、层粘蛋白、玻连蛋白和胶原蛋白等胞外基质蛋白；以及抗体。能 被封装在胶囊内或固定在多肽膜后面的细胞例如包括移植胰岛细胞、真核细胞、细菌细胞、植物细胞和酵母细胞。"生物相容性"是指经口服、局部给药、透皮给药、皮下注射、 肌内注射、吸入、植入或静脉内注射后不会对健康产生实质性的不良影响。 例如，生物相容性膜包括那些与免疫系统(如人的免疫系统)接触后不会 引起实质性免疫应答的膜。"免疫应答"是指细胞或体液免疫系统对体内任何部位出现的物
质所产生的反应。免疫应答可以表现为很多方式，如血流中识别某种抗原
的抗体数量增加。抗体是由B细胞分泌的蛋白质，而抗原是诱导产生免疫 应答的物体。人体通过增加血流或其它部位的抗体数量来抵抗感染和抑制 再感染。"抗原"是指进入易受感染的脊椎动物组织内，诱导机体产生免 疫应答(如产生特异性抗体分子)的外来物质，含有一个或多个表位。抗 原可以是单纯的一种物质或者是不同物质的混合物(包括细胞或细胞片 段)。抗原包括合适的抗原决定簇、自身抗原(auto-antigen)、自体抗原 (self-antigen)、交叉反应抗原、变应原、耐受原、半抗原、免疫原或它们 的一部分及其组合，这些术语可以互换使用。抗原一般具有高分子量，通 常为多肽。 一般把能诱导机体产生强免疫应答的抗原称为强免疫原性抗原。 抗原上可与互补抗体特异性结合的位点称为表位或抗原决定簇。"抗原性"是指一种组合物产生特异性抗体或产生细胞介导的免 疫应答的能力。本文中，"表位"和"抗原决定簇"可互换使用，是指被抗体识别 的抗原(如蛋白质或设计肽)的结构或序列。表位通常位于蛋白质表面。"连 续表位"是指表位中包括的若干氨基酸残基相互连接、而不是在折叠蛋白 中碰巧接触或处于有限的空间区域内。"构象表位"所含的氨基酸残基来源 于蛋白质线性序列的不同部分，它们在蛋白质三维结构中相互接触。抗原 和抗体间要发生有效的相互作用，必须要有容易结合的表位。所以，表位 或抗原决定簇存在于抗原的天然细胞环境中，或者仅在变性时暴露出来，其天然形式可以是细胞质型(可溶)、膜相关型或分泌型。表位的数量、位 置和大小取决于抗体制备过程中的抗原数量。本文中，"疫苗组合物"是指向哺乳动物给用该组合物后能诱导机 体产生免疫应答，并能保护被免疫生物，抵抗以后由免疫剂或免疫性交叉 反应剂引发的挑战。与未经疫苗接种的生物体相比，这种保护作用可表现 为完全或部分减轻症状或感染。免疫性交叉反应剂例如可以是，其亚肽已 被用作免疫原的整个蛋白质(如葡糖基转移酶)。或者，免疫性交叉反应剂 可以是能被免疫剂诱导产生的抗体全部或部分识别的不同蛋白质。本文中，"免疫原性组合物"是要包括那些经给用生物体后诱导机
体产生免疫应答的组合物，这些组合物可以或者不可以保护被免疫哺乳动 物抵抗以后由免疫剂引起的挑战。在一实施例中，免疫原性组合物是疫苗 组合物。本发明包括含聚电解质多层膜的疫苗组合物和免疫原性组合物， 该多层膜含有带电荷的抗原性多肽，其具有一个或多个抗原决定簇。聚电解质多层膜是由带相反电荷的聚电解质交替层构成的薄膜 (如几纳米到几毫米厚)。在合适的基底上进行层叠组装，可以形成这类膜。 静电层叠自组装工艺(ELBL)中，静电是聚电解质结合的物理基础。由于 连续层层积时膜表面电荷密度符号逆转，所以可能形成积层膜。带相反电 荷聚离子的ELBL沉积的一般原理如图1所示。鉴于ELBL膜工艺的一般 原理和相对简单的特点，可以将许多不同类型的聚电解质沉积到许多不同 类型的表面上。多肽多层膜属于聚电解质多层膜，包含至少一个含带电多 肽的层。多肽多层膜的主要优点是环保。ELBL膜还可以用于胶囊制备工艺。 多肽膜和微胶囊的应用例如包括纳米反应器、生物感应器、人工细胞和药 物释放载体。美国专利(公开号2005/0069950)中阐述了适用静电层叠沉积的 多肽的设计原理，这里通过引用将其并入本文。简单地说，设计中主要考 虑的因素是多肽长度和电荷。静电是设计所要考虑的最重要因素，这是因为它是ELBL的基础。多肽如果没有合适的电荷特性，则基本上不溶于 pH4-10的水溶液，而且在用ELBL制造多层膜时，使用起来较为费劲。其 它考虑因素包括多肽的物理结构、多肽所形成的膜的物理稳定性，以及膜 与构成膜的多肽的生物相容性和生物活性。如上所述，设计多肽是指包含一个或多个氨基酸序列基元的多肽， 其中，所述多肽有至少15个氨基酸长，pH7.0时，每个残基的净电荷数量 大于或等于0.4。"氨基酸序列基元"是指含n个残基的连续氨基酸序列， 其中n是5-15。 pH7.0时，天然的正电荷氨基酸(碱性)是Arg、 His禾n Lys， 天然的负电荷氨基酸(酸性)是Glu和Asp。可以使用含相反电荷氨基酸残 基的氨基酸基元，只要整个电荷比例满足以上规定的标准即可。在一实施 例中，设计多肽不是均聚体。在一典型实施例中，氨基酸序列基元含7个氨基酸。长7个氨基 酸的基元中含4个带电氨基酸是比较合适的最小值，因为少个4个电荷， 肽的可溶性和ELBL的可控性会降低。而且，关于生物相容性，基因组数 据中述及的各氨基酸序列基元都比7个氨基酸长，足以构成连续表位，但 并没有长到基本上与蛋白质表面和其内部的残基相对应。所以，氮基酸序 列基元的电荷和长度有助于确保基因组数据中提到的序列基元有可能出现 在该序列基元所来源的折叠蛋白表面上。相反，非常短的序列基元在机体 看来有可能是随机序列，或者是非特定"自体"的随机序列，从而会诱导 免疫应答。某些情况下，关于氨基酸序列基元和设计多肽的设计考虑因素是 其形成二级结构尤其是a-螺旋或(3-折叠的倾向。某些实施例中，最好能控 制水介质中设计多肽形成二级结构的可能性，如最大程度降低这种可能性， 以便尽可能地控制薄膜层形成工艺。首先，最好是序列基元较短，约5-15 个氨基酸，因为长基元在溶液中更有可能形成稳定的三维结构。第二，设 计多肽中共价连接连续氨基酸序列基元的接头，如甘氨酸或脯氨酸残基会 降低多肽在水溶液中形成二级结构的倾向。例如，甘氨酸的a-螺旋和(3-折 叠倾向性非常低，这非常不利于甘氨酸和其相邻氨基酸在水溶液中形成规则二级结构。第三，选择(X-螺旋总体倾向性小于7.5、 |3-折叠总体倾向性小
于8的氨基酸序列基元，将设计多肽本身的(x-螺旋和(3-折叠倾向性降到最 低。"总体"倾向性是指基元中所有氨基酸的a-螺旋或P-折叠的倾向性总和。 ci-螺旋和/或P-折叠的总体倾向性稍高的氨基酸序列基元适用于ELBL，尤 其是由Gly或Pro等接头连接时更是如此。某些应用中，如果作为薄膜制造 中特定设计特征，多肽形成二级结构的倾向可以较高。用Chou和Fasman 法(参见P. Chou and G. Fasman Biochemistry 13:211 (1974)，全文通过引用 合并于此)可以计算出所有20种天然存在的氨基酸的二级结构倾向性。多肽ELBL膜的稳定性控制是要考虑的另一设计因素。离子键、 氢键、范德华力和憎水作用都有助于多层膜的稳定性。另外，同一层内或 相邻层中多肽的含巯基氨基酸之间形成的共价二硫键可以增加结构强度。 含巯基的氨基酸包括半胱氨酸和同型半胱氨酸。另外，可以往P-氨基酸中 加入巯基，如D,L-P-氨基-(3-环己基丙酸、D，L-3-氨基丁酸或5-(甲基硫代)-3-氨基戊酸。使用含巯基的氨基酸，通过改变氧化电位，可以将多肽多层膜 各层"锁住"(结合在一起)和"脱离"。另外，设计多肽中序列基元中加 入含巯基的氨基酸后，由于分子内形成二硫键，所以薄膜制造中可以使用 较短的肽。可以使用下面叙述的方法从基元文库中选取包括含巯基氨基酸 的氨基酸序列基元，或者可以从头设计。在一实施例中，将无论是化学合成还是宿主体内产生的含巯基的 设计多肽，在用于防止二硫键过早形成的还原剂存在条件下，采用ELBL 法进行组装。然后除去还原剂，再加入氧化剂。氧化剂使巯基之间形成二 硫键，从而将层内多肽"锁"在一起，而且存在硫醇基团时还会将各层之 间的多肽"锁"在一起。合适的还原剂包括二硫苏糖醇("DTT")、 2-巯基 乙醇(2-ME)、还原谷胱甘肽、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)和前 述一种以上化学物质的组合。适合的氧化剂包括氧化谷胱甘肽、叔丁基过 氧化氢(t-BHP)、硫柳汞、肼、5,5'-二硫代-双-(2-硝基-安息香酸)(DTNB)、 4，4'-二硫代二吡啶、溴酸钠、过氧化氢、连四硫酸钠、porphyrindin、邻碘 苯甲酸钠，及前述一种以上化学物质的组合。[47]生物相容性是生物药学应用中所考虑的一个因素。这类应用中， 首先利用作为多聚体设计基础的基因组或蛋白质信息，得到我们需要的"免 疫惰性"多肽。如果制造产物或包有涂层的物体会与循环血接触，则这一 方法特别有用。由于氨基酸序列基元的极性较高，所以它们通常位于其来 源蛋白质天然折叠结构的表面。"表面"是指折叠蛋白质中与溶剂接触或因 水的微粒性而难以单独靠近溶剂的那一部分。已鉴定出的血液蛋白氨基酸 序列基元在血液中总是能与细胞有效接触。所以，来源于血液折叠蛋白质 的多肽有免疫原性的可能性低于随机选择的序列。设计多肽一般都有生物 相容性，但免疫应答或其它任何类型的生物应答所达到的程度可能完全取 决于序列基元的特定细节。可以用很多方法使膜、涂层或微胶囊具备生物活性。例如，膜所
含的设计多肽可以含有功能域。或者，具有多肽薄膜涂层或装在多肽薄膜 胶囊内的其它生物活性分子也可能有生物活性。在一实施例中，所述模板 包含蛋白晶体等生物活性分子。这里提到的功能域是指蛋白质中一段有特定生物功能(如结合磷 酸化酪氨酸)的独立耐热区域。多结构域蛋白质中可能存在多功能域，例 如，张力蛋白中就包含磷酸酪氨酸结合域和蛋白酪氨酸磷酸酶域。多层膜 内加入的设计多肽中包含功能域，可以使该膜具备与特异性配体结合、体 内靶定、生物感应和生物催化等所需功能。生物活性分子可以是蛋白质，蛋白质功能片段，非设计多肽构成 部分的蛋白质功能片段、复合蛋白、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖体、活 性治疗剂、磷脂、多糖、脂多糖、功能性膜碎片、膜结构组成、病毒、病 原体、细胞、细胞团、细胞器、脂、碳水化合物、药物或抗菌剂。生物活 性分子可以是规则排列的结晶型或无定形。所述蛋白质可以是酶或抗体。 所述基底可以包含这类生物活性分子。在一实施例中，在相反电荷的多肽 层沉积前，基底表面含有生物活性分子。在另一实施例中，基底是含生物 活性分子的晶体。在一实施例中，氨基酸序列基元采用从头设计。在另一实施例中，氨基酸序列基元选自特定生物的基因组或蛋白质组信息，如人的基因组。
例如，可以利用补体C3 (gi|68766)或乳转铁蛋白(gi|4505043)的一级结 构，从人血液蛋白中检索氨基酸序列基元。鉴定多肽内第一个氨基酸序列基元的方法包含选择多肽的起始 氨基酸残基；检查多肽内含该起始氨基酸残基和后面n-l个(即n减O 氨基酸残基的氨基酸序列中存在的正电荷和负电荷，其中n是5-15;如果 pH7.0时，这5-15个氨基酸残基侧链的净电荷大于或等于0.4xn，则将这些
氨基酸残基确定为氨基酸序列基元；或者，如果pH7.0时，这5-15个氨基 酸残基侧链的净电荷小于0.4xn，则舍弃该序列。下面叙述在一实施例中从氨基酸序列数据中检索含n个氨基酸、 仅包含中性或负电荷氨基酸的负电荷氨基酸序列基元的方法。第一步，从 蛋白质序列中选择起始氨基酸残基。第二步，检査起始氨基酸残基和后面n
-l个氨基酸残基中是否含有精氨酸、组氨酸或赖氨酸(中性pH时，这三 种天然存在的氨基酸可能带有正电荷)，其中n是5-15。第三步，如果发现 这n个氨基酸残基中有一个或多个精氨酸、组氨酸或赖氨酸，则从第二个 氨基酸残基重新开始上述步骤。但如果这n个氨基酸中不含精氨酸、组氨 酸或赖氨酸，则检查并确定n个氨基酸残基中谷氨酸(Glu)和/或天冬氨酸
(Asp)(中性pH时这两个氨基酸带负电荷)出现的数量。第四步，如果这 n个残基中有至少0.4xn个Glu和/或Asp，则将该序列归类为负电荷氨基酸 序列基元。但如果发现负电荷氨基酸数量少于0.4xn个，则舍弃从第一个氨 基酸残基开始的序列，然后再重新开始以上步骤，例如，立即从与第一个 氨基酸残基相邻的第二个氨基酸残基开始以上步骤。将基元归好类后，再 从第二个氨基酸残基开始，重复以上步骤。鉴定正电荷序列基元的方法大致是从蛋白序列数据中检索仅含中 性或正电荷氨基酸、n个氨基酸长而且中性pH时这些氨基酸残基侧链的净 电荷数量大于或等于0.4xn的氨基酸序列。鉴定含n个氨基酸、允许同时存在正电荷和负电荷氨基酸残基的 负电荷氨基酸序列基元或正电荷氨基酸序列基元的方法也差不多类似。例如，鉴定含n个氨基酸的正电荷氨基酸序列基元的步骤也是从多肽中选择
起始氨基酸残基。然后，检査该氨基酸残基和后面n-l个氨基酸残基中是 否有pH7时带正电荷或负电荷的残基。确定这n个氨基酸残基侧链的净电 荷数。如果净电荷的绝对值小于0.4xn，则舍弃该序列，从另一个氨基酸重 新开始检索。但如果净电荷的绝对值大于或等于0.4xn，则该序列为一个氨 基酸序列基元。若净电荷大于O，该基元为正电荷基元，若小于O，该基元 为负电荷基元。本文述及的氨基酸序列基元的从头设计方法与上面的原理大体相
同，不同在于所设计的序列并不限于天然发现的序列。首先，选择基元
长度n和所需的净电荷符号和数量。然后，选定n个能作为氨基酸序列基 元而得到所需电荷符号和数量的氨基酸，这n个氨基酸的净电荷绝对值大 于或等于0.4xn。从头设计氨基酸序列基元的潜在优点是，操作者可以从所 有氨基酸(20种天然存在的和所有非天然的氨基酸)中挑选以获取所需的 净电荷，而不仅限于特定已知氨基酸序列中发现的那些氨基酸。与从基因 组序列中鉴定氨基酸基元相比，大型氨基酸池扩大了基元序列设计时可供 选择的物理、化学和/或生物学特征的潜在范围。本文所述的设计多肽包含一个或多个氨基酸序列基元。设计用于 ELBL的多肽时，可以重复同一基元，或者将不同基元连在一起。在一实施 例中，氨基酸序列基元之间共价连接，无插入序列。在另一实施例中，设 计多肽包含两个或两个以上由接头共价连接的氨基酸序列基元。该接头可 以是氨基酸型接头，如一个或多个氨基酸残基，如赖氨酸或脯氨酸，或者 可以是适于共价连接两个氨基酸序列基元的其它任何化合物。在一实施例 中，接头包含l-4个氨基酸，如1-4个赖氨酸和/或脯氨酸残基。该接头包 含合适的长度或组成，使设计多肽中每个残基的净电荷大于或等于0.4。在一实施例中，设计多肽的长度大于或等于15个氨基酸残基。在 其它实施例中，设计多肽的长度大于18、 20、 25、 30、 32或35个氨基酸。 聚合物长度的实际上限为1,000个残基。氨基酸序列基元被选出或从头设计后，即可利用本领域熟知的方法，如固相合成和F-moc化学合成法，或者通过基因克隆、转化及细菌异
源表达的方法，合成带有氨基酸型接头的设计多肽。可以委托肽合成公司
如SynPep公司(Dublin, California),在实验室内用肽合成器合成，或者采 用重组DNA的方法合成。任何新型开发的肽合成法可能会增加肽的产量， 但对本文所述的肽设计程序应该不会有实质性改变。制作设计多肽多层膜的方法包含将多层带相反电荷的化学物质 沉积到基底上，其中至少一个层含有设计多肽。依次沉积的聚电解质的净 电荷相反。图1是ELBL沉积的示意图。在一实施例中，设计多肽(或其 它聚电解质)的沉积过程包括将基底暴露在含设计多肽(或其它聚电解质)、 pH值使设计多肽净电荷适于ELBL的水溶液中。在另一实施例中，将设计 多肽或其它聚电解质沉积到基底上的方法是将带有相反电荷的多肽溶液先 后喷涂到基底上。在其它实施例中，沉积到基底上的方法是将带有相反电 荷的多肽溶液同时喷涂到基底上。形成多层膜的ELBL法中，相邻层的相反电荷能驱动组装发生。 关键因素不是相对层中聚电解质的净线性电荷密度相同，而是相对层带有 相反电荷。 一种通过沉积进行的标准膜组装程序包括形成聚离子水溶液， pH为使聚离子以离子形式存在的值(即pH4-10)，选用带有表面电荷的基 底，将基底交替浸入带电荷的聚电解质溶液内。视情况可以在交替层沉积 步骤之间洗漆基底。本领域普通技术人员可以很容易确定适于聚离子沉积的聚离子浓 度。典型的浓度为0.1-10mg/mL。制出的层厚通常与沉积时所述聚离子溶液 浓度范围基本上无关。对于典型的非多肽聚电解质如聚(丙烯酸)和聚(烯 丙胺盐酸盐)，层厚通常约3-5A，具体视溶液离子强度而定。较短电解质通 常比较长电解质形成的层薄。聚电解质膜的厚度与湿度、层数和构成膜的 组合物有关。例如，50nm厚的PLL/PLGA经氮气干燥后收縮到1.6nm。通 常可以形成l-100nm或更厚的膜，具体取决于膜的水合状态和组装体中聚 电解质的分子量。另夕卜，形成稳定聚电解质多层膜所需的层数与膜内聚电解质相关。对仅含有低分子量多肽层的膜来说，通常要有4个或4个以上相反电荷多
肽双层。而对于含高分子量聚电解质如聚(丙烯酸)和聚(烯丙胺盐酸盐) 的膜来说，仅含一个带相反电荷聚电解质的双层是比较稳定的。本发明还涉及通过提呈任何能诱导免疫应答的蛋白或肽，来诱导 机体产生免疫应答。在一实施例中，抗原是对特定感染疾病物质产生强免 疫应答的关键表位，即免疫优势表位。需要的话，为了提高免疫应答的可 能性，免疫原性组合物中可以包括一个以上的抗原或表位。在一实施例中，多层膜包括含有与一个或多个抗原决定区共价结 合的一个或多个表面吸附区的第一抗原性多肽层，其中，所述第一抗原性 多肽层和一个或多个表面吸附区的净极性相同。所述表面吸附区包含一个 或多个氨基酸序列基元。第一抗原性多肽层的多肽长度至少为15个氨基酸， pH4-10时在水溶液中的溶解度大于50)Lig/mL。在一实施例中，所述一个或 多个表面吸附区和一个或多个抗原决定区的净极性相同。在另一实施例中， 第一层的抗原性多肽在pH4-10时的溶解度大于或等于约lmg/mL。溶解度 是对促进水溶液中多肽沉积的实际限制因素。抗原性多肽聚合程度的实际 上限是约1000个残基。但是，采用合适的合成法合成更长的合成多肽也不 是没有可能。在一实施例中，抗原性多肽包含一个抗原决定区(3)，被两侧的 N-端表面吸附区(1)和C-端表面吸附区(2)夹在中间(图2)。抗原性多肽的各独立区(如抗原决定区(1)和表面吸附区(2、 3)) 可以采用液相合成法、固相合成法，或合适宿主的基因工程法单独合成(图 3)。液相合成法是目前市场上大多数批准使用的肽类药物所用的制备方法。 这一方法可用来合成较长的肽和甚至较小的蛋白质。降钙素是用液相合成 法合成的最长肽G2mers)。使用该方法制备较小或几百公里中等长度的肽 更为普通。制造工艺优良的设备中有可能制出像这样大量的所需肽。或者，可以使用溶液合成法、固相合成法，或合适宿主的基因工 程法将各个不同独立区作为一条多肽链来一起合成。特定情况下选用何种方法将视简便性或经济成本而定。如果要单独合成各抗原决定区和表面吸附区(图3)，则例如先后 用离子交换色谱、高效液相色谱法纯化各部分，然后用肽键合成法将它们
连在一起(图4)。 B卩，N-端表面吸附区(1)、抗原决定区(3)和C-端抗 原决定区(2)共价连接成抗原性多肽(4)。其方法类似于所谓的杂合法 (hybrid synthesis),这一方法中，先用固相技术合成侧链被完全保护的肽 段，然后在液相或固相程序中通过肽键将其连接。这一杂合法已用于T2( — 段含36个氨基酸残基的肽)的合成，但尚未普及。图5是含两个表面吸附区(120和130)和一个抗原决定区(110) 的抗原性多肽实施例。120是N-端表面吸附区。130是C-端吸附区。各表 面吸附区包含一个或多个氨基酸序列基元。抗原性多肽是一条多肽链中表 面吸附区与抗原决定区之间的独特组合。接头的肽序列(140)可用于在一 条多肽链中产生含抗原决定区的复合多肽。在一实施例中，抗原决定区 (110)是约含50-130个氨基酸残基的小功能区，直径约2nm。在另一实施 例中，抗原决定区(110)是约含250个氨基酸残基的大功能区，直径约4證。 在伸展结构中16个氨基酸残基的长度约5.5nm。在一实施例中，抗原性多肽包含一个抗原决定区和一个表面吸附 区，其中，表面吸附区包含两个氨基酸序列基元。在另一实施例中，抗原 性多肽包含一个抗原决定区和两个表面吸附区， 一个表面吸附区与抗原决 定区的N端连接，另一个表面吸附区与抗原决定区的C端连接，其中，各 表面吸附区包含一个或多个氨基酸序列基元，所述两个表面吸附区相同或 不同，有相同极性(图2)。表面吸附区的作用是在构建多层膜时，使多肽 能吸附到带相反电荷的表面上。抗原性多肽中，表面吸附区的数量与抗原决定区的数量和/或长度 的比值与溶解度需求相关。例如，如果抗原决定区是一个例如含3个氨基 酸残基的短氨基酸序列，则仅需要一个含至少12个氨基酸残基的氨基酸序 列基元，将抗原性多肽吸附到带合适电荷的表面上。反之，如果抗原决定 区是蛋白质的水溶性折叠结构域，例如含有120个氨基酸残基，则一般两个氨基酸序列基元就足以使抗原性多肽带有充足电荷而具有水溶性并能够 吸附。两个基元可能相互挨着，位于结构域的N端，或者相互挨着，位于 结构域的C端，或者不挨着， 一个在N端，另一个在C端。与抗原性多肽中抗原决定区的氨基酸残基数相比，表面吸附区的
总长度更受热能耗散的影响，而对于同时进行的抗原性多肽吸附来说，必
须克服这种影响。所以，将抗原决定区的聚合程度增加2倍，对抗原性多 肽的表面吸附区的有效连接来说，并不一定需要将表面吸附区加长2倍。
抗原性多肽与一表面吸附的物理基础是静电引力(和向本体溶液释放相反 电荷离子)，对纳米级长度来说结构域的精确质量是第二重要因素，并且， 热能是抵消抗原性多肽吸附的主要"作用力"。鉴于此，本领域的技术人员 可以很容易地设计适于与特定目标抗原决定区的表面发生物理吸附的表面 吸附区。抗原决定区包含3到约250个氨基酸残基。抗原决定区同时包括 抗原性基元和抗原性结构域。抗原性基元较短，所以一般不存在紧密的三 维折叠结构；但它们能表现出特定抗原性。虽然抗原性基元一般没有紧密 的三维折叠结构，但它们可以含有二级结构特征，如cx-螺旋和卩-折叠。抗 原决定区若是抗原性基元时，通常包含3到约50个氨基酸残基；若是抗原 性结构域时，通常含约50-250个氨基酸残基。本文中，抗原性结构域是指至少一部分多肽，该多肽在折叠时会 产生自己的憎水核。例如，天然蛋白质可以含有多个结构域，每个结构域 都是独立的结构和功能单位。 一个域的生物功能与另一个域的功能完全独 立，就像同一个多肽链中含有催化域和结合域一样，这两个域彼此间完全 不发生相互作用。天然蛋白中，域之间的结构相互作用不仅有可能，而且 相对普遍；这种情况下， 一个结构域与另一个结构域之间的相互作用可看 作是一种四级结构。本文中，抗原性域通常最少约含50个，最多约含250个氨基酸残 基。原则上，只要本文所述抗原性多肽的水溶性适于ELBL沉积，则抗原 性肽中可以使用任何抗原性域。在一实施例中，pH4-10时，抗原性域的水溶性大于50iug/mL。在另一实施例中，pH4-10时，抗原性域的水溶性大于 或等于1 mg/mL。再在另一实施例中，抗原决定区包含抗原性域时，第一 层抗原性多肽至少包含两个氨基酸序列基元。当抗原性多肽含抗原性基元而不含功能域时，通常每个残基的净 电荷数量大于或等于0.4。但如果抗原性基元中每个残基的净电荷数量小于 0.4，则通常一个或多个表面吸附区中每个残基的净电荷数量大于0.4，以弥 补并给抗原性多肽提供合适的电荷特性，以确保其水溶性和物理吸附性。多肽或抗原可以含有一个或多个截然不同的抗原决定簇。抗原决 定簇可以是含多条链的多肽的免疫原性部分。本文所述抗原性多肽包含抗原决定区。合适的抗原决定区包括病 毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤抗原、参与自身免疫的 抗原，以及包含前述一种或多种抗原决定区的组合。在一实施例中，抗原决定区包含病毒抗原。合适的病毒抗原包括 但不限于逆转录病毒抗原，如fflV-l抗原，其包括基因gag、 pol和env的 基因产物、Nef蛋白、逆转录酶和HIV抗原其它部分；肝炎病毒抗原，如B 型肝炎病毒的S、 M和L蛋白，B型肝炎病毒的pre-S抗原，及A型、B型 和C型等肝炎病毒其它部分；流感病毒抗原，如血凝素、神经氨酸酶和流 感病毒其它部分；麻疹病毒抗原，如麻疹融合蛋白和麻疹病毒其它部分； 风疹病毒抗原，如蛋白质E1和E2及风疹病毒其它部分；轮状病毒抗原， 如VP7sc和轮状病毒其它部分；巨细胞病毒抗原，如外壳糖蛋白B和其它 巨细胞病毒抗原；呼吸道合胞病毒抗原，如M2蛋白和其它呼吸道合胞病毒 抗原；单纯疱疹病毒抗原，如即刻早期蛋白、糖蛋白D和其它单纯疱疹病 毒抗原；水痘带状疱疹病毒抗原，如gpl、 gpll和其它水痘带状疱疹病毒抗 原；日本脑炎病毒抗原，如蛋白E、 M-E、 M-E-NS1、 NS 1、 NS l-NS2A、 80ME和其它日本脑炎病毒抗原；狂犬病毒抗原，如狂犬病糖蛋白、狂犬病 核蛋白和其它狂犬病毒抗原；以及包含前述一种或多种抗原决定区的组合。在另一实施例中，抗原决定区包含细菌抗原。合适的细菌抗原包括但不限于百日咳细菌抗原，如百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌黏
附素(pertactin)、 FIM2、 FIM3、腺苷酸环化酶和其它百日咳细菌抗原；白 喉细菌抗原，如白喉毒素或类毒素和其它白喉细菌抗原；破伤风细菌抗原， 如破伤风毒素或类毒素和其它破伤风细菌抗原；链球菌抗原，如M蛋白和 其它链球菌抗原；革兰氏阴性杆菌抗原；结核分枝杆菌抗原，如热休克蛋 白65 (HSP65)、 30 kDa主要分泌蛋白、抗原85A和其它分枝杆菌抗原； 幽门螺旋杆菌抗原；肺炎球菌抗原，如肺炎球菌溶血素和其它肺炎球菌抗 原；流感嗜血杆菌抗原；炭疽菌抗原，如炭疽保护抗原和其它炭疽菌抗原； 立克次体细菌抗原，如romps和其它立克次体细菌抗原；以及包含前述一 种或多种抗原决定区的组合。在另一实施例中，抗原决定区包含真菌抗原。合适的真菌抗原包 括但不限于念珠菌真菌抗原；组织浆真菌抗原，如热休克蛋白60 (HSP60) 和其它组织浆真菌抗原；隐球菌抗原，如荚膜多糖和其它隐球菌抗原；球 孢子菌抗原，如小球体抗原和其它球孢子菌抗原，以及包含前述一种或多 种抗原决定区的组合。在另一实施例中，抗原决定区包含寄生虫抗原。合适的原生动物 和其它寄生虫抗原包括但不限于恶性疟原虫抗原，如裂殖子表面抗原、子 孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子细胞/配子表面抗原、血相抗原pf 1 55/RESA和其它原生质抗原；弓形虫抗原，如SAG-1、 p30和其它弓形虫 抗原；血吸虫抗原，如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白和其它血吸虫抗原； 硕大利什曼原虫和其它利什曼原虫抗原，如gp63、脂磷酸多糖及其相关蛋 白和利什曼原虫抗原其它部分；克氏锥虫(trypanosoma cmzi)抗原，如75-77 kDa抗原，56 kDa抗原和锥虫抗原其它部分；以及包含前述一种或多种寄 生虫抗原的组合。在一实施例中，抗原决定区包肿瘤抗原。合适的肿瘤抗原包括但 不限于前列腺特异性抗原(PSA)、端粒酶；多药物耐药蛋白，如P-糖蛋白； MAGE-1、 (x-胎甲球蛋白、癌胚抗原抗原、突变p53、乳头瘤病毒抗原、神 经节苷脂或其它黑色素瘤含糖组分，或其它肿瘤细胞；以及包含前述至少一种或多种肿瘤抗原的组合。本文所述组合物和方法中可以考虑使用来源 于任意类型肿瘤细胞的抗原。在另一实施例中，抗原决定区包含参与自身免疫的抗原。研究显 示，参与自身免疫的合适抗原包括但不限于髓磷脂基蛋白、髓磷脂少突胶 质细胞糖蛋白和多发性硬化症的蛋白脂质蛋白质和风湿性关节炎的CII胶 原蛋白；以及包含前述一种或多种抗原决定区的组合。 了解引发目标疾病的病原体抗原的抗原决定簇或表位，可能是开 发合成肽疫苗的良好开端。对病原体及其作用机制、免疫系统对感染的应 答情况了解得越多，疫苗制备的成功率越高。全面探究病原体基因组结构， 是帮助确定病原体抗原决定簇位点的快速、常规程序。査明特异性抗体靶向抗原决定簇或表位的位置和组成的方法和技 术都是本领域很熟悉的。这些技术可用于鉴定用作抗原决定区的表位，并 且/或者对该表位进行特征分析。在一实施例中，对抗原性蛋白中暴露在外 的氨基/羧基进行化学修饰，通过表位"足迹"法，来确定对应抗原特异性 抗体的表位的图谱/特征分析。在一个实施例中，足迹技术涉及HXMS (用 质谱法检测氢-氖交换)的使用，其中受体和配体蛋白酰胺质子之间发生氢/ 氘交换、结合和后交换，参与蛋白结合的骨架酰胺基团被后交换所保护， 所以仍然被氘化。这样用胃蛋白酶蛋白水解法、快速微孔高效液相色谱分 离法和/或电喷雾离子化质谱法就可以鉴定出相关区域。在另一实施例中，合适的表位鉴定技术是核磁共振表位图谱法 (NMR)，该方法中，通常比较游离抗原和与抗原结合肽如抗体结合的抗原 在二维NMR光谱中的信号位置。 一般有选择性地对抗原进行同位素15N 标记，这样可以在NMR-光谱中观察到抗原信号，而看不到抗原结合肽信号。 与抗原结合肽发生相互作用的氨基酸产生的抗原信号通常在结合体光谱中 的位置相对于游离抗原有所改变，并且参与结合的氨基酸通过这种方式也 被鉴定出来。在另一实施例中，可以用肽扫描法进行表位图谱/特征分析。这一方法中，先制出覆盖抗原性多肽链全长的一系列相互重叠的肽，然后测定 各个肽的免疫原性。再用标准方法，如酶联免疫吸附试验，确定相应肽抗 原的抗体滴定度。最后根据免疫原性对各肽分类，作为选择用于疫苗开发 的设计肽的经验基础。在另一实施例中，在制作表位图谱及鉴定过程中还可以使用蛋白 酶水解技术。抗原决定簇相关区/序列可通过蛋白酶水解方法确定，如使用
与抗原性蛋白用量比约1: 50的胰蛋白酶在37°C、 pH7-8对抗原性蛋白进 行过夜水解，然后进行质谱(MS)分析用于肽鉴定。随后比较胰蛋白酶水 解样品和先与CD38BP温育然后用例如胰蛋白酶水解得到的样品，可以鉴 定出受抗原性蛋白保护而未被胰蛋白酶切割的肽。其它酶如糜蛋白酶和胃 蛋白酶等也可以或选择性地在类似表位特征分析法中使用。另外，利用已 知抗体，通过蛋白酶水解可以快速确定已知抗原性蛋白内潜在抗原决定簇 序列的位置。本发明进一步涉及免疫原性组合物，该组合物包括含有两层或两 层以上聚电解质的多层膜，其中，相邻层所含的聚电解质电荷相反，第一 层聚电解质含有抗原性多肽。免疫原性组合物可视情况进一步包括一个或 多个含其它抗原性多肽的层。在一实施例中，免疫原性组合物含有位于相同或不同抗原性多肽 上的多个抗原决定区。该多个抗原决定区可以来源于相同或不同的感染性 物质。在一实施例中，免疫原性组合物包含多个各不相同的抗原性多肽。 在另一实施例中，免疫原性组合物包含多个免疫原性肽，各肽内含多个抗 原决定区。在另一实施例中，多肽是含与脂部分或者与载体蛋白部分结合 的抗原性肽混合物的结合肽。这些免疫原性组合物的优点是，多个抗原决 定簇或单个线性抗原决定簇的多种构象可以存在于一个合成疫苗粒子中。 这类具有多个抗原决定簇的组合物有可能产生抗多个表位的抗体，增加机 体免疫系统产生的至少某些抗体中和抗原或靶向例如癌细胞上特定抗原的 机率。在一实施例中，免疫原性组合物包含多个抗原性多肽，其中，各抗原性多肽是相同病原体的免疫原。或者，免疫原性组合物还可以包括多 个针对相同病原体不同表位的抗原性多肽。不同表位另外也可以存在于病 原体表面上紧挨着的区域内。所以，在一实施例中，第一层聚电解质包含 两个或两个以上的抗原决定簇。在另一实施例中，多层膜包括含一个或多 个与一个或多个第二抗原决定区共价连接的第二表面吸附区的第二抗原性 多肽，其中，第二抗原性多肽和一个或多个第二表面吸附区的极性相同， 其中， 一个或多个第二表面吸附区含有一个或多个第二氨基酸序列基元，
该基元由5-15个氨基酸构成，各残基的净电荷数量大于或等于0.4， 一个或 多个第二抗原决定区含有3到约250个氨基酸残基，第二抗原性多肽不是 均聚体，至少有15个氨基酸长，pH4-10时水溶解度大于50pg/ml。免疫原性组合物的免疫原性可通过多种方式增强。在一实施例中， 多层膜视情况可以包含一个或多个其它免疫原性生物活性分子。虽然不是 一定，但一个或多个其它免疫原性生物活性分子通常包含一个或多个另外 的抗原决定簇。其它合适的免疫原性生物活性分子包括但不限于药物、蛋 白质、寡核苷酸、核酸、脂、磷脂、碳水化合物、多糖、脂多糖，或者包 含前述一种或多种生物活性分子的组合。其它类型的另外的免疫增强因子 包括功能性膜碎片、膜结构组成、病毒、病原体、细胞、细胞团、细胞器， 或者包含前述生物活性结构组成的组合。在一实施例中，多层膜视情况可以包含一种或多种另外的生物活 性分子。所述一种或多种另外的生物活性分子可以是药物。或者，免疫原 性组合物是中空外壳或包覆核心的涂层形式。所述核心包含各种不同的填 充体，例如， 一种或多种另外的生物活性分子，如包括药物。所以，按本 文所述设计的免疫原性组合物还可能用于联合治疗，如诱导机体产生免疫 应答，并释放目标药物。用作核心的合适的微米级晶型治疗材料可以通过 含抗原性多肽的免疫原性组合物被胶囊化，所得的微胶囊有可能用于药物 释放。某些条件如高pH或低温下核心可以是不溶的，而在发生控释的条件 下是可溶性的。晶体上的表面电荷可通过；-电势测量法(用于确定液态介 质中胶体粒子上单位净电荷)测定。微胶囊内容物从胶囊内向周围环境释放的速度取决于众多因素，包括胶囊外壳的厚度、外壳中使用的抗原性多 肽、是否存在二硫键、肽的交联程度、温度、离子强度和肽的组装方法。 通常，胶囊越厚，释放时间越长。在另一实施例中，另外的免疫原性生物活性分子是能控制目标宿 主免疫原合成或干扰病原体遗传信息表达的核酸序列。前一情况下，例如 通过所属领域技术人员熟知的方法将这类核酸序列插入合适的表达载体 内。适于向体内高效转移基因的表达载体包括逆转录病毒、腺病毒和牛痘 病毒载体。这类表达载体的调控因子包括至少一个启动子、至少一个操纵 子、至少一个先导序列、至少一个终止密码子和对载体核酸的合适转录和
后续翻译有益或其必需的其它任何DNA序列。尤其是，这类载体应该含有
至少一个宿主识别的复制起点和至少一个选择性标记和至少一个能启动核 酸序列转录的启动子序列。后一情况下，这一核酸序列的多拷贝例如通过 装入多肽多层膜胶囊内用于静脉给药。构建重组表达载体时，另外应当注意，可以将目标核酸序列(El 或核心)的多拷贝及其跟随的调控因子插入每一个载体内。在这样一个实 施例中，宿主内每个载体会产生更多的目标E1或核心蛋白质。可插入载体 的核酸序列拷贝数受所用载体向合适宿主内转移、复制和转录能力(和载 体大小有关)的限制。在进一步的实施例中，免疫原性组合物含有抗原性肽/免疫原性生 物活性分子混合物。它们可以来源于相同抗原，可以是来源于相同感染性 物质或疾病的不同抗原，或者可以是来源于不同感染性物质或疾病。所以 该复合物或混合物会产生免疫应答，抵抗大量由释放系统抗原性肽/蛋白组 分限定的抗原或者可能是感染性物质或疾病。在一实施例中，免疫原性组合物引起免疫系统对病原体产生应答。 在一实施例中，疫苗组合物包含免疫原性组合物和药用载体的组合。所以， 接种疫苗抵抗病原体疾病的方法包含向被接种对象给用有效量的免疫原性 组合物。
28[100]药用载体包括但不限于较大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、 多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、失活病毒粒子等。 组合物中也可以使用药用盐，例如，盐酸盐、溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐等 无机盐以及醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或安息香酸盐等有机酸盐。组合物 还可以含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇，以及润湿剂、乳化剂或pH缓 冲剂等物质。还可以使用脂质体作为载体。诱导脊椎动物产生抗疾病或病原体的免疫应答的方法包含给用
包括含抗原性多肽的多层膜的免疫原性组合物。在一实施例中，抗原性多 肽在多层膜的最外层或溶剂接触层。免疫原性组合物可以口服、鼻内、静 脉内、肌内、皮下、腹腔内、舌下或透皮方式给药，助剂可用可不用。通 常，所述组合物按与剂型相符的给药方式，以预防和/或治疗有效量给药。 免疫原性组合物的精确用量由医师定夺，每个受治对象可以有各自特定用 量。本领域技术人员显然知道，免疫原性组合物的治疗有效量取决于给药 方案、所用抗原的单位剂量，组合物是否与其它治疗剂联合使用，及受治 者的免疫状态和健康状况。本领域普通技术人员根据患者特点(年龄、重 量、性别、状况、并发症、其它疾病等)可以确定治疗有效剂量，这是本 领域熟知的技术。另外，随着进一步的常规研究，会逐渐获得有关不同患 者所患各种疾病治疗所需的合适剂量水平等更为具体的信息，普通技术人 员结合受治对象的治疗现状、年龄和一般健康状况考虑，能够确定合适的免疫原性组合物可视情况含有佐剂。通常佐剂包含增强宿主非特 异性免疫应答的物质。佐剂的选用视被接种对象而定。最好是使用药用佐 剂。例如，人用疫苗应当避免使用油类或烃类乳液佐剂，包括完全或不完 全氟氏佐剂。适于人使用的佐剂例如是明矾(铝凝胶)。但是，动物用的疫 苗可以含有不适于人用的佐剂。下面用非限制性实施例对本发明做进一步阐述。实施例
实施例l:具有单个抗原决定簇的HIV-1疫苗组合物本例中，抗原性多肽仅包含一个抗原决定区，其中，抗原决定区 是来源于病原体的多肽序列，表面吸附区位于抗原决定区的N-端。在一实 施例中，抗原决定区是已知病原体如HIV-1的抗原决定簇，如肽ARP7022 或DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC (SEQ ID NO: 1)。合适的抗原性多肽
包含
ID NO: 2)抗原性肽的表面吸附区包含KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 3)。含24个残基的APR7022序列(SEQ ID NO. 1)表示HIV-1糖蛋白 41 (第593-616个残基)的保守免疫优势区，可被大多数欧洲和非洲1 丫+ 血清识别(Langeetal. (1993)AIDS7,461)。用本领域已知的任何一种方法 合成对应SEQIDN0.2全长的肽。用这个肽以多种方式制备人造病毒，如 将包括5个分别含多聚(L-赖氨酸)和多聚(L-谷氨酸)的双层和最后一个 对应SEQ ID NO. 2的肽层的LBL免疫原性组合物沉积到直径3pm的碳酸 钙微粒上。用这一方法制备的人造病毒的露在外面的外层或外表面层，由 SEQ ID NO. 2所表示的免疫原性肽的多拷贝形成。各层吸附用的多肽水溶 液浓度是2mg/mL(pH7)。各层的吸附时间是20分钟。在各肽吸附步骤之间 用离心方式"漂洗"微粒。某些情况下，用EDTA处理，将最后得到的人 造病毒构建体的碳酸钙模板粒子溶解掉。如此制备出的结构体可以称之为 人造病毒或合成疫苗本例中，它们"展现"出它们的表面抗原决定簇， 即多个已知抗原决定簇拷贝来诱导机体产生免疫应答，从而产生识别完整 HIV-1的抗体。这一技术有望用来制备预防药物，进行HIV-1治疗。
实施例2:具有多个抗原决定簇的HIV-1疫苗组合物主要有两类具有多个抗原决定簇的免疫原性组合物1)被同时吸附的各个抗原性多肽均包含多个抗原决定区，且数量相同，其中，多个 抗原决定区之间相同或不同，基于相同或不同的病原体；2)被同时吸附的 多个抗原性肽中，每个抗原性肽含有多个功能单位中的一个单位，其中功 能区是基于或并非基于相同的病原体。这里需要重点提一下，两类肽的混 合溶液原则上在用于制备人造病毒的表面层时不逊于其中任一类肽的溶 液。任一类中表面吸附区的肽肽之间通常相同，但并非必要。而且，表面
吸附区可以位于合成抗原性肽的N-端或C-端，或者在同一合成肽的功能区
之间，或者这些可能性的某种组合。具有多个抗原决定簇的1型免疫原性组合物。本例中，抗原决定 区中抗原性多肽包含两个位于抗原决定区中的抗原序列，其中，两个抗原 序列均来源于同一病原体，并且含有位于抗原决定区N-端、抗原决定区C-端和介于抗原序列之间的表面吸附区。在一例中，抗原决定簇来源于已知 病原体如HIV-1 ，例如，肽ARP7022或DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC (SEQ ID NO: l)和LQARILAVERYLKDQQL (SEQ ID NO:4)。合适的抗原性
多肽包含
AKKKGKKKAKKKGLQARILAVERYLKD⑨LKKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 5)合成抗原性肽的表面吸附区包含KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 3)。 SEQ ID NO. 4对应HIV-1糖蛋白41中第67-83个残基。 如前述方法，先用本领域已知的任何一种方法合成对应SEQ ID NO. 5全长 的肽。用这个肽以多种方式制备人造病毒，如将包括5个分别含多聚(L-赖氨酸)和多聚(L-谷氨酸)的双层和最后一个对应SEQIDNO. 5的肽层 的LBL免疫原性组合物沉积到直径3pm的碳酸钙微粒上。用这一方法制备 的人造病毒的露在外面的外层或外表面层，由SEQ ID NO. 5所表示的多个 免疫原性肽拷贝形成。各层吸附用的多肽水溶液浓度是2mg/mL(pH7)。各 层的吸附时间是20分钟。在各肽吸附步骤之间采用离心方式"漂洗"微粒。 某些情况下，用EDTA处理，将最后得到的人造病毒构建体的碳酸钙模板粒子溶解掉。如此制备出的结构体可以称之为人造病毒或合成疫苗本例 中，它们"展现"出它们的表面抗原决定簇，即已知抗原决定簇的多拷贝 来诱导机体产生免疫应答，从而产生识别完整HIV-1的抗体。这一技术不 仅有望用来制备预防药物，进行HIV-1治疗，而且有望用于癌症治疗(当 抗原序列代表癌症细胞表面标志物时)。
实施例3:用于HIV-1和SARS的免疫原性组合物本例中，抗原性多肽包含两个抗原决定区和两个表面吸附区，其
中，抗原决定区是来源于单个病原体的多肽序列，表面吸附区位于抗原性
多肽的N-端和C-端，第一抗原决定区与中央的表面吸附区之间被短接头隔 开。在一例中， 一个抗原决定区是病原体如HIV-1中已知的抗原决定簇， 例如肽ARP7022或DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC (SEQ ID NO: 1)， 其它抗原决定区，即YSRVKNLNSSEG(SEQIDNO:6)，来源于严重急性呼 吸道综合症(SARS)的推定外壳蛋白，短接头是单个赖氨酸残基G:
AKKKGKKKAKKKGYSRVKNLNSSEGKKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 7)
像前面 一 样，合成抗原性肽的表面吸附区均包含 KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 3)。
实施例4:具有单个抗原决定簇的真菌疫苗组合物本例中，抗原性多肽包含单个抗原决定区，其中，该抗原决定区
是来源于病原体的多肽序列，表面吸附区位于抗原决定区的c-端。在一例
中，抗原决定区是病原体(如粗球孢子菌(CoccWw'cfes /mw/泡))蛋白质 (如Ag2/PRA)内的信号序列，如MQFSHALIALVAAGLASA(SEQIDNO:
8)。合适的抗原性多肽包含
MQFSHALIALVAAGLASAKKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 9)[111]抗原性肽的表面吸附区包含KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 3)。这一来源于Ag2/PRA (SEQ ID NO. 8)的含18个残基的序列表示 CoccWio/tfey Zwmz'to的结构域，它是导致呼吸疾病球孢子菌病(圣华金河热) (San Joaquin Valley fever)的病因。本例中，先用本领域已知的任何一种 方法合成对应SEQ ID NO. 9全长的整个肽。用这个肽以多种方式制备人造 病毒，如将包括5个分别含多聚(L-赖氨酸)和多聚(L-谷氨酸)的双层和 最后一个对应SEQ ID NO. 9的肽层的LBL免疫原性组合物沉积到直径3pm 的碳酸钙微粒上。用这一方法制备的人造病毒的露在外面的外层或外表面 层，由SEQIDN0.9所表示的多个免疫原性肽拷贝形成。各层吸附用的多 肽水溶液浓度是2 mg/mL(pH7)。各层的吸附时间是20分钟。在各肽吸附步 骤之间采用离心方式"漂洗"微粒。某些情况下，用EDTA处理，将最后 得到的人造病毒构建体的碳酸钙模板粒子溶解掉。如此制备出的结构体可 以称之为人造病毒或合成疫苗本例中，它们"展现"出它们的表面抗原 决定簇，即己知抗原决定簇的多拷贝来诱导机体产生免疫应答，从而产生 识别完整CoccW/oWm 的抗体。这一技术有望用来制备预防药物，
进行CoccWc^Wey /w/mto治疗。
实施例5:具有多个抗原决定簇的细菌疫苗组合物本例中，抗原性多肽包含单个抗原决定区，其中抗原决定区包含 两个来源于病原细菌的多肽序列，表面吸附区位于抗原决定区的C-端、N-端和病原细菌的两个序列之间。在一例中，抗原决定簇来源于蛋白质，如 来源于变形链球菌(&reptococc^ mwtora) MT8148的表面蛋白抗原Pac， 如 NAKATYEAALKQYEADLAAVKKANAA (SEQ ID NO: 10)和 AALTAENTAIKQRNENAKA (SEQ ID NO: 11)。合适的抗原性多肽包含
12)抗原性肽的表面吸附区包含KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 3)。来源于PAc基因产物的序列(SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11)表示表面蛋白抗原中的一部分富含丙氨酸的重复区，在用作抗牙龋疫苗的 抗原组成方面己备受关注。本例中，先用本领域已知的任何一种方法合成
对应SEQIDNO. 12全长的肽。用这个肽以多种方式制备人造病毒，如将包 括5个分别含多聚(L-赖氨酸)和多聚(L-谷氨酸)的双层和最后一个对应 SEQ ID NO. 12的肽层的LBL免疫原性组合物沉积到直径3pm的碳酸钙微 粒上。用这一方法制备的人造病毒的露在外面的外层或外表面层，由SEQ ID NO. 12所表示的免疫原性肽多拷贝形成。各层吸附用的多肽水溶液浓度是 2mg/mL(pH7)。各层的吸附时间是20分钟。在各肽吸附步骤之间采用离心 方式漂洗微粒。某些情况下，用EDTA处理，将最后得到的人造病毒构建 体的碳酸钙模板粒子溶解掉。如此制备出的结构体可以称之为人造病毒或 合成疫苗本例中，它们"展现"出它们的表面抗原决定簇，即抗原决定 簇多拷贝来诱导机体产生免疫应答，从而产生识别完整S. m"to^的抗体。 这一技术有望用来制备预防药物，进行S. 治疗。总之，用ELBL法和免疫原性肽制出的人造病毒具有如下优点 合成肽疫苗不需要进行某些疫苗安全性试验，降低了疫苗生产中的成本和 风险。例如，进行特定毒性试验，检测含有毒性被减弱或被杀死的病毒粒 子的疫苗中病毒粒子的不完全失活(例如用细胞培养分析法检测)，既耗费 时间，又浪费资源。而未使用病毒或其它类型病原体作免疫原的疫苗构建 体不需要进行这类安全性试验。另外，由于不需要进行哺乳动物细胞培养 来繁殖本发明用的病毒，所以本发明所得疫苗被来源于病毒、微生物或真 核生物的有害物污染的风险会大大降低，尤其是按照GMP条件制备合成肽 和人造病毒时，更是如此。本文要求保护的发明的其它优点包括利用"盒式"(cassette) 法合成适于LBL的肽不仅制备简单而且反应快速。而且，该方法能使单个线性抗原决定簇的多种构象同时"展现" 在单个合成疫苗粒子表面上，产生抗多种序列构象的抗体，从而使至少一 些由机体免疫系统产生的抗体中和病原体或靶向癌细胞上特定抗原的几率 增加。如上所述，可以想到，有可能将含不同功能区的肽加到单个合成疫苗构建体内，增加保护范围本文要求保护的合成疫苗可以提呈针对多个 病原体的多个抗原决定簇， 一次疫苗接种后，可提供抗许多不同病原体的 保护功效。本合成疫苗平台极其普遍，原则上可适用于任何病原体。所以， 不像其它已知的疫苗接种法那样，需要用基因工程，将基因转到合适表达 宿主内，表达基因，纯化重组蛋白或病毒粒子等，本文公开的合成疫苗可 以縮短应对病原体威胁的应答时间。本文中"第一"和"第二"等词不表示任何特定顺序，而仅便于 表示例如多个层。除非另外说明，"包含"、"具有"、"包括"和"含有"等 词均应理解为开放式用语(即意指"包括但不限于")。文中表示数值范围 的方式仅仅是作为单独谈及落在该范围内的每个分散数值的简略表示法， 除非本文另外指明，而且每个分散值就好比文中以一一叙述的方式被引入 本说明书。所有范围的端点包含在该范围内，而且可独立组合。文中所述 所有方法均按合适的顺序操作，除非文中另外指明或上下文清楚地出现不 同说法。任一和所有实施例或典型用语(如"例如/如")仅仅是为了更好地 阐述本发明，而非对本发明范围予以限制，除非另外要求。说明书中任何 语言均不应解释为将任何未要求权利保护的特征作为实施本文所述发明的 必要特征。虽然参照典型实施例对本发明进行了描述，但本领域技术人员应 当明白，在本发明范围内可以进行各种改动而且可以将本发明的特征用等 同特征替代。另外，根据本发明的教导有可能在本发明的范围内进行多种 改进以适应特定情况或材料，所以，本发明并非要局限于本文公开的作为 实施本发明最佳基元的特定实施例，而是要包括权利要求范围内的所有实 施例。本发明涵盖上述特征所有可能变化形式的任一组合，除非本文另外 指明或有清楚的相反叙述。
权利要求
1.一种免疫原性组合物，其包括含两层或两层以上聚电解质的多层膜，其中，相邻层含有相反电荷的聚电解质，其中，第一层聚电解质含有第一抗原性多肽，该抗原性多肽含有与一个或多个抗原决定区共价连接的一个或多个表面吸附区，所述抗原性多肽和一个或多个表面吸附区具有相同的极性，所述一个或多个表面吸附区含有一个或多个氨基酸序列基元，该基元由5-15个氨基酸构成，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4，及所述一个或多个抗原决定区含有3到约250个氨基酸残基，其中，所述第一抗原性多肽不是均聚体，有至少15个氨基酸长，pH4-10时水溶解度大于50μg/mL；其中，第二层含有第二层聚电解质，该聚电解质含有分子量大于1,000、每分子至少5个电荷且电荷与第一层多肽相反的聚阳离子材料或聚阴离子材料。
2. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述抗原性多肽位 于所述多层膜的外层内。
3. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述抗原决定区包 含病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤抗原、参与自身免 疫的抗原，或者前述一种或多种抗原决定区的组合。
4. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述第一层聚电解 质含有两个或两个以上抗原决定簇。
5. 根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，所述两个或两个以 上抗原决定簇来源于相同或不同的病原体或靶疾病。
6. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其进一步含有第二抗原性 多肽，该抗原性多肽含有与一个或多个第二抗原决定区共价连接的一个或多个第二表面吸附区，所述第二抗原性多肽和一个或多个第二表面吸附区 具有相同的极性，所述一个或多个第二表面吸附区含有一个或多个第二氨基酸序列基元，该基元由5-15个氨基酸构成，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4， 及所述一个或多个第二抗原决定区含有3到约250个氨基酸残基，其中，所述第二抗原性多肽不是均聚体，有至少15个氨基酸长，pH4-10 时水溶解度大于50 |Lig/mL。
7. 根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中，所述第一抗原决定 区和第二抗原决定区来源于相同或不同的病原体或靶疾病。
8. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述多层膜进一步 含有另外的免疫原性生物活性分子。
9. 根据权利要求8所述的免疫原性组合物，其中，所述另外的免疫原 性生物活性分子包括药物、寡核苷酸、核酸、脂、磷脂、碳水化合物、多 糖、脂多糖，或者包含前述一种或多种生物活性分子的组合。
10. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述抗原性多肽的 水溶解度约大于或等于lmg/mL。
11. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述抗原决定区包 括含3到约50个氨基酸残基的抗原性基元，中性pH时所述抗原性多肽中 每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。
12. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述抗原决定区是 含有约50-250个氨基酸残基的抗原性域。
13. 根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其中，所述抗原性域在 pH4-10时的水溶解度大于50叱/mL。
14. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述多层膜形成胶 囊，将一种或多种非肽生物活性分子封装在内。
15. 根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述多层膜是微胶 囊形式。
16. 根据权利要求15所述的免疫原性组合物，其中，所述微胶囊含有 核心，该核心含有另外的生物活性分子。
17. 根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述另外的生物 活性分子包括药物、蛋白质、寡核苷酸、核酸、脂、磷脂、碳水化合物、 多糖、脂多糖，或者包含前述一种或多种生物活性分子的组合。
18. —种诱导脊椎动物产生免疫应答的方法，其包含将该脊椎动物给用 一种免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括含有两层或两层以上聚电解质的多层膜，其中，相邻层含有相反电荷 的聚电解质，其中，第一层聚电解质含有抗原性多肽，该抗原性多肽含有与一个或 多个抗原决定区共价连接的一个或多个表面吸附区，所述抗原性多肽和一 个或多个表面吸附区具有相同的极性，所述一个或多个表面吸附区含有一个或多个氨基酸序列基元，该基元 由5-15个氨基酸构成，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4，及所述一个或多个抗原决定区含有3到约250个氨基酸残基，其中，所述抗原性多肽不是均聚体，有至少15个氨基酸长，pH 4-10 时水溶解度大于50 |ag/mL;其中，第二层含有第二层聚电解质，该聚电解质含有分子量大于1,000、 每分子至少5个电荷且电荷与第一层多肽相反的聚阳离子材料或聚阴离子 材料。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中，所述免疫原性组合物以肌内 或皮下方式给用。
20. —种制备免疫原性组合物的方法，该方法包括 在基底表面上沉积第一层聚电解质，形成第一层；其中，第一层聚电解质含有第一抗原性多肽，该抗原性多肽含有与一个或多个抗原决定区共 价连接的一个或多个表面吸附区，所述抗原性多肽和一个或多个表面吸附 区具有相同的极性，所述一个或多个表面吸附区含有一个或多个氨基酸序列基元，该基元由5-15个氨基酸构成，每个残基的净电荷数量大于或等于0.4，及所述一个或多个抗原决定区含有3到约250个氨基酸残基，其中，所述第一抗原性多肽不是均聚体，有至少15个氨基酸长，pH4-10 时水溶解度大于50吗/mL;在所述第一层聚电解质上沉积第二层聚电解质，形成第二层；其中， 第二层含有第二层聚电解质，该聚电解质含有分子量大于l，OOO、每分子至 少5个电荷且电荷与第一层多肽相反的聚阳离子材料或聚阴离子材料。
全文摘要
本文公开了包括含两层或两层以上聚电解质的多层膜的免疫原性组合物，其中，相邻层含有相反电荷的聚电解质。第一层聚电解质含有抗原性多肽，该抗原性多肽含有与一个或多个抗原决定区共价连接的一个或多个表面吸附区，所述抗原性多肽和一个或多个表面吸附区具有相同的极性。免疫原性组合物可在诱导脊椎动物产生免疫应答的方法中使用。
文档编号C07K17/00GK101296945SQ200680039703
公开日2008年10月29日 申请日期2006年10月25日 优先权日2005年10月25日
发明者唐纳德·坦普尔顿·海尼 申请人:人工细胞技术公司