专利名称：酰胺衍生物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酰胺衍生物及其用途，具体地说，涉及一种N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取 代呋喃-2-曱酰胺类化合物及其用途。
背景技术：
痞疾是地球上发生最频繁的寄生虫病，是由按蚊进行传播、具有潜在致命危险的疾病。 随着已有抗痴药物的耐药性的不断增加，疰疾的发病率日益增加，亟待具有新型治疗作用的 抗痗药物的发现。
红细胞内期的痴原虫在其酸性食物泡内水解宿主的血红蛋白以获得自身生命所需的能量 和氨基酸。生物学研究表明，在疟原虫的食物泡内包涵一系列的水解酶，如天冬氨酸蛋白酶 (plasmepsins),半胱氨酸蛋白酶(falcipains),和金属蛋白酶(falcilysins)。这些酶已成为疰疾 化学治疗的潜在的靶标。
半胱氨酸蛋白酶是Mi约为21000~30000的蛋白质，在pH值为4~6.5时具有最高水解活 性，它的活性部位具有半胱氨酸残基。痴原虫的半胱氨酸蛋白酶属于木瓜蛋白酶家族。已知 的症原虫半胱氨酸蛋白酶有四个亚型，falcipain-l, falcipain-2A, falcipain-2B, falcipain-3。 Falcipain 1是第一个表达得到的疟原虫半胱氨酸蛋白酶，其生物学研究表明，它对疟原虫的 无性生殖阶段并无影响，但能显著的影响卵嚢的功能。Falcipain-2A, falcipain-2B具有97 % 的同源性，仅在氨基酸序列的7位有所不同。通过寡核苦酸探针的监测发现，falcipain-2B mRNA的表达水平比falcipain-2A低。然而falcipain-2A和falcipain-2B在疟原虫营养体晚期 其表达的时间依赖性和峰值极为相似，这表明两种不同的亚型具有相似的生物学功能。 Falcipain-3与falcipain-2在催化域有66.6 %的同源性，但是它们表达的阶段有所不同。 Falcipain-2在营养体阶段表达达到最高峰，而falcipain-3在更为成熟的疸原虫阶段表达达到高 峰。在这几种亚型中，对于falcipain-2的研究最多，因此其抑制剂的开发亦受到更为广泛的 关注。
近年来，"计算机辅助药物设计"(Computer-Aided Drug Design, CADD)已成为现代药物研 究与开发的一个重要方法和工具。运用计算机辅助药物设计平均而言能缩短新药研究周期0.9 年，节省研究与开发费用1.3亿美元。因此，CADD方法已广泛地应用于先导化合物的发现与优化。计算机辅助高通量虚拟已经成为目前常用的一种计算机辅助药物发现方法。其原理 是运用超级计算机通过分子对接的方法在多达数百万的小分子化合物库中寻找可以与某一特 定疾病耙标蛋白结合的化学结构，为进一步的分子、细胞、动物和临床研究提供高效可靠的 小分子先导化合物。
综上所述，以半胱氨酸蛋白酶falcipain-2作为靶标，结合CADD和各种水平的生物活性 测试试验，设计并合成的小分子化合物，对开发抗疟药物具有重要的现实意义。
本发明综合运用CADD和基于BIAcore的SPR实验，发明人已经找到了 一个N-(4-取代 氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-曱酰胺化合物，运用合理药物设计方法针对此化合物进行结构修 饰，并测试此类化合物在体外酶水平实验测试中抑制falcipain-2的活性，结果证明其具有较 强的falcipain-2抑制活性。
本发明所说的N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-曱酰胺类化合物，具有式I所示结构
式I中R!为氢，d-C6直链或支链的饱和或不饱和烷基，CrC7饱和或不饱和环烷基， 5-7元芳(香)环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳(香)环基或取代的5-7元杂环基；
R2为甲基或R3OCH2-， R3为5-7元芳(香)环基或取代的5-7元芳(香)环基；X为C 或S=0;
其中，所述取代的5-7元芳(香)环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自卤素、CVC6 直链或支链烃基、羟基、Q-Q烷氧基、d-C4不饱和烃氧基、羧基、酯基、C广C6羧基烷氧基、 C广C6酯基烷氧基、C广Cs羧基烷基、C广C6酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羟曱基、三氟曱基、 三氟甲氧基、巯基或d-Ct酰基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为l-4; 所述杂环基的杂原子为氧、硫或/和氮，杂原子的个数为1-3。 在本发明一个优选技术方案中，X为S-O时，其具有式U所示结构
发明内容式U中Ri为氢，5-7元芳(香)环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳(香)环基或取 代的5-7元杂环基；
R2为曱基或R3OCH2-, R3为5-7元芳(香)环基或取代的5-7元芳(香)环基； 其中，所述取代的5-7元芳(香)环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自面素、 d-C6直链或支链烃基或d-C4烷氧基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为l-4; 所述杂环基的杂原子为氮，杂原子的个数为1-3。
更优选的R！为氢、含氮6元杂环基或由d-Ct烷氧基取代的含氮6元杂环基； 更优选的R2为曱基或R3OCH2-， R3为6元芳(香)环基或取代的6元芳(香)环基，其 中所述的取代的6元芳(香)环基的取代基为卣素或d-C3烷基，取代基的个数为1 ~4。 在本发明另一个优选技术方案中，X为C时，其具有式Ib所示結枸
式IB中R！为氢，5-7元芳(香)环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳(香)环基或取
代的5-7元杂环基；
R2为R3OCH2-， R3为5-7元芳(香)环基或取代的5-7元芳(香)环基； 其中，所述取代的5-7元芳(香)环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自卤素、
C广C6直链或支链烃基或CrQ烷氧基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为l-4; 更优选的R！为氢、含氮6元杂环基或由d-C4烷氧基取代的含氮6元杂环基； 更优选的R2为R3OCH2-， R3为6元芳(香)环基或取代的6元芳(香)环基，其中所述
的取代的6元芳(香)环基的取代基为卤素或C!-C3烷基，取代基的个数为1 ~ 4。
图1阳性对(Z-Phe-Arg-pNAHCl)照和化合物IA-1与FP-2蛋白相结合的动力学曲线图，
其中各条线由上到下代表的化合物浓度依次为1 x 10_5M、 5x 1(T6M、 2.5x 10—6M、 1.25 xlO—6M、 6.25xl(T7M、 3.125 x 10墨7 M和0。 图2.化合物IA-1和IA-5的ICso值。
具体实施例方式
一种制备本发明所述的N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-曱酰胺类化合物的方法，其 主要合成路线如下所示<formula>formula see original document page 7</formula>
合成路线中Ac为乙酰基(CH3CO)， Y为卣素(F、 Cl、 Br或I), 的含义与前文所 述相同。
具体包括如下步骤 式U所示化合物的制备
1) 将5-氯曱基呋喃-2-曱酸曱酯、R3OH (如取代芳基盼)、无机碱与有机溶剂混合，回流 过夜；蒸除大部分溶剂，加水，有机溶剂萃取，干燥，蒸干溶剂，得到5-(取代芳基氧曱基) 呋喃-2-曱酸甲酯(式II所示化合物)。
2) 将步骤1)中得到的化合物II与无机石咸投入到适量曱醇中，5(TC搅拌过夜；蒸除大部 分溶剂，加水，用盐酸调pH^，析出固体，抽滤得5-(取代芳基氧曱基)呋喃-2-曱酸(式III 所示化合物)。
3 )室温下Ri取代胺在碱性溶液中与对-乙酰氨基苯磺酰氯反应，温度在40°C ~ 45°C ，搅 拌12-36小时。将反应液倾入水中，有机溶剂萃取，得到的有机层经干燥，过滤，减压蒸除 溶剂，残余物柱层析分离得4-乙酰氨基-N-Ri取代苯磺酰胺。将此磺酰胺投入到10%的氢氧 化钠水溶液中回流2小时，控制反应液温度在70°C ~ 80。C，浓盐酸调pH=4-5,析出大量固体，经抽滤，水洗，千燥得产物4-氨基-N-R！取代苯磺酰胺(式IV所示化合物)。
4 )将步骤2 )中得到的化合物投入适量卣代试剂中回流2小时，减压浓缩得5-(取代芳基
氧曱基)呋喃-2-曱酰囟(式V所示化合物)，不经纯化直接用于下步反应。
用少量干燥的卤代烃(如二氯曱烷)溶解曱酰卣(式V所示化合物)。室温搅拌下，滴入
步骤3)中得到的化合物IV与吡啶的混合溶液中。室温反应过夜，加水，用盐酸调pH二2 3,
析出固体，抽滤，水洗、干燥得到化合物N-[(4-Ri取代氨磺酰)苯基]-5-芳基氧曱基呋喃-2-曱
酰胺(目标化合物之一 )。 或
1) 将氢氧化钠溶于水中，控温0。C-5。C,依次滴加氧化剂(如溴等)和5-曱基呋喃-2-甲趁，维持此温度，搅拌反应1 3小时，反应液用乙醚萃取两次，水层用盐酸调pH-l,析 出大量固体，抽滤，水洗得5-曱基呋喃-2-甲酸(式VII所示化合物)。
2) 将步骤1)中得到的化合物VII投入适量卣代试剂中回流2小时，减压浓缩得5-甲基 呋喃-2-曱酰卣(式VIII所示化合物)，不经纯化直接用于下步反应。
用少量干燥的卤代烃(如二氯曱烷)溶解化合物VIII。室温搅拌下，滴入4-氨基-N-R！取 代苯磺酰胺(式IV所示化合物)与吡啶的混合溶液中。室温反应过夜，加水，用盐酸调pH=2 ~ 3，析出固体，抽滤，水洗、干燥得到化合物N-[(4-R!取代氨磺酰)苯基]-5-曱基呋喃-2-甲酰胺 (目标化合物之二)
式lB所示化合物的制备
1) 在四氢呋喃溶剂中，Ri取代胺、对-硝基苯曱酰卣(对-硝基苯曱酰氯)和有机碱回流 反应，搅拌12 36小时。将反应液倾入水中，有机溶剂萃取，得到的有机层经干燥，过滤， 减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得4-硝基-N-R,取代苯曱酰胺。将此酰胺投入到10%Pd-C 的醋酸水溶液(70%, V/V)中反应30小时，控制反应液温度在20°C ~40°C,抽滤，浓缩得 产物4-氨基-N-R！取代苯曱酰胺(式VI所示化合物)。
2) 5-(取代芳基氧曱基)呋喃-2-曱酰卤(式V所示化合物)溶于少量干燥的卤代烃(如二 氯甲烷)中，室温搅拌下，滴入由步骤1)中得到的化合物VI与吡啶的混合溶液中。室温反 应过夜，加水，用盐酸调pH-2 3，析出固体，抽滤，水洗得化合物N-[(4-R!取代氨曱酰)苯 基]-5-芳基氧曱基呋喃-2-甲酰胺(目标物之三，式IB所示化合物)。
在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任 何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量(克) 为单位。实施例1
5-(4-氯-3-曱基苯氧曱基)呋喃-2-曱酸甲酯(化合物II-1)的制备
将2.5克5-氯曱基呋喃-2-曱酸曱酯、2.2克4-氯-3-曱基苯酚、2.6克碳酸钾与40毫升乙 腈混合，回流过夜；蒸除大部分溶剂，加水，乙酸乙酯萃取，酯层干燥，蒸干溶剂，得到白 色固体3.8克，收率94.5%。 mp 56-58 °C; 'H-NMR (DMS0-4， 500 MHz) 3 2.29 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 5.14 (s, 2H)， 6.80 (d, 1H), 6.91 (dd, 1H)， 7.07 (d, 1H), 7.20 (d， 1H), 7.30-7.33 (m， 2H); MS (EI) 附/z 280 (M+)。
实施例2
5-(4-氯-3-曱基苯氧曱基)呋喃-2-曱酸(化合物III-1)的制备
将1.7克II-l与0.5克一水合氢氧化锂投入到20毫升曱醇中，50 。C搅拌过夜。蒸除大 部分溶剂，加水，用盐酸调pH = 1 ，析出固体，抽滤得白色固体(III-1) 1.58克，收率97.5%。 mp 194-195 °C; ^-NMR (DMSO隱c4, 500 MHz) <5 2.28 (s， 3H), 5.11 (s， 2H), 6.74 (d， 1H)， 6.89 (dd, 1H)， 7.05 (d, 1H), 7.20 (d, 1H), 7.30 (d, 1H); MS (EI) w/z 266 (M+)。
实施例3
4-氨基-N-(6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(化合物IV-1)的制备
室温下将1.0克4-乙酰氨基苯磺酰氯加入到1.87克6-曱氧基嘧啶-4-胺与15毫升的吡啶 溶液中，于45。C搅拌24小时。将反应液倾入水中，乙酸乙酯萃取，酯层用无水硫酸镁干燥， 过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离(洗脱剂曱醇/氯仿=1:20)得4-乙酰氨基-N- (6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺，为橙色固体1.36克，收率52.8%。mp 223-224 °C; 'H-NMR(DMSO-^， 500 MHz) 5 2.07 (s, 3H)， 3.84 (s, 3H)， 6.33 (s, 1H)， 7.75 (d, 2H), 7.86 (d， 2H)， 8.41 (s, 1H); MS (EI) 油322(M+)。
将1.2克4-乙酰氨基-N. (6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺投入到15毫升10%的氢氧化钠水 溶液中回流2小时；控制反应液温度在70-80 。C之间，浓盐酸调pH-4 5,析出大量固体， 经抽滤，水洗，千燥得4-氨基-N- (6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)，为黄色固体，0.58 克，收率55.9%。 mp 201-203 。C; 'H-NMR (DMSO-^， 500 MHz) <5 3.81 (s, 3H), 6.29 (s, 1H)， 6.57 (d， 2H)， 7.53 (d， 2H), 8.37 (s， 1H); MS (EI) w/z 280 (M^。实施例4
N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-甲酰胺(IA-1)的制 备
将0.5克II-l与3毫升二氯亚^5风混合，回流搅拌2小时，减压浓缩，残余物用少量干燥 的二氯曱烷溶解。将上述溶液于室温搅拌下，滴入0.58克IV-1与吡啶的混合溶液中。室温反 应过夜，加水，用盐酸调pH-2~3,析出固体，水洗，得到白色固体(Ia-1 )0.5克，收率50.5%。 mp 134-136 。C; 'H- NMR (DMS0-4 500 MHz) <5 2.28 (s， 3H)， 3.77-3.81 (m, 5H)， 6.28 (s， 1H)， 6.81 (d, 1H)， 6.91 (dd, 1H), 7.86-7.92 (m， 6H)， 8.36 (s， 1H); MS (EI) w/z 528 (M+)。
实施例5
N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺(化合物IA的一种 (IA-2))的制备
将4-氯-3-甲基苯酚替换成4-氯苯酚，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4,得 棕色固体0.33克，收率32.8% (最后一步收率)。mp 71-74 。C; 'H-NMR (DMSO-c4, 500 MHz) 3 3.94 (s, 3H), 4.93 (s, 2H), 6.62 (d， 2H), 6.66 (d, 1H)， 6.95 (d, 2H)， 7.00 (d, 1H)， 7.23 (s, 1H), 7.34 (d， 2H)， 7.55 (d, 2H), 8.57 (s, 1H); MS (EI)附/z 515 (M+)。
实施例6
N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(3-甲基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺(化合物IA的一 种(U-3))的制备
将4-氯-3-甲基苯酚替换成3-曱基苯酚，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4, 得淡黄色固体0.87克，收率81.1%(最后一步收率)。mp 195-197 。C; ^- NMR (DMS0-4， 500 MHz) 3 2.29 (s, 3H)， 3.85 (s， 3H)， 5.14 (s, 2H), 6.35 (s, 1H)， 6.81 (t， 2H), 6.85 (m， 1H), 6.88 (s, 1H)， 7.19 (t, 1H), 7.41 (m, 1H)， 7.90-7.95 (m, 4H), 8.42 (s， 1H); MS (EI) m/z 494 (M"^
实施例7
N一[[(4-(6-曱氧基嗜啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-(苯基氧曱基)呋喃-2-甲酰胺(化合物IA的一种(U-4)) 的制备
将4-氯-3-曱基苯酚替换成苯酚，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4,得淡黄 色固体1.01克，收率92.4% (最后一步收率)。mp 195-196 。C; !H-NMR (DMSO-^， 500 MHz) 3 3.85 (s, 3H), 5.16 (s, 2H)， 6.35 (s， 1H)， 6.82 (d, 1H), 6.99 (t, 1H)， 7.06 (d， 2H), 7.33 (t, 2H)， 7.41 (m， 1H)， 7.90-7.96 (m， 4H)， 8.42 (s, 1H); MS (EI) w/z 480 (M+)。实施例8
N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(2，4-二氯-3，5-二甲基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺(化 合物IA的一种(U-5))的制备
将4-氯-3-曱基苯酚替换成2,4-二氯-3,5-二曱基苯酚，其余所需原料、试剂及制备方法同 实施例1-4,得淡黄色固体0.4克，收率92.4% (最后一步收率)。mp 214-216 。C; "H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) S 2.34 (s， 3H)， 2.40 (s， 3H),3.74 (s， 3H)， 5.23 (s, 2H), 6.08 (s，lH)， 6.83 (d, 1H), 7.27 (s， 1H), 7.40 (d， 1H)， 7.78-7.81 (m, 4H), 8.20 (s， 1H); MS (EI) m/z 576 (M+)。
实施例9
N-(4-氨磺酰苯基)-5-[(4-氯-3-甲基苯基)氧曱基]呋喃-2-甲酰胺(化合物IA的一种(U-6))的制 备
将4-氨基-N- ( 6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)替换成4-氨基苯磺酰胺，其余所需原 料、试剂及制备方法同实施例1、 2、 4,得淡黄色固体0.52克，收率65.4% (最后一步收率)。 mp 216-217 °C; 'H-NMR (DMSO-of6， 500 MHz) <5 2.31 (s， 3H)， 5.16 (s， 2H), 6.83 (d, 1H), 6.93 (dd, 1H), 7.09 (d, 1H)， 7.33 (d， 1H), 7.41 (m， 1H), 7.80 (d, 2H), 7.92 (m， 2H); MS (EI) w/z 420 (M+)。
实施例10
4-氨基-N-(6-曱氧基嘧啶-4-)苯曱酰胺(化合物VI-1)的制备
在四氢呋喃溶剂中，6-曱氧基嘧啶-4-胺、4-硝基苯曱酰氯和吡啶回流反应，搅拌12小时。 将反应液倾入水中，二氯曱烷萃取，得到的有机层经干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱 层析分离得4-硝基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯曱酰胺。将此酰胺投入到10% Pd-C的醋酸水溶液 (70%， V/V)中反应30小时，控制反应液温度在20 40。C之间，抽滤，浓缩得产物4-氨基 -N-(6-T氧基嘧啶-4-)笨曱酰胺(VI-1),直接投入下步反应。
实施例11
N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨酰基]苯基]-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺(IB-1)的制 备
将4-氨基-N- (6-曱氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)替换成4-氨基-N-(6-曱氧基嘧啶-4-)苯 曱酰胺VI-l,其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1、 2、 4，得白色固体0.26克，收率 28.6% (最后一步收率)。mp 216-219 。C; 'H陽NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 3 2.29 (s, 3H)， 3.92 (s, 3H)， 5.15 (s，2H)， 6.81 (d， 1H)， 6.91 (dd， 1H)， 7.08 (d,lH)， 7.32 (d，lH)， 7.40 (d，lH)， 7.60 (s,lH)， 7.88 (d，2H), 8.03 (d,2H), 8.60 (s, 1H); MS (EI) w/z 492 (M+)。实施例12
N-(4-氨酰基苯基)-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺(化合物iB的一种(lB-2))的制 备
将4-氨基-N- (6-甲氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)替换成4-氨基苯甲酰胺，其余所需原 料、试剂及制备方法同实施例1、 2、 4,得白色固体0.36克，收率49.3% (最后一步收率)。 mp 244-245 。C; 'H-NMR (DMSO-c4， 500 MHz) <5 2.31 (s， 3H)， 5.16 (s, 2H)， 6.82 (d， 1H)， 6.93 (dd， 1H), 7.09 (d， 1H), 7.33 (d, 1H), 7.39 (d, 1H)， 7.82 (d, 2H), 7.87 (d, 2H); MS (EI) w/z 384 (M+)。
实施例13
将2.9克氢氧化钠溶于15毫升水中，控温2。C 3。C, 一次滴加2克溴和1克5-曱基呋喃 -2-曱醛，加毕，控温0 5。C搅拌反应1小时。反应液用乙醚萃取两次(5 mLx2),水层用浓 盐酸调pH= l,抽滤，水洗得黄色固体产物5-曱基呋喃-2-曱酸0.63克，收率55.3%。mp 109-110 。C; 'H-NMR (DMSO-A, 500 MHz) 3 2.34 (s， 3H), 6.29 (d, 1H), 7.12 (d, 1H)。
实施例14
N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-曱基呋喃-2-甲酰胺(化合物Ia-7)的制备
以5-曱基呋喃-2-甲酸为原料，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例3-4，得淡黄色固 体0.79克，收率51.2%(最后一步收率)。mp 234-236 。C; 'H-NMR (DMSO-d6， 400 MHz) 32.37 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 6.33 (s, 2H)， 7.27 (s, 1H)， 7.90 (m, 4H), 8.39 (s， 1H); MS (EI) w/z 388 (M+)。
实施例15
N-(4-氨磺酰苯基)-5-甲基呋喃-2-曱酰胺(化合物U-8)的制备
以5-曱基呋喃-2-曱酸和4-氨基苯磺酰胺为原料，其余所需原料、试剂及制备方法同实施 例4，得淡黄色固体0.98克，收率88.3%(最后一步收率)。mp 249-262 。C; 'H-NMR (DMSO-A, 400 MHz) S 2.38 (s， 3H), 6.33 (s, 1H)， 7.27 (s， 1H), 7.76 (d, 2H)， 7.89 (s， 2H); MS (EI)附/z 280 (M+)。
实施例16
本发明化合物IA-1与Falcipain-2蛋白酶结合活性测定
Falcipain-2蛋白酶与IA-1结合活性的筛选和动力学常数的测定基于SPR (表面等离子共 振)原理，使用的仪器是Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)。
(1) Falcipain-2质粒(pQE30-Fa12)的构建
根据Falcipain-2 cDNA序列设计引物，正向和反向《I物分别为 5 ， CGTGG ATCCC AAATG AATTATGA AG3 ，和5'ATATGTCGACTTATTCAATTAATGGAATG3，，包含Ba附///和SaZ /酶切位点，通过PCR 扩增Falcipain-2片段，将酶切后的PCR产物和表达载体pQE30连接后鉴定正确，转化入大 肠杆菌M15 (Qiagen)进行表达。
(2) Falcipain-2 (FP-2)蛋白的表达与纯化
将构建好的质粒pQE30-Fa12转入大肠杆菌M15中得到表达工程菌，将工程菌培养于含 100吗/mL氨千青霉素和50ng/mL卡那霉素的10 mL LB培养基中培养过夜(蛋白胨10g/L, 酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L)。然后按1:100转接入1 L含氨节青霉素和卡那霉素的新鲜 LB培养基中，37° C下，220转/分培养。当OD600达到约0.8时，加入IPTG至终浓度0.5 mM, 同时将温度降到25°C培养12小时进行蛋白的诱导表达。4000转/分离心30分钟收集菌体， 收集好后放于-80。C超低温冰箱保存过夜。将菌体用20 mL的buffer 1 (20 mM Tris-Cl, 0.5 M NaCl, and 10 mM imidazole, pH 8.0)悬起，将悬浮液冰浴上超声波破碎(300 W，工作30分 钟， 一次5秒，中间间隔10秒)。破碎后得到的细胞匀浆在4 °C，以10000转/分离心30分 钟，弃上清，用20 mL的buffer 2 (6 M guanidine HCl 20 mM Tris-Cl 250mM NaCl 20 mM imidazole, pH 8.0)溶解沉淀，室温下温和搅拌l小时，10000转/分离心30 min,并将上清上 样到用Binding buffer 2 (6 M guanidine HCl, 20 mM Tris-Cl, 250 mM NaCl, pH 8.0)平衡好的Ni2 +-NTA柱上，先后用Wash buffer 1 (8 M urea, 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl pH 8.0)和Wash buffer 2 (8 M urea, 20 mM Tris-Cl, 30mM imidazole)各30ml洗去非特异性结合的杂蛋白，再用 Elution buffer (8 M urea, 20 Mm Tris-Cl， 1 M imidazole) 10 ml洗去目的蛋白，用SDS-PAGE检 测蛋白的分子量和纯度。
(3) FP-2包涵体蛋白的复性
将纯化得到的蛋白加入10 mM DTT, 37 °C下温浴45分钟后，将蛋白溶液稀释到10 pg/ml 进行透析(透析液訓mMTris-Cl， ImMEDTA, 20% glycerol, 250 mM L-arginine， ImM GSH， ImMSSG, pH 8.0)过夜。将透析好的蛋白浓缩即可用作酶抑制活性的测定。
(4) FP-2蛋白的偶联
彻底清洗Biacore 3000机器后，用HBS-EP緩冲液(10 mM Hepes, 150 mM NaCl， 3 mM EDTA and 0.005% (v/v) surfactant P20, pH 7.4)平衡机器至基线平稳。0.2M N-ethyl-N，-dimethylaminopropyl carbodiimide(N-乙基-N，-二曱基氨丙基碳二亚胺)和50mMM N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS )1:1混和，以5 pL/min进样7分钟以活化芯片表面。FP-2 蛋白用lOmM乙酸钠，pH4.2，稀释至终浓度为69 pg/ml,以5 pL/min流速进样。最后，用 1 M盐酸乙醇胺,pH 8.5以5 pL/min流速进样7分钟，封闭芯片表面，最终FP-2蛋白的偶联量为9300RU左右。
(5) 化合物筛选
底物Z-Phe-Arg-pNA HC1 (Bachem AG)作为阳性对照。IA-1用100% DMSO溶解，母液 浓度为10mM。用HBS-EP緩沖液稀释化合物，至终浓度为1 (aM和10 jxM, DMSO的终浓 度为0.1%。根据IA-1与芯片上FP-2蛋白的结合的RU ( Response Unit,共振单位)值，判 断化合物是否具有结合活性。有结合活性的化合物可进行详细的动力学实验。结果证明IA-1 与FP-2蛋白有明显的结合。
(6) 动力学测定
IA-1用工作緩冲液HBS-EP (含0.1% DMSO),分别配成不同的浓度梯度，以30 nl/min 进样1 min,解离2 min，然后用相同緩冲液稳定2 min。得到IA-1与FP-2蛋白相互作用的传 感图，再用Biacore分析软件中的1 : 1 (Langmuir)结合模型或稳态模型进行拟合，得到确切 的动力学和热力学常数。
(6)试验结果表1阳性对照和IA-1与FP-2蛋白结合常数的测试结果
表1
序号编号
1Ia-149.0
2Z-Phe-Arg-pNA.HCl~32.1
实施例17本发明化合物对falcipain-2蛋白酶百分抑制活性的测定
(1) Falcipain-2 (FP-2)蛋白的表达与纯化和FP-2包涵体蛋白的复性 参见实施例16
(2) 本发明化合物对FP-2酶抑制活性的测定
在197 的100 mM NaOAc, 10 mM DTT, pH 5.5的buffer体系中加入FP-2蛋白(终 浓度10 pg/ml)和溶于DMSO的待测化合物溶液，终浓度10 和0 (阴性对照)，室温下 孵育30 min后用MD SpectraMax M5酶标仪于excitation 355腿；emission 460腿处连续测15 min内的RFU值，计算出反应速率Km，以下列公式得出待测化合物在10 jaM下百分抑制率，
计算公式为
(对照组Km值-实验组Km值)/对照组Km值x100 %(3)化合物活性测试结果见表2.: N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物对 falcipain-2抑制率数据表2.
序号编号抑制率(％, 10pM)
1U-l59.7
2Ia-210.7
3Ia-311.6
4Ia-49.3
5Ia-564.8
6Ia-622.4
7Ib-134.0
8Ib-230.0
9Ia-74.9
10Ia-80
实施例18
本发明部分化合物对falcipain-2蛋白酶半数有效抑制浓度(IC5o)的测定
选取10 nM抑制率在50 %以上的化合物测IC5o,选择合适的化合物浓度梯度，实验方法 和体系如实施例17 。根据化合物在不同浓度下FP-2酶活的反应速率Km ，计算化合物在不同 浓度下对FP-2酶活的抑制率，使用Sigmoidal公式用origin软件进行拟合得到化合物的IC50 值，结果见表3 N-(4-取代氨酰基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物对falcipain-2酶活抑制IC50 和图2。表3.
序号编号
17.08
2Ia-53.71本发明的^(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-曱酰胺类化合物的制备方法具有反应条件 温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点，且本发明的化合物毒性很低。
本发明的N-(4-取代氨酰基)-5-取代呋喃-2-曱酰胺类化合物在计算机虚拟筛选以及在 falcipain-2蛋白酶结合试验和酶抑制试验中均显示了阳性结果。应证了其药理作用机制。因此， 本发明的化合物可用于制备falcipain-2抑制剂。
权利要求
1、一种酰胺衍生物，其具有式I所示结构式I中R1为氢，C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烷基，C3-C7饱和或不饱和环烷基，5-7元芳(香)环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳(香)环基或取代的5-7元杂环基；R2为甲基或R3OCH2-，R3为5-7元芳(香)环基或取代的5-7元芳(香)环基；X为C或S＝O；其中，所述取代的5-7元芳(香)环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基或C1-C4酰基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为1～4；所述杂环基的杂原子为氧、硫或/和氮，杂原子的个数为1～3。
2、 如权利要求1所述的酰胺衍生物，其特征在于，X为S=0时，R,为氢，5-7元芳(香) 环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳(香)环基或取代的5-7元杂环基；R2为曱基或R3OCH2-， R3为5-7元芳(香)环基或取代的5-7元芳(香)环基；其中，所述取代的5-7元芳(香)环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自卤素、 C,-C6直链或支链烃基或CrC4烷氧基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为l-4;所述 杂环基的杂原子为氮，杂原子的个数为1 3。
3、 如权利要求2所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中Ra为氢、含氮6元杂环基或由 d-C4烷氧基取代的含氮6元杂环基。
4、 如权利要求2所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中R2为曱基或R3OCH2-， R3为6 元芳(香)环基或取代的6元芳(香)环基，其中所述的取代的6元芳(香)环基的取代基 为卣素或d-C3烷基，取代基的个数为1 ~ 4。
5、 如权利要求3或4所述的酰胺衍生物，其特征在于，所述的酰胺衍生物为N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺、N-[[(4-(6-曱氧基嘧 啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺、N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯 基]-5-[(3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺、N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-(苯基氧曱基)呋喃-2-曱酰胺、N-[[(4-(6-曱氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(2,4-二氯-3，5-二甲基苯基)氧曱基] 呋喃-2-曱酰胺、^(4-氨磺酰苯基)-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺、N-[[(4-(6-曱氧 基嗜啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-曱基呋喃-2-曱酰胺或N-(4-氨磺酰苯基)-5-曱基呋喃-2-曱酰胺。
6、 如权利要求1所述的酰胺衍生物，其特征在于，X为C时，Ri为氢，5-7元芳(香) 环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳(香)环基或取代的5-7元杂环基；R2为R3OCH2-， R3为5-7元芳(香)环基或取代的5-7元芳(香)环基；其中，所述取代的5-7元芳(香)环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自囟素、 C广C6直链或支链烃基或C广C4烷氧基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为1 4。
7、 如权利要求6所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中Ra为氢、含氮6元杂环基或由 C广C4烷氧基取代的含氮6元杂环基。
8、 如权利要求6所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中R2为R3OCH2-， R3为6元芳(香) 环基或取代的6元芳(香)环基，所述的取代的6元芳(香)环基的取代基为卣素或d-Q 烷基，取代基的个数为1-4。
9、 如权利要求7或8所述的酰胺衍生物，其特征在于，所述的酰胺衍生物为N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨酰基]苯基]-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺或N-(4-氨酰基苯 基)-5-[(4-氯-3-曱基苯基)氧曱基]呋喃-2-曱酰胺。
10、 如权利要求l、 2、 3、 4、 6、 7或8所述的酰胺衍生物在制备由疟原虫引起的疟疾的 治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种酰胺衍生物及其用途。本发明公开了一类N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺化合物，并测试该类化合物在体外酶水平实验测试中抑制falcipain-2的活性，结果证明其具有较强的falcipain-2抑制活性。因此，本发明所提供的N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物可作为疟原虫食物泡内半胱氨酸蛋白酶(falcipain-2)抑制剂，从而阻止疟原虫在宿主体内的进一步增殖。
文档编号C07D405/12GK101565418SQ200810036510
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月23日 优先权日2008年4月23日
发明者刘彦青, 卢伟强, 希金弗, 进 朱, 剑 李, 李洪林, 旭 沈, 夫 洛, 蒋华良, 鹏 车, 曈 陈, 陈莉莉, 瑾 黄 申请人:华东理工大学;中国科学院上海药物研究所