专利名称：消减免疫法制备大肠杆菌0157∶h7抗原单克隆抗体的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备单克隆抗体的免疫方法，特别是涉及一种消减免疫法制备大肠杆 0157:H7抗原单克隆抗体的方法。
技术背景1975年Kohler和Milstein发表了"分泌预定特异性抗体融合细胞的持续培养"的论文， 单克隆抗体技术从此问世。单克隆抗体技术已是现代生命科学研究的重要工具。常规的杂 交瘤技术通常并不能获得特定目的抗原的单克隆抗体。常规技术制备细菌抗原单克隆抗体， 通常采用生物化学方法分离纯化天然蛋白质作为免疫原，然后将免疫小鼠的脾细胞与骨髓 瘤细胞进行融合，用免疫原筛选出分泌抗目的蛋白抗体的细胞株。由于绝大部分的天然蛋 白表达量很低，用生物化学方法分离纯化难度大，成本高，现己很少使用。利用基因工程 技术可表达目的蛋白质，但此方法存在制备周期长和抗体亲合力相对较弱等不足之处，主 要原因是因为大多数蛋白质都采用大肠杆菌表达系统，表达蛋白后无修饰，不具备天然蛋 白的构象，尤其对那些需要糖基化、磷酸化等修饰作用的蛋白。实验证明用某些原核表达 蛋白免疫动物制备的抗血清只能与变性蛋白反应，而很难结合天然抗原，这种现象在用杆 状病毒表达的蛋白中也存在。尽管这类抗体能用于Western Blot实验，但研究天然蛋白的 结构与功能及对病原微生物的检测则受到很大的限制。而用真核表达系统如酵母、昆虫和 哺乳类动物细胞表达蛋白质，存在着实验周期更长、表达产量更低、技术难度更大等问题。 发明内容本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种使免疫系统直接耙向目的抗原决定 簇，来大幅增加目的抗原单抗的产生数目，并减少单抗筛选的工作量的消减免疫法制备大 肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法。本发明的技术方案概述如下消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法，包括如下步骤 (1 )选取4-8周龄雌性BALB/c小鼠；(2) 用除大肠杆菌0157:H7以外的、已分离鉴定的、商品化的大肠杆菌为耐受原腹腔 注射免疫所述BALB/c小鼠，分别在注射所述耐受原的6-16min、 18-30 h和40-60 h，按每 公斤所述BALB/c小鼠体重腹腔注射环磷酰胺50-150 mg，用间接ELISA检测小鼠耐受情 况；(3) 每隔两周重复步骤(2)，直至BALB/c小鼠对所述耐受原耐受；(4) 在使所述BALB/c小鼠出现耐受的末次免疫后的7-14d、 14-21d、 28-35d，以大肠 杆菌0157:H7为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大肠杆菌0157:H7末次免疫3d取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而与大肠杆菌 0157:H7反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。 所述歩骤(1)优选的是选取5-6周龄雌性BALB/c小鼠。所述步骤(2)为用除大肠杆菌0157:H7以外的、己分离鉴定的、商品化的大肠杆菌 为耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分别在注射所述耐受原的8-12 min、 22-26 h和 46-50 h，按每公斤所述BALB/c小鼠体重腹腔注射环磷酰胺50-150 mg，用间接ELISA检测小鼠耐受情况。所述除大肠杆菌0157:H7以外的、已分离鉴定的、商品化的大肠杆菌为大肠杆菌44752、 大肠杆菌44186、大肠杆菌44824、大肠杆菌44336或大肠杆菌44102，还可以选用其它的 大肠杆菌。所述步骤(4)为在使所述BALB/c小鼠出现耐受的末次免疫后的9-lld、 16-18d、 30-32d ，以大肠杆菌0157:H7为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的BALB/c小鼠， 在用所述大肠杆菌0157:H7末次免疫3d取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而 与大肠杆菌0157:H7反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌0157:H7的单克 隆抗体。本发明的方法可在不纯化抗原的基础上，较容易的获得细菌抗原的单克隆抗体；本发 明的方法能提高免疫效果，减少单抗筛选的工作量获得预期的单克隆抗体。
图1为常规免疫法杂交瘤技术示意图； 图2为消减免疫法杂交瘤技术示意图； 图3为BALB/c获得了对大肠杆菌44752的耐受情况；图4为消减免疫效果。
具体实施方式
本发明的方法中，由于BALB/c小鼠在注射耐受原后注射烷化剂环磷酰胺，使得BALB/c 小鼠对耐受原表面暴露的抗原决定簇耐受，注射免疫原后，BALB/c小鼠选择性的针对免疫 原表面特有的抗原决定簇发生免疫反应，特异性抗体随之产生。本发明用的菌体抗原免疫 和筛选，这有利于得到抗天然构象蛋白质的单克隆抗体，有利于单克隆抗体与不同分离毒 株的结合，减少应用中可能受到的限制。下面结合附图对本发明作进一步的说明。常规杂交瘤技术(见图l)为免疫小鼠后直接进行融合筛选，由于菌体为细胞型抗原，其 抗原决定簇十分丰富，并且与其同种属的细菌有严重的交叉反应，致使筛选菌体特异性单 克隆抗体的工作量巨大；而消减免疫使部分相同的抗原决定簇在体内被抑制，从而减少单 抗筛选的工作量，增加获得预期的抗体的机会(见图2)。消减免疫法可排除针对非本细菌特异性抗原单克隆抗体株。从而巧妙的回避了没有比 较纯的抗原的问题，使得试验成功排除了很多非特异性单抗，获得与其他相近属的菌种不 产生交叉反应的单抗株。并且采用菌体抗原免疫可以避免小分子蛋白免疫原免疫效果不佳、产生的抗体不稳定等弊端，从而使试验获得的单抗具有很好的稳定性。实施例1制备抗原生理盐水溶解冻干菌种大肠杆菌0157:H7、大肠杆菌44752，接种于营养肉汤培养基 37。C培养18h，然后划线接种于选择性培养基(远藤培养萄37。C培养18h，挑选其中的典型 菌落，接种于营养琼脂培养基上，37C培养18h，用PBS洗下菌落，4000r/min离心20min， 用PBS洗涤2次后经0.4n/。甲醛固定，配制为抗原浓度为108cfu/mL的菌悬液，4'C保存。 消减免疫法免疫小鼠消减免疫法免疫BALB/c小鼠的步骤消减免疫法以大肠杆菌44752为耐受原，大 肠杆菌0157:H7为免疫原，采用5-6周龄雌性BALB/c小鼠。先用耐受原腹腔注射0.5mL 抗原免疫小鼠，分别在注射耐受原后10min， 24h和48h，再腹腔注射环磷酰胺(Cy) (100 mg/kg体重)；每次免疫后三天后眼睚静脉丛采血，间接ELISA检测小鼠耐受情况，每隔两 周重复此免疫及检测过程，直至小鼠对耐受原耐受。然后，再用免疫原在免疫耐受阶段末 次免疫后10d、 17d、 31d免疫小鼠，依次腹腔注射免疫原0.2mL， 0.5mL， 0.8mL。末次免 疫3d时取鼠尾血检测效价，取与大肠杆菌44752反应效价低而与大肠杆菌0157:H7反应 效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备免疫原的单克隆抗体。免疫耐受阶段，以常规免疫方法免疫大肠杆菌44752菌体抗原作为对照，平行地每次 免疫0.5mL抗原。在免疫3天后，取小鼠眼眶血检测，看受试小鼠是否获得耐受，动物耐 受则进入免疫阶段。耐受后免疫阶段，以常规免疫方法免疫大肠杆菌0157:H7菌体抗原作为对照，平行地 依次免疫0.2mL,0.5mL，0.8mL。在末次免疫后3天，取鼠尾血检测效价，取效价高的小鼠进 行加强免疫，然后按照常规杂交瘤技术制备免疫原大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。 免疫耐受情况免疫耐受阶段末次免疫3d后，后眼睚静脉丛采血，分离血清。图3，用间接ELISA测 得不管是长程还是短程消减免疫法的BALB/c小鼠血清效价在128x时都不足阴性对照(A值 为0.060)的2.1倍，而对照组(常规免疫法免疫)血清效价在104以上，我们认为BALB/c获 得了对大肠杆菌44752的耐受。消减免疫效果间接ELISA，分别包被大肠杆菌44752和大肠杆菌0157:H7菌体抗原，以常规方法免 疫大肠杆菌0157:H7菌体抗原的小鼠血清为对照，用未免疫小鼠血清为阴性对照，分别测 定其效价。由图4可见常规免疫法得到的抗大肠杆菌0157:H7抗血清与大肠杆菌44752的反应 比与大肠杆菌0157:H7抗原反应的效价还高，交叉反应枏当严重；而消减免疫法得到的大 肠杆菌0157:H7抗血清与大肠杆菌44752的反应明显减少。即消减免疫使小鼠免疫系统对 大肠杆菌44752和大肠杆菌0157:H7菌体抗原的共有抗原决定簇的免疫应答被抑制，而对大肠杆菌0157:H7抗原中目的抗原的免疫应答则相对加强。长程、短程两种消减免疫方法所得的结果无明显差异。所有小鼠都可获得耐受，但由于个体差异，不是每只小鼠的血清都对目的抗原有较特异性的反应，大约l/5小鼠的血清呈现特异性。单克隆抗体的制备按照常规杂交瘤技术制备免疫原大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。PEG法进行融合，间接ELISA筛选阳性克隆，有限稀释法对阳性孔细胞进行三次克隆化，最终得到19株能稳定分泌抗大肠杆菌0157:H7抗体的杂交瘤细胞株，分别为4D7、 1D8、4A7、 3G12、 1C6、 1H6、 5D8、 5F10、 3F5、 5A2、 5C12、 5H4、 7F1、 6D12、 5F11、 5A5、5A9、 6C11、 7F8。间接ELISA检测单克隆抗体的交叉反应情况采用间接ELISA检测，19株抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体与81株细菌抗原的交叉 反应情况见表1和表2: 1D8、3F5、4A7、4D7、5A2、5C12、7F8与44752(大肠杆菌0157:H19) 呈阴性反应，但与大肠杆菌0157:H7反应为阳性。1C6、 1D8、 1H6、 4A7、 5D8、 5A2杂 交瘤细胞株分泌的单克隆抗体特异性较好，且与4株分离株的大肠杆菌0157:H7(E11、E22、 北医、天防)有很好的抗体反应谱。其它株单克隆抗体均与其他大肠杆菌有在不同程度的交 叉反应，其中5F11、 6C11、 6D12、 7F1杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与所检测的细菌株 均能反应。_表1间接ELISA检测抗大肠杆菌Q157:H7单克隆抗体与42株细菌的交叉反应结果不同杂交瘤细胞株间接ELISA判别结果菌种名称及菌种号1D8 4A7 1C6 5D8 5A2 1H6 5C12 5H4 '5F10 3G12大肠杆菌8099 — — — — — 一 — _大肠杆菌44186 _ — — — — + —大肠杆菌44824 _ — — — — 一 _ _大肠杆菌44825 — — — — — — — __ —大肠杆菌44336 — — — — — — — — — —大肠杆菌44338 _ — — _ — — — — _ 一沙门氏菌50115 — 一 — — — — 一 + _ —沙门氏菌50303 — — — — — — — — — —沙门氏菌50309 — — — — — — — — 一 一沙门氏菌50312 — — — — — — — _ — —沙门氏菌50770 — — _ _ — 一 一 — — —沙门氏菌50781 — — — — — — — _ _ —志贺氏菌51510 — — — — _ — \ 一志贺氏菌51512志贺氏菌51513志贺氏菌51514志贺氏菌51515志贺氏菌51516志贺氏菌51517志贺氏菌51518志贺氏菌51519志贺氏菌51521志贺氏菌51522志贺氏菌51524志贺氏菌51361志贺氏菌51499 志贺氏菌51135 志贺氏菌51066 志贺氏菌51067 志贺氏菌51081 金黄色葡萄球菌26113 金黄色葡萄球菌29213 小肠结肠耶尔森氏菌52216 小肠结肠耶尔森氏菌52219 肺炎克雷伯氏菌分离株 肺炎克雷伯氏菌46012 弗劳地枸橼酸菌分离株+大肠杆菌0157:H19 44752—_++_+—+++大肠杆菌0157:H7分离株El 1+_++++—+++大肠杆菌0157:H7分离株E22+—■++++++++大肠杆菌0157:H7分离株北医++++++++—+大肠杆菌Q157:H7分离株天防++_+__——++续表1间接ELISA检测抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体与42株细菌的交叉反应结果菌种名称及菌种号不同杂交瘤细胞株间接ELISA判别结果4D73F55A57F85A97F16D125F11 6C11大肠杆菌8099 大肠杆菌44186 大肠杆菌44824 大肠杆菌44825 大肠杆菌44336 大肠杆菌44338 沙门氏菌50115 .沙门氏菌50303 沙门氏菌50309 沙门氏菌50312 沙门氏菌50770 沙门氏菌50781+++++ —+ + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + +++++++++++++志贺氏菌51510—\+—+\\\\志贺氏菌51512—\———\\\\志贺氏菌51513—\一——\\\\志贺氏菌51514—\——_\\\\志贺氏菌51515_\+—+\\\\志贺氏菌51516\\+\志贺氏菌51517+++++\\+\志贺氏菌51518\\+\志贺氏菌51519+++++\\+\志贺氏菌51521+++++\+\志贺氏菌51522_—一—_++++志贺氏菌51524_一——\\\\志贺氏菌51361—_\\\\\\志贺氏菌51499_一__+志贺氏菌51135++++志贺氏菌51066++++志贺氏菌51067_—\\++++志贺氏菌51081++++金黄色葡萄球菌26113—+\—+++—金黄色葡萄球菌+++小肠结肠耶尔森氏菌52216++++小肠结肠耶尔森氏菌52219++++肺炎克雷伯氏齒分离株++++肺炎克雷伯氏齒46012++++弗劳地枸橼酸齒分离株++++大肠杆菌0157:HI9 44752—— +一 +++++大肠杆菌0157:H7分离株El 1—_ ++ +++++大肠杆菌CH57:H7分离株E22+— ++ _++++大肠杆菌0157:H7分离株北医+十++人肠杆菌Q157:H7分离株天防+— —一 ■—++十+表2间接ELISA检测抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体与39株细菌的交叉反应结果,,工^爿^。 不同杂交瘤细胞株间接ELISA判别结果菌种名称及菌种号 -~1C6 1D8 4A7 5A2 5D8 1H6 3G12 4D7大肠杆菌44102 — —— ———— —大肠杆菌44109 — —— ———— —大肠杆菌44110 — — — ———— —人肠杆菌44113 — — — — — — — —大肠杆菌44149 — _一__一一 —大肠杆菌44155 — — — — — — — +大肠杆菌44156 ——— —— —— —大肠杆菌44127 — 一一 ——一+ +大肠杆菌44216 — —— — — 一+ +大肠杆菌44505 — — _ — — _+ +大肠杆菌44561 — — — — — —— _大肠杆菌44813 '— 一一 — — 一一 +变形杆菌49001 — — — — — — — -变形杆菌49087 一 — 一 — 一一一 一变形杆菌49106 — — — — — — — —沙门氏菌50001 _ — — — —沙门氏菌50041 一一 — _ — — 一 一沙门氏菌50042 _______ —沙门氏菌50058 — _ — _ — _一 +沙门氏菌50061 — — — — — — — —沙门氏菌50062 — — — — — — — +沙门氏菌50065 — — — — — — — 一沙门氏菌50067 — — — — — — — 一沙门氏菌50136 — 一 — 一一一一 一沙门氏菌50306 一一一 — 一 — 一 一沙门氏齒50313 一一 — — 一 — — 一沙门氏菌50315 — 一一 — 一一一 一沙门氏菌50322 — 一一 — 一 — + +沙门氏齒50325 — 一一一 — 一一 一沙门氏菌50327 一一一一一 — — 一沙门氏菌50774 一一一一一 — 一 一沙门氏菌50798 — — — 一一一一 +沙门氏菌50825 一一 — 一一一一 +沙门氏菌50885 一一 — 一一 — 一 一沙门氏菌50866 一一一一一 — + +金黄色葡萄球菌26003 — 一一一一 — 一 一金黄色葡萄球菌26071 — 一一一一 — + +小肠结肠耶尔森氏菌52215 小肠结肠耶尔森氏菌52243注- "一"为阴性反应，"+ "为阳性及应，"、"为未进ff试验。 . 消减免疫法的优势从实验结果可以看出，在19株单克隆抗体中，某些株与一些其它血清型的大肠埃希氏 菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌之间有交叉反应，这与细菌之间存有共同抗原 的性质相一致。尤其在同种不同型的细菌之间存在着大量的共同抗原，提示用大肠杆菌 057:H7作为免疫原以常规方法制备单克隆抗体，有极大的筛选工作量，很难获得专一针 对大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。Luciani等在"Production and characterization of monoclonal antibodies specific foi Escherichia coli 0157:H7" —文中用常规免疫法制备大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体，获得 101株分泌抗大肠杆菌OI57:H7的杂交瘤细胞株，间接ELISA检测这些抗体与28株其他 细菌的交叉反应性，结果有7株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体只与大肠杆菌0157:H7反应， 而不与其他细菌抗原反应，比率为7/101。我们在检测与76株其他细菌交叉反应性的基础 上，获得特异针对大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体比率为6/19。对比而言，我们筛选特异针对大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体的工作量要小得多。这 恰恰表明我们选用消减免疫法制备菌体表面蛋白专一性单克隆抗体的优势。也正是消减免 疫法的这种优势使我们在半年的时间就获得了6株特异针对大肠杆菌0157:H7的单克隆抗 体。目前，利用基因工程技术可表达目的蛋白质，但此方法存在制备周期长和抗体亲合力相对较弱等不足之处，而且用表达蛋白免疫动物制备的抗血清只能与变性蛋白反应，而很难 结合天然抗原。我们用消减免疫法制备菌体表面蛋白优势主要体现在两方面 一是回避了 找到、表达、纯化目的蛋白等大量繁琐的实验；另一方面采用菌体抗原免疫可以避免小分 子蛋白免疫原免疫效果不佳、产生的抗体反应性低，不稳定等弊端。 实施例2
消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法，包括如下步骤-
(1) 选取4周龄雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大肠杆菌44186为耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分别在注射所述耐 受原的6min、 18h和40h，按每公斤所述BALB/c小鼠体重腹腔注射环磷酰胺50mg，用间 接ELISA检测小鼠耐受情况；
(3) 每隔两周重复步骤(2)，直至BALB/c小鼠对所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出现耐受的末次免疫后的7d、14d、28d，以大肠杆菌0157:H7 为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大肠杆菌0157:H7末 次免疫3d取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而与大肠杆菌0157:H7反应效价 高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。
实施例3
消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法，包括如下步骤 (1 )选取8周龄雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大肠杆菌44824为耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分别在注射所述耐 受原的16 min、 30h和60 h，按每公斤所述BALB/c小鼠体重腹腔注射环磷酰胺80mg，用 间接ELISA检测小鼠耐受情况；
(3) 每隔两周重复步骤(2)，直至BALB/c小鼠对所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出现耐受的末次免疫后的14dd、 21d、 35d，以大肠杆菌 0157:H7为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大肠杆菌 0157:H7末次免疫3d取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而与大肠杆菌0157:H7 反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。
实施例4
消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法，包括如下步骤
(1) 选取5周龄雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大肠杆菌44336为耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分别在注射所述耐 受原的8min、 22h和46h，按每公斤所述BALB/c小鼠体重腹腔注射环磷酰胺100 mg，用 间接ELISA检测小鼠耐受情况；
(3) 每隔两周重复步骤(2)，直至BALB/c小鼠对所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出现耐受的末次免疫后的9d 、 16d、 30d，以大肠杆菌 0157:H7为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大肠杆菌 0157:H7末次免疫3d取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而与大肠杆菌0157:H7反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。 实施例5
消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法，包括如下步骤
(1) 选取6周龄雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大肠杆菌44102为耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分别在注射所述耐 受原的12 min、 26h和50 h，按每公斤所述BALB/c小鼠体重腹腔注射环磷酰胺150 mg， 用间接ELISA检测小鼠耐受情况；
(3) 每隔两周重复步骤(2)，直至BALB/c小鼠对所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出现耐受的末次免疫后的lld、 18d、 32d，以大肠杆菌 0157:H7为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大肠杆菌 0157:H7末次免疫3d取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而与大肠杆菌0157:H7 反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。
用于做耐受原的大肠杆菌除了上述几个实施例所举出的，还可以选其它的除大肠杆菌 0157:H7以外的商品化的大肠杆菌。
权利要求
1.消减免疫法制备大肠杆菌O157:H7抗原单克隆抗体的方法，其特征是包括如下步骤(1)选取4-8周龄雌性BALB/c小鼠；(2)用除大肠杆菌O157:H7以外的、已分离鉴定的、商品化的大肠杆菌为耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分别在注射所述耐受原的6-16min、18-30h和40-60h，按每公斤所述BALB/c小鼠体重腹腔注射环磷酰胺50-150mg，用间接ELISA检测小鼠耐受情况；(3)每隔两周重复步骤(2)，直至BALB/c小鼠对所述耐受原耐受；(4)在使所述BALB/c小鼠出现耐受的末次免疫后的7-14d、14-21d、28-35d，以大肠杆菌O157:H7为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大肠杆菌O157:H7末次免疫3d取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而与大肠杆菌O157:H7反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体。
2. 根据权利要求所述消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法，其特 征是所述步骤(1)为选取5-6周龄雌性BALB/c小鼠。
3. 根据权利要求所述消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法，其特 征是所述步骤(2)为用除大肠杆菌0157:H7以外的、己分离鉴定的、商品化的大肠杆 菌为耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分别在注射所述耐受原的8-12 min、 22-26 h 和46-50 h，按每公斤所述BALB/c小鼠体重腹腔注射环磷酰胺50-150 mg，用间接ELISA 检测小鼠耐受情况。
4. 根据权利要求1或3所述消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法， 其特征是所述除大肠杆菌0157:H7以外的、已分离鉴定的、商品化的大肠杆菌为大肠杆菌 44752、大肠杆菌44186、大肠杆菌44824、大肠杆菌44336或大肠杆菌44102
5. 根据权利要求1所述消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法，其 特征是所述步骤(4)为在使所述BALB/c小鼠出现耐受的末次免疫后的9-lld、 16-18d、 30-32d ，以大肠杆菌0157:H7为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的BALB/c小鼠， 在用所述大肠杆菌0157:H7末次免疫3d取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而 与大肠杆菌0157:H7反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌0157:H7的单克 隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种消减免疫法制备大肠杆菌O157∶H7抗原单克隆抗体的方法，步骤为(1)选BALB/c小鼠；(2)用除大肠杆菌O157∶H7以外的大肠杆菌为耐受原免疫BALB/c小鼠，在注射耐受原后，腹腔注射环磷酰胺，检测小鼠耐受情况；(3)隔两周重复步骤(2)，直至BALB/c小鼠对耐受原耐受；(4)在使BALB/c小鼠出现耐受后，以大肠杆菌O157∶H7免疫BALB/c小鼠，取与耐受原反应效价低而与大肠杆菌O157∶H7反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌O157∶H7的单克隆抗体。本发明的方法在不纯化抗原的基础上，较易获得细菌抗原的单克隆抗体，提高免疫效果，减少单抗筛选工作量。
文档编号C07K16/12GK101323642SQ20081005395
公开日2008年12月17日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者李君文, 王新为, 王景峰, 谌志强, 邱志刚, 婧 郎, 敏 金, 陈照立 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所