专利名称：：用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种纳米纤维的制备方法，尤其涉及一种用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备方法及应用。技术背景分子识别是整个生物界普遍存在的现象，它主要是指主体分子依靠形状、大小和化学功能对与其互补的客体分子的选择和结合，这种现象在生命过程中扮演着及其重要的角色，如酶与底物、抗原与抗体的相互作用。100多年前，Fisher曾以"锁与钥匙"的配合来描述分子间的这一专一性结合。它是从分子水平研究酶反应、信息传递以及在不同介质间的能量传递等生物现象的重要化学概念，其中蛋白质的分子识别已成为人们重点研究的热点之一。糖与蛋白质、脂类和核酸一样，是构成生物体的重要成分。其中广泛存在的糖缀合物，包括糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂，参与了蛋白的靶向、细胞识别以及抗体一抗原相互作用等重要生理过程。近年来，人们尝试将糖基固定到不同载体表面，比如二氧化硅、金纳米粒子、聚合物微球以及膜分离材料等，来模拟糖的各种生物功能，从而深入研究糖与蛋白质的亲和性相互作用，实现蛋白质的检测和分离。美国专利US20010017270中公开了将糖基固定到金表面，可用于蛋白质、病毒或细胞的检测技术。专利CN1935342和CN101070401分别公开了把糖基固定到聚丙烯分离膜表面和聚丙烯微球表面的方法，有利于蛋白的分离、浓縮或靶向清除。静电纺丝技术是一种获得纳米到微米尺寸纤维材料的方法，近年来引起了广泛的重视。由于具有高比表面积、高孔隙率等优点，纳米纤维膜可以大大降低分离过程中的传质阻力，因而是一种很好的吸附分离材料，特别是对于蛋白质的识别与分离。糖基化纳米纤维的制备，目前主要有两种途径一是通过含糖不饱和单体聚合合成含糖聚合物，再通过静电纺丝方法得到(CN1843592)，这种方法可以很好地将纳米纤维的优点和糖基的功能性结合起来进而用于蛋白质的分离，但是其中不饱和糖单体的合成过程比较复杂，一定程度上限制了它的广泛应用；二是通过大分子反应将糖基固定到纳米纤维的表面，前期专利200710070589.2和200810059174.X中我们通过不同的方法分别将壳聚糖多糖和叠氮单糖固定到含有羧基基团的丙烯腈基共聚物纳米纤维膜的表面，有效验证了这种方法的可行性。由于表面修饰这种方法简单可靠，方便易行，因而更有利于大规模的工业化生产。
发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备方法及应用。包括如下步骤1)将丙烯腈基共聚物溶于溶剂中，配制成质量分数为28%的溶液，采用高压静电纺丝方法制备丙烯腈基共聚物纳米纤维，其中纺丝电压为825千伏，喷丝头溶液流速为0.52.0毫升/小时，接收距离为820厘米；2)将丙烯腈基共聚物纳米纤维浸入糖单体的二氯甲烷溶液中，在氮气保护下加入催化剂三氟化硼乙醚络合物，冰水浴中振荡23小时，然后在室温下振荡反应1520小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘干，得到表面固定乙酰糖基的丙烯腈基共聚物纳米纤维，其中丙烯腈基共聚物纳米纤维的加入量为12毫克纳米纤维/毫升溶剂，糖单体的用量为纤维表面羟基摩尔比为150，三氟化硼乙醚络合物与所用糖单体的摩尔比为35;3)将表面固定乙酰糖基的丙烯腈基共聚物纳米纤维浸入0.10.2摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应6090分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗涤，烘干，得到可用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维。所述的丙烯腈基共聚物为丙烯腈/丙烯酸羟乙酯共聚物、丙烯腈/丙烯酸羟丙酯共聚物、丙烯腈/甲基丙烯酸羟乙酯共聚物或丙烯腈/甲基丙烯酸羟丙酯共聚物，它们的粘均分子量为830万，共聚物中羟基的摩尔含量为518%。溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺。静电纺丝得到的纳米纤维直径为601000纳米。糖单体为葡萄糖五乙酸酯、甘露糖五乙酸酯、半乳糖五乙酸酯、乳糖八乙酸酯、麦芽糖八乙酸酯或蔗糖八乙酸酯。糖单体的用量为纤维表面羟基摩尔比优选为1030。糖基化纳米纤维应用于蛋白质的分离和纯化。本发明与现有技术相比具有的有益效果1)丙烯腈基共聚物纳米纤维制备简单，直径范围在601000纳米内可调，是一类高比表面、高空隙率的载体材料；2)糖基固定化方法操作简单，经济实用。3)糖基固定化方法适用于任何乙酰基保护的单糖、寡糖和多糖。4)通过化学键键合的方法将糖基固定到纳米纤维的表面，稳定性和持久性好；5)糖基化纳米纤维用于蛋白质的分离纯化，高效、快速，有利于保持生物大分子的活性，并且可以多次重复使用，易于工业化生产。图l(a)为葡萄糖基固定化纳米纤维的结构示意图；图l(b)为乳糖基固定化纳米纤维的结构示意图；图2(a)为实施例1得到的丙烯腈/甲基丙烯酸羟乙酯纳米纤维的扫描电镜照片；图2(b)为实施例1得到的糖基化丙烯腈/甲基丙烯酸羟乙酯纳米纤维的扫描电镜照片；图3为不同糖基化纳米纤维对蛋白质的吸附分离效果图。具体实施方式本发明中丙烯腈基共聚物均采用水相沉淀聚合法合成，其粘均分子量采用粘度法中的一点法测定；共聚物中羟基含量采用氢核磁共振谱测定；纳米纤维的直径采用场发射扫描电镜测量；糖基化纳米纤维表面糖基含量通过重量法计算测定；糖基化纳米纤维对蛋白质的分离采用紫外一可见光分光光度计测定。用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备实施例1将质量分数为6%的丙烯腈/甲基丙烯酸羟乙酯共聚物(PANCHEMA，粘均分子量为8.0万，羟基摩尔含量为10.1%)溶于二甲基甲酰胺溶剂中，在纺丝电压为8千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为152±24纳米的PANCHEMA纳米纤维。将15毫克PANCHEMA纳米纤维浸入15毫升葡萄糖五乙酸酯的二氯甲烷溶液中，葡萄糖五乙酸酯的用量与PANCHEMA纳米纤维表面羟基的摩尔比为1，在氮气保护下加入三氟化硼乙醚络合物，其加入量与所用糖单体的摩尔比为3。，冰水浴中振荡2小时，然后在室温下振荡反应20小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘千，得到葡萄糖五乙酸酯修饰的纳米纤维。将该纤维浸入10毫升0.1摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应60分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗涤，烘干，得到葡萄糖糖基化的亲和性纳米纤维，糖基固定化率为7.6毫克/克纤维。实施例2将质量分数为6%的PANCHEMA(粘均分子量为15.0万，羧基摩尔含量为10.1%)溶于二甲基甲酰胺溶剂中，在纺丝电压为15千伏、喷丝头溶液流速为1.0毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为367土28纳米的PANCHEMA纳米纤维。将15毫克PANCHEMA纳米纤维浸入15毫升葡萄糖五乙酸酯的二氯甲烷溶液中，葡萄糖五乙酸酯的用量与PANCHEMA纳米纤维表面羟基的摩尔比为30，在氮气保护下加入三氟化硼乙醚络合物，其加入量与所用糖单体的摩尔比为5。冰水浴中振荡2小时，然后在室温下振荡反应20小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘干，得到葡萄糖五乙酸酯修饰的纳米纤维。将该纤维浸入10毫升0.1摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应60分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗涤，烘干，得到葡萄糖糖基化的亲和性纳米纤维，糖基固定化率为49.7毫克/克纤维。实施例3将质量分数为4%的PANCHEMA(粘均分子量为15.0万，羧基摩尔含量为10.1%)溶于二甲基亚砜溶剂中，在纺丝电压为15千伏、喷丝头溶液流速为1.0毫升/小时、接收距离为8厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为205土26纳米的PANCHEMA纳米纤维。将15毫克PANCHEMA纳米纤维浸入15毫升葡萄糖五乙酸酯的二氯甲烷溶液中，葡萄糖五乙酸酯的用量与PANCHEMA纳米纤维表面羟基的摩尔比为30，在氮气保护下加入三氟化硼乙醚络合物，其加入量与所用糖单体的摩尔比为5。冰水浴中振荡2小时，然后在室温下振荡反应20小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘干，得到葡萄糖五乙酸酯修饰的纳米纤维。将该纤维浸入10毫升0.1摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应90分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗涤，烘干，得到葡萄糖糖基化的亲和性纳米纤维，糖基固定化率为55.3毫克/克纤维。实施例4将质量分数为8%的PANCHEMA(粘均分子量为30.0万，羧基摩尔含量为10.1%)溶于二甲基亚砜溶剂中，在纺丝电压为25千伏、喷丝头溶液流速为2.0毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为942土37纳米的PANCHEMA纳米纤维。将15毫克PANCHEMA纳米纤维浸入15毫升葡萄糖五乙酸酯的二氯甲烷溶液中，葡萄糖五乙酸酯的用量与PANCHEMA纳米纤维表面羟基的摩尔比为50，在氮气保护下加入三氟化硼乙醚络合物，其加入量与所用糖单体的摩尔比为5。冰水浴中振荡2小时，然后在室温下振荡反应20小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘干，得到葡萄糖五乙酸酯修饰的纳米纤维。将该纤维浸入10毫升0.1摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应90分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗涤，烘干，得到葡萄糖糖基化的亲和性纳米纤维，糖基固定化率为41.5毫克/克纤维。实施例5将质量分数为4%的丙烯腈/丙烯酸羟乙酯共聚物(PANCHEA，粘均分子量为8.0万，羧基摩尔含量为17.8%)溶于二甲基甲酰胺溶剂中，在纺丝电压为12千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为IO厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为108±25纳米的PANCHEA纳米纤维。将15毫克PANCHEA纳米纤维浸入7.5毫升甘露糖五乙酸酯的二氯甲垸溶液中，甘露糖五乙酸酯的用量与PANCHEMA纳米纤维表面羟基的摩尔比为50，在氮气保护下加入三氟化硼乙醚络合物，其加入量与所用糖单体的摩尔比为5。冰水浴中振荡3小时，然后在室温下振荡反应24小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘干，得到甘露糖五乙酸酯修饰的纳米纤维。将该纤维浸入10毫升0.1摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应90分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗涤，烘干，得到甘露糖糖基化的亲和性纳米纤维，糖基固定化率为67.7毫克/克纤维。实施例6将质量分数为4%的PANCHEA(粘均分子量为15.0万，羧基摩尔含量为5.3%)溶于二甲基甲酰胺溶剂中，在纺丝电压为15千伏、喷丝头溶液流速为1.0毫升/小时、接收距离为20厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为206士20纳米的PANCHEA纳米纤维。将15毫克PANCHEA纳米纤维浸入7.5毫升半乳糖五乙酸酯的二氯甲烷溶液中，半乳糖五乙酸酯的用量与PANCHEMA纳米纤维表面羟基的摩尔比为10，在氮气保护下加入三氟化硼乙醚络合物，其加入量与所用糖单体的摩尔比为3。冰水浴中振荡3小时，然后在室温下振荡反应24小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘干，得到半乳糖五乙酸酯修饰的纳米纤维。将该纤维浸入10毫升0.1摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应90分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗涤，烘干，得到半乳糖糖基化的亲和性纳米纤维，糖基固定化率为17.1毫克/克纤维。实施例7将质量分数为2%的丙烯腈/丙烯酸羟乙酯共聚物(PANCHPA，粘均分子量为8.0万，羧基摩尔含量为17.8%)溶于二甲基亚砜溶剂中，在纺丝电压为12千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为71±24纳米的PANCHPA纳米纤维。将15毫克PANCHPA纳米纤维浸入15毫升乳糖八乙酸酯的二氯甲垸溶液中，乳糖八乙酸酯的用量与PANCHEMA纳米纤维表面羟基的摩尔比为50，在氮气保护下加入三氟化硼乙醚络合物，其加入量与所用糖单体的摩尔比为3。冰水浴中振荡2小时，然后在室温下振荡反应20小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘干，得到乳糖八乙酸酯修饰的纳米纤维。将该纤维浸入10毫升0.2摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应90分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗漆，烘干，得到乳糖糖基化的亲和性纳米纤维，糖基固定化率为46.1毫克/克纤维。实施例8将质量分数为2%的PANCHEMA(粘均分子量为15.0万，羧基摩尔含量为10.1%)溶于二甲基乙酰胺溶剂中，在纺丝电压为15千伏、喷丝头溶液流速为1.0毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为161±27纳米的PANCHEMA纳米纤维。将15毫克PANCHEMA纳米纤维浸入15毫升麦芽糖八乙酸酯的二氯甲烷溶液中，麦芽糖八乙酸酯的用量与PANCHEMA纳米纤维表面羟基的摩尔比为30,在氮气保护下加入三氟化硼乙醚络合物，其加入量与所用糖单体的摩尔比为5。冰水浴中振荡2小时，然后在室温下振荡反应20小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘干，得到麦芽糖八乙酸酯修饰的纳米纤维。将该纤维浸入10毫升0.2摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应90分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗涤，烘干，得到麦芽糖糖基化的亲和性纳米纤维，糖基固定化率为39.7毫克/克纤维。实施例9将质量分数为6%的丙烯腈/甲基丙烯酸羟乙酯共聚物(PANCHPMA，粘均分子量为30.0万，羧基摩尔含量为5.3%)溶于二甲基乙酰胺溶剂中，在纺丝电压为20千伏、喷丝头溶液流速为1.0毫升/小时、接收距离为20厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为652±31纳米的PANCHPMA纳米纤维。将15毫克PANCHPMA纳米纤维浸入15毫升蔗糖八乙酸酯的二氯甲烷溶液中，蔗糖八乙酸酯的用量与PANCHEMA纳米纤维表面羟基的摩尔比为1，在氮气保护下加入三氟化硼乙醚络合物，其加入量与所用糖单体的摩尔比为5。冰水浴中振荡2小时，然后在室温下振荡反应20小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘干，得到蔗糖八乙酸酯修饰的纳米纤维。将该纤维浸入10毫升0.2摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应90分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗涤，烘干，得到蔗糖糖化基的亲和性纳米纤维，糖基固定化率为5.7毫克/克纤维。二、可用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的应用实例1、可用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维对伴刀豆球蛋白的选择性吸附分离将实例1和3制备的糖基化纳米纤维(固定化率见表1)10毫克分别浸入IO毫升蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中(pH7.4，0.1摩/升)，其中，蛋白质溶液为伴刀豆球蛋白/花生凝集素的混合溶液，浓度各为1毫克/毫升。在25'C下振荡吸附2小时后，将糖基化纳米纤维滤出。用1摩尔/升的葡萄糖溶液纳米纤维表面吸附的伴刀豆球蛋白洗脱下来，从而实现伴刀豆球蛋白和花生凝集素的分离。洗脱后的糖基化纳米纤维可以重复使用。2、可用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维对花生凝集素的选择性吸附分离将实施例6和7制备的糖基化纳米纤维(固定化率见表1)10毫克浸入10毫升蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中(pH7.4，0.1摩/升)，其中，蛋白质溶液为伴刀豆球蛋白/花生凝集素的混合溶液，浓度各为l毫克/毫升。在25""C下振荡吸附2小时后，将糖基化纳米纤维滤出。用1摩尔/升的半乳糖溶液把吸附的花生凝集素洗脱下来，从而实现伴刀豆球蛋白和花生凝集素的分离。洗脱后的糖基化纳米纤维可以重复使用。本发明实施例1~9制备的可用于蛋白质识别的糖基纳米纤维各性能参数如表l所示；不同糖基与其特异性识别的蛋白质对照表如表2所示；实施例l、3、6、7得到的可用于蛋白质识别的糖基纳米纤维对蛋白质的吸附分离效果图3所表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>a:与丙烯腈基共聚物纳米纤维表面羟基的摩尔数比。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1.一种用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)将丙烯腈基共聚物溶于溶剂中，配制成质量分数为2～8％的溶液，采用高压静电纺丝方法制备丙烯腈基共聚物纳米纤维，其中纺丝电压为8～25千伏，喷丝头溶液流速为0.5～2.0毫升/小时，接收距离为8～20厘米；2)将丙烯腈基共聚物纳米纤维浸入糖单体的二氯甲烷溶液中，在氮气保护下加入催化剂三氟化硼乙醚络合物，冰水浴中振荡2～3小时，然后在室温下振荡反应20～24小时，反应结束后经丙酮多次洗涤、烘干，得到表面固定乙酰糖基的丙烯腈基共聚物纳米纤维，其中丙烯腈基共聚物纳米纤维的加入量为1～2毫克纳米纤维/毫升溶剂，糖单体的用量与纤维表面羟基的摩尔比为1～50，三氟化硼乙醚络合物与所用糖单体的摩尔比为3～5；3)将表面固定乙酰糖基的丙烯腈基共聚物纳米纤维浸入0.1～0.2摩尔/升甲醇钠的甲醇溶液中，室温振荡反应60～90分钟，脱去糖基上的乙酰基保护基团，再经去离子水多次洗涤，烘干，得到可用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维。2、如权利要求1所述的一种用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备方法，其特征在于所述的丙烯腈基共聚物为丙烯腈/丙烯酸羟乙酯共聚物、丙烯腈/丙烯酸羟丙酯共聚物、丙烯腈/甲基丙烯酸羟乙酯共聚物或丙烯腈/甲基丙烯酸羟丙酯共聚物，它们的粘均分子量为830万，共聚物中羟基的摩尔含量为518%。3、如权利要求1所述的一种用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备方法，其特征在于所述的溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺。4、如权利要求1所述的一种用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备方法，其特征在于所述的静电纺丝得到的纳米纤维直径为601000纳米。5、如权利要求1所述的一种用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备方法，其特征在于所述的糖单体为葡萄糖五乙酸酯、甘露糖五乙酸酯、半乳糖五乙酸酯、乳糖八乙酸酯、麦芽糖八乙酸酯或蔗糖八乙酸酯。6、如权利要求1所述的一种用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备方法，其特征在于所述糖单体的用量为纤维表面羟基摩尔比为1030。7、一种如权利要求1所述方法制备的用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的应用，其特征在于糖基化纳米纤维应用于蛋白质的分离和纯化。全文摘要本发明公开了一种用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维的制备方法及应用。它以含有羟基基团的丙烯腈基共聚物为原料，采用静电纺丝的方法制备了直径可控的丙烯腈基共聚物纳米纤维。在三氟化硼乙醚络合物催化下，将乙酰基保护的糖单体固定到纳米纤维表面，再用甲醇钠的甲醇溶液脱去乙酰基基团，得到糖基化的亲和性纳米纤维。本发明结合纳米纤维高的比表面积，高的孔隙率以及糖基独特的生物功能，可将高固定化率的糖基化纳米纤维直接浸没在蛋白质溶液中，或多层叠合置于换膜过滤器中用于蛋白质的分离提纯。可用于蛋白质识别的糖基化纳米纤维具有制备方法简单、可多次重复使用、易于工业化生产等优点。文档编号C07K1/00GK101285221SQ20081006171公开日2008年10月15日申请日期2008年5月14日优先权日2008年5月14日发明者万灵书,徐志康,车爱馥申请人:浙江大学