专利名称：军曹鱼MHC-Ⅱβ基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种蛋白编码序列，尤其是涉及一种军曹鱼MHC-Iie基因序列。
背景技术：
MHC (major histocompatibility complex)即主要组织相容性复合体，是指染色体上由一系列紧密连锁的基因位点所组成的具有高度多态性的复合遗传系统或区域。是由MHC编码的一类细胞表面转膜蛋白，能结合并呈递内源抗原和外源抗原给T淋巴细胞。根据化学结构和功能的不同，MHC可分为MHC I类分子和MHC II类分子。其中，II类MHC分子呈递的抗原多是细胞外源性多肽，它在内质网内由a 、P和辅助分子Y链组装成完整三聚体，蛋白酶水解Y链，抗原多肽与II类MHC分子结合，形成稳定的II类MHC-多肽复合体，再运至细胞表面，外源性抗原在线粒体或溶酶体中与MHC II类分子结合后呈递给协助T淋巴细胞(Th，CD4+)，从而触发免疫反应。鱼类MHC II类分子是由a链和P链以非共价键的形式组成一个异二聚体。 MHC广泛参与免疫应答的诱导与调节，激发机体特异性免疫反应，在免疫学上具有极为重要的意义。由于MHC具有多态性、与疾病的相关性以及连锁不平衡性的特点，因此，了解鱼类MHC基因的结构与功能，寻找与疾病相关联的易感基因或疾病抵抗基因，对预防疾病具有很高的价值。此外，由于MHC的高度多态性，故可用于种群遗传学研究，并作为种群分子进化的标记之一。再者，MHC具有的多态性、与疾病的关联及其连锁不平衡等特点可以用来选育抗病品系。
发明内容
本发明的目的是提供一种军曹鱼腿C-II |3基因序列。 本发明通过以近源物种腿C-Iie基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到军曹鱼MHC-II P链基因的全表达序列；通过对MHC-II P基因设计有效地鉴定引物，从而可以通过半定量来分析该基因的组织分布情况，并运用荧光定量PCR对经LPS剌激后的脾脏中的MHCIie的表达量进行了分析。具体DNA核苷酸及相应的氨基酸序列如下 agagctctcaactcaccatcatggcttcatccttcgtctgcctctgcctcgtcttcatcg
〈 Leader peptide MASSFVCLCLVFI ctgcctecacagcagatggattcatgaatttcgcggtgggtcgctgtgacttteactcct
X P 1 domain AAYT^DGFMNFAVGRCDFNS ctgatccteaagacatcgagtecattcagtcttettettecaacgaactggagttcatca SDPKDIEYIQSYYYNELEFI ggttc3gC3gC3gtgtgggg皿gtttgttgg3tec3C3g3gcttgg3gtg皿g皿cgC3g
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X domain VRTVGLDYTAILTKSYEPSV 113 ggctgcactcgaccacgccccctetgggcaaacacccggccatgctggtctgcagcgtct 420 RLHSTTPPMGKHPAMLVCSV 133 acgacttcteccccaaatecatcagggtgagttggtgccgagatggacaggaagtggcct 480 YDFYPKYIRVSWCRDGQEVA 153 ctgatgtcagctccactgaggagctggctgacggcgactggtecteccagatccactctc 540 SDVSSTEELADGDWYYQIHS 173 acctggagtecacgcccaggtctggagagaagatctcctgtgtggtggagcacgccagcc 600 HLEYTPRSGEKISCVVEHAS 193 tgaaagaacctctggttettgactgggatccgtccatgcctgagtcagagagaaacaaaa 660
〉〈 CP/TM/CYT regi on LKEPLVIDW2PSMPESERNK 213 ttgccattggagcttcaggactgatcctgggtctgatcttetctctggctggattcatct 720 IAIGASGLILGLILSLAGFI 233 actecaagaggaaggcccgaggaaggatcctggttcccacteactgagccaggtcctgte 780 YYKRKARGRILVPTN* 248 tgctggacctggacctggacctggacctgcttctcagatggaagaaaatcagctgctgct 840 tteaactgcttcttgtttctcagtgctgccacttgttggaccagctgaacacctcagtct 900 ggtccaggactggrtctgacagtctgctggtcteaacctggtycatgaggtcacaggagt 960 cttgatcgggactctgacagtcctggaccaggttteatgtggactcacgtgtetcagctg 1020 gatctggactctgctgctttectgtgtgaatcaaaaccagatcagggctctggtgtcaaa 1080 tccttcatgatccagatgttttctecgctgtcatgt attta caateaaaaccaccagaaa 1140 c t c t g皿皿皿皿皿皿皿皿 1161 本发明的优点本基因的获得不仅为研究鱼类MHC-II |3类分子的作用机理以及MHC-II 13基因多态性与鱼体抗病力的关系奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为进一步研究MHC-Iie的免疫学功能奠定了基础提供理论基础。本基因为鱼类种群遗传学及进化遗传学研究提供材料，可用于种群遗传学研究，并作为种群分子进化的标记之一。同时可以进行抗病相关性及抗病辅助育种的研究。
图i是本发明在军曹鱼正常组织中的分布；
A.正常军曹鱼组织的腿CIie基因的组织表达
B. e-actin 1.头肾；2.皮肤；3.脾；4.肠；5.鳃；6.脑；7.心
图2是本发明经LPS剌激后军曹鱼脾脏组织中的MHC-II P基因随时间的表达变化图。
具体实施例方式
1.总RNA的提取 取健康的军曹鱼(体重约1000g)在养殖桶中养殖3日后，腹腔注射1ml的鲨鱼弧菌(JT2)。剌激192h后，解剖鱼体取出脾脏约250mg，放入-8(TC冰箱备用。取备用组织约lOOmg用剪刀剪碎加入1ml的Trizol (美国invitrogen公司)进行匀浆，按照试剂盒说明提取总RNA。 2. cDNA第一链的合成 取军曹鱼总RNA5iig与反转录引物(oligodT接头引物)1 (1Opmol/L)混合，65。C加热5min后，立即放置冰上静置2min，然后加入5Xbuffer， 10mmol/LdNTP混合液，Ribo皿clease Inhibitor, M-MLV反转录酶，反应体系为20 ii 1 。反应程序为37°C 、60min，最后放入-S(TC保存备用。
3.引物设计依据，引物合成的方法 从GenBank中下载近源物种(如人、鼠、虹鳟等)MHCII-e同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为460bp。引物设计后提交英骏生物工程技术服务有限公司进行DNA合成。
4.对军曹鱼MHC-II P基因cDNA全序列的克隆 以近源物种MHC-II 13基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为460bp。 以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。
根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(R即id Amplification of cDNA ends,RACE)对目的基因的3'和5'末端进行PCR扩增。
在3' RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。 在5' RACE中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly (C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再利用内侧引物和OligodG进行第二次PCR扩增。 所得到的PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用DNAStar软件进行拼接。 5.对军曹鱼MHC-II |3基因的测定 所得到的PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌T0P IO感受态细胞，挑取阳性克隆。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为军曹鱼MHC-II P基因同源序列。
6、MHC-Iie基因在不同组织中的RT-PCR分析 用引物肌动蛋白F和肌动蛋白R扩增P-actin为内参照，取健康的军曹鱼(185g) 心脏、脾脏、鳃、头肾、皮肤、心和脑等组织，设计特异性引物(J2BF， J2BR)对MHC-IIP的 cDNA进行特异性扩增。用13 -actin基因作为内参照(引物分别为P -ActinF， P -ActinR)， 扩增500bp左右的片段，调整各样品模板浓度。PCR反应参数为94t:预变性5min，然后 94t:变性50S，58t:退火50S，72t:延伸50S，共35个循环，然后72。C延伸10min。 PCR产物 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离检测。如图l所示，在正常大菱鲆组织中MHC-Iie基因 均扩增出约165bp的片段，其中较强的表达于鳃、脾、头肾、小肠中，中等程度表达于皮肤， 在心、脑中表达较弱。 7 、 RT-PCR检测MHC-II P mRNA的表达情况 提取经LPS剌激的不同时间点的脾脏组织RNA，利用合成的cDNA —链为模板进行 RT-PCR( P -ActinF2， P -ActinR2， J2BF， J2BR)，检测LPS剌激后的脾脏中表达调控规律。设 计|3 -actin引物(13 -ActinF2， P -ActinR2)。利用2—A ACT法计算相对表达量，如图2所示， 经LPS剌激后MHC-II 13基因表达呈现下降的趋势，并且在96小时后逐渐恢复到正常水平。 除96小时外，其余都具有显著性差异。
序列表 〈110〉中国水产科学研究院南海水产研究所 〈120〉军曹鱼MHC-II P基因序列 〈160>2 〈210>1 〈211>1161 〈212>RNA 〈213>军曹鱼(Rachycent皿canadium) 〈220〉 〈221>3， UTP 〈222〉 (768) . . (1161) 〈220〉 〈221>5， UTR 〈222〉 (1) . (20) 〈220〉 〈221>CDS 〈222>(21). . (767) 〈220〉 〈221>PolyA site 〈222〉 (1146) . (1161) 〈400〉 1 agagctctcaactcaccatcatggcttcatccttcgtctgcctctgcctcgtcttcatcg 60
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〈210>2
〈211>248
〈212>PRT
〈213>军曹鱼(Rachycentron canadium)
7
13 120
33 180
53 240
73 300
93 360
113 420 133
■ 153 540 173 600 193 660
213 720 233 780 248 840
■ 960
1020 1080
1140
〈400>2 GRILVPTN 248
权利要求
一种军曹鱼MHC-IIβ基因序列，其特征在于它的DNA核苷酸及相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
全文摘要
本发明公开了一种军曹鱼MHC-IIβ基因序列，它的DNA核苷酸及相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。本基因的获得不仅为研究鱼类MHC-IIβ类分子的作用机理以及MHC-IIβ基因多态性与鱼体抗病力的关系奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为进一步研究MHC-IIβ的免疫学功能奠定了基础提供理论基础。
文档编号C07K14/74GK101709302SQ20091021368
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者侯月娥, 冯娟, 徐力文, 王江勇, 苏友禄, 茅莉娜, 郭志勋 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所