专利名称：一种石斑鱼mhc iib基因及其克隆方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种石斑鱼MHC IIB基因及其克隆方法和 应用。
背景技术：
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)是在脊椎动物
中普遍存在的一类编码免疫球蛋白样受体的高度多态的基因群，该基因群在免疫系统中 具有重要作用，是近年来免疫方向研究的热点之一。MHC基因分为I型、II型和III型， II型基因又分为IIA和IIB。MHC II类基因编码产物是MHC II类分子，它们与外源性抗 原肽结合并递呈给T辅助细胞，引起下游的免疫应答。许多研究表明，MHCII基因的多 态性与个体的抗病能力密切相关。MHC II类分子是一个异源二聚体，由一条α多肽链和一条β多肽链组成。这 两条链都由两个核外区(α1/α2*β1/β2)、一个结合区、一个跨膜区和一个胞浆区组 成。α 1/β 1组成多肽结合区(Peptide Binding Region，PBR),具有高度多态性，其作用
是与抗原分解成的小肽结合，以将其递呈给T细胞；α 2/β 2组成的区域不具有高度多态 性，是MHC分子与T细胞结合的重要结构域。MHC II类分子具有高度多态性，尤其是在其多肽结合区 (peptide-bindingregion, PBR),该区域直接与抗原裂解成的抗原肽产生作用，进而引起 下游的免疫级联反应。MHC II的等位基因通常在PBR区域存在较高比例的非同义替换 (non-synonymous Substitution)。事实上，MHC在脊椎动物中是所有已知基因中表现出最 高多态性的一个基因，在人类的研究中发现仅一个基因座上就有超过500个等位基因。 MHC基因通过平衡选择来保持其多态性，MHC基因在遗传上具有连锁不平衡(linkage disequilibrium)和单元型(Haplotype)遗传两个特点。MHC分子的高度多态性具有深远的意义，它赋予种群适应多变的环境条件的能 力，实现对机体免疫应答的遗传控制，并使MHC成为个体的终身遗传标志。MHC的多 态性亦与个体抗病能力息息相关，在鸡、哺乳类、鱼类中都已发表MHC多态性与机体抗 病力相关性研究的文章。MHC多态性在系统进化的研究、种群保护的研究和遗传育种等 方面都是一个极其重要的材料，是当今MHC基因研究的一个热点。鱼类MHCII的α和β基因一般是连锁遗传的。目前已在超过30种硬骨鱼类中 克隆得到MHC基因并证明了其多态性，如斑马鱼、鲤鱼、大西洋鲑、牙鲆、条纹石鯧、 真鲷等。鱼类MHC基因功能与哺乳类相同，参与抗原递呈引起免疫级联反应。研究表 明，鱼类MHC基因中编码PBR结构域的基因片段(通常为MHC基因上的第二个外显子) 亦具有高度多态性，且与鱼类的免疫抗病能力密切相关。Kj0gIum等将7个家系约2000 尾的大西洋鲑以5种MHC I等位基因和4种MHC II等位基因组合并结合传统家系选育方 式筛选针对ISA(传染性贫血病)的抗病群体，成功筛选出有效的抗病基因型组合，这开创了使用MHC进行鱼类抗病辅助育种的先河。此后，在牙鲆、鲤鱼中也有类似研究被报 道。目前，国内外尚无任何关于石斑鱼MHC基因的研究被报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中对MHC基因的研究尚未完全的问题，提供 一种与石斑鱼抗病相关的石斑鱼MHC IIB基因。本发明另一目的在于提供上述石斑鱼MHC IIB基因上的等位基因。本发明另一目的在于提供上述石斑鱼MHC IIB基因编码的蛋白。本发明另一目的在于提供上述石斑鱼MHC IIB基因的克隆方法。本发明另一目的在于提供上述石斑鱼MHC IIB基因的序列多态性的检测方法。本发明还有一个目的在于提供上述石斑鱼MHC IIB基因的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种石斑鱼MHCIIB基因，其序列如SEQ ID NO: 1所示，该基因是通过同源克
隆的方法从斜带石斑鱼脾脏中分离得到的。所述基因中至少存在12个不同的等位基因， 其核苷酸序列如SEQ IDNO 3 14所示。上述石斑鱼MHC IIB基因所编码的蛋白，其氨基酸序列SEQ ID NO 2所示， 共249个氨基酸，等电点为6.53，分子量为28.31千道尔顿，石斑鱼MHC IIB蛋白主要 分为4个结构域，分别是Exonl编码的信号肽(SP)、Εχ0η2编码的多肽结合区(即β 1 结构域，PBR)、Εχοη3编码的IGcl区(即β 2结构域)与Εχοη4和部分Εχοη5编码的 跨膜区。石斑鱼MHC IIB基因所编码的蛋白与大菱鲆、真鲷、虹鳟、斑马鱼、小鼠和人 MHC IIB基因所编码蛋白的同源性分别为74.0%、79.1%、58.4%,。55.2%、32.0% 和 31.5%。本发明石斑鱼MHC IIB基因的克隆方法包括如下步骤(1)提取石斑鱼总RNA，反转录得到CDNA第一条链，制备RACE PCR反应模 板；(2)根据不同物种MHC IIB的氨基酸序列的同源性设计简并引物，得到石斑鱼 MHC IIB基因的cDNA片段；所述简并引物的序列如SEQ ID NO 15 16所示；(3)根据所得片段设计引物进行RACE PCR,所述引物序列如SEQ IDNO: 17 22 所示，获得 1338bp 的 MHC IIB 全长 cDNA ；(4)根据与石斑鱼亲缘关系相近鱼类的已知MHC IIB外显子和内含子的分界位 点设计引物，进行内含子扩增，得到石斑鱼MHC IIB的全基因序列，所述引物如SEQ ID NO 23 30所示。本发明石斑鱼MHCIIB基因多态性研究，根据石斑鱼MHC IIB基因的第一外显 子上合成特异性上游引物EpcoMHC2bPl_F，序列如SEQ ID NO: 31所示，在第二外显子 的末端和第二内含子前端合成特异性下游引物EpcoMHC2bH_R，序列如SEQ ID NO: 32 所示；在45条不同石斑鱼个体中进行PCR扩增，挑取145个阳性克隆并送测序后，得到 MHC IIB基因PBR区域多态性的原始数据。测序结果表明，MHC IIB基因在石斑鱼中存 在两个不同位点，其分子量大小差异在于Intran 1的长度不同。其中一个位点的Intranl 大小为138bp，命名为DAB2;另一位点的Intronl大小在不同鱼种差异很大，但总是大于138bp，命名为DAB 1。在45条鱼145个阳性克隆中共存在12个不同序列，这表明在石 斑鱼MHC IIB基因中至少存在12个不同的等位基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO 3 14所示。其中10个等位基因属于DABl位点，2个等位基因属于DAB2位点。将10个 属于DABl位点的等位基因命名为EpcoDAB*l_01到EpcoDAB*l_10，将2个属于DAB2 位点的等位基因命名为EpcoDAB*2-01和EpcoDAB*2_02。上述石斑鱼MHC IIB抗病相关标记筛选，采用自然选择和人工感染途径获得 抗病群体和不抗病群体。在发病旺季，从养殖场收集发病后存活的个体，同时用病原 菌感染收集来的鱼苗，根据对病原菌感染的抵抗存活能力大小获得抗病群体和不抗病群 体。总共对81个个体的321个阳性克隆进行了测序，结果表明，有6种MHC基因型 高频率出现在抗病个体中，其中 EpcoDAB*l_01，EpcoDAB*l_02，EpcoDAB*l_04， EpcoDAB*l_05，EpcoDAB*2_01 和 EpcoDAB*2_02，所出现的频率分别为 14.81 %、 7.41%, 7.41%, 14.81%, 7.41%, 11.11 % 和 37.04%。上述石斑鱼MHC IIB抗病相关标记辅助育种的方法将在抗病群体中高频率出 现的MHC IIB基因型作为抗病相关MHC IIB基因标记，将携带这些抗病基因标记的亲鱼 进行繁殖，培育后代，分离后代中的MHC IIB基因，研究MHC IIB基因多态性，同时进 行病原微生物感染实验，研究抗病MHC IIB基因标记的遗传规律及其与鱼体抗病力的关 系，从中筛选出既含有抗病MHC IIB基因标记，抗病力又提高的鱼苗，进行多代繁殖和 培育后即可建立抗病新品种。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明采用功能基因组技术，在石斑鱼中筛选到抗病相关的MHC基因标记，初 步建立石斑鱼抗病MHC基因标记辅助育种技术，该技术操作简单、选育效率高，适宜在 所有海水养殖鱼类上推广应用，对石斑鱼抗病品种培育具有重要意义和应用价值。
图1是石斑鱼MHC IIB 12种不同的基因型在抗病群体中的分布频率。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1 1.石斑鱼脾脏总RNA的提取取健康斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)，2龄，体重约750g， 以 MS-222 (tricaine methanesulphonate)麻醉约lmin，经尾静脉取血后立即分离出脾脏。采
用Trizol试剂法提取获得石斑鱼脾脏总RNA，其OD260/280 = 1.85，电泳结果显示，28S rRNA，18SrRNA条带清晰，28S条带亮度为18S的两倍，表明所得总RNA未被蛋白质、 酚和基因组DNA污染，纯度高。2.CDNA第一链的合成取5 μ g斜带石斑鱼脾脏总RNA样品进行DNA酶处理以去除基因组DNA的污 染，与RNA Oligo dT(序列如SEQ ID NO: 33所示)混合，进行反转录，所的产物置于-20°C保存备用。3.引物设计从GenBank数据库中下载获得近源物种，如舌齿鲈(DQ821113)，牙鲆 (AY848955)和真鲷(AY190711)等MHC II B同源基因CDS序列，利用ClustalX软件进行 多序列比对，确定保守区，根据所确定保守区设计简并引物，扩增片段大小约为300bp。引物序列如SEQ ID NO 15 16所示。4.斜带石斑鱼MHC IIB基因cDNA全序列的克隆以实施例2合成的第一链cDNA作为模板，以简并引物进行PCR扩增，所得PCR 产物上样至1.8wt%琼脂糖凝胶，以低电压电泳分离DNA片段，从凝胶中纯化回收目的 产物。将纯化后的目的产物连接至pGEM-T Easy载体，转化DH5a大肠杆菌，挑选 阳性克隆测序。Blast同源分析表明，目的产物为MHC IIB基因的中间片段。根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术 (RapidAmplification ofcDNA ends, RACE)对目的基因的 3 ‘-禾Π 5 ‘-末端进行 PCR 扩增。 按照RACE试剂盒GeneRacerTM Kit说明书对斜带石斑鱼脾脏总RNA进行去磷 酸，去mRNA5'帽子结构，与RNA Oligo连接，最终通过反转录合成cDNA第一链。 用斜带石斑鱼MHC IIB cDNA的3 ‘-禾口 5 ‘ -RACE特异弓|物(MHOF2，MHC-F3和 MHC-R2，MHC-R3)禾Π GeneRacerTM Kit 的通用引物，以 GeneRacerTM Kit 反转录合成 的第一链cDNA为第一轮PCR模板，以稀释的第一轮PCR产物为第二轮PCR模板，扩增 MHC IIB cDNA 3'端和5'端片段，对所得到的PCR产物的回收纯化、连接T载体、转 化大肠杆菌、阳性克隆鉴定及DNA测序。测序所得序列再与简并引物扩增所得的序列利 用Clustal X软件进行拼接。特异引物序列如SEQIDNO 17 22所示。5.斜带石斑鱼MHC IIB基因组DNA全序列的获得从石斑鱼肝脏中提取其总DNA，使用海洋动物基因组提取试剂盒，用层析柱的 方法提取基因组DNA。根据其他亲缘关系相近鱼类的已知MHC IIB基因外显子与内含 子的分界点设计特异性引物(序列如SEQ ID NO 23 30)进行内含子的扩增。与其它 脊椎动物的MHC IIB基因组结构类似，石斑鱼MHC IIB基因组包含有5个外显子和4个 内含子，其中5个外显子的长度分别为74bp，273bp，282bp，114bp和595bp，而内含子 1，2，3和4的长度分别为192bp，273bp，118bp和108bp ；测定了全部5个外显子和4 个内含子的序列，获得了石斑鱼MHC IIB全基因序列。实施例2斜带石斑鱼MHC IIB基因序列多态性根据石斑鱼MHC IIB基因的第一外显子上合成特异性上游引物 EpcoMHC2bPl-F,序列如SEQ ID NO: 31所示，在第二外显子的末端和第二内含子前端 合成特异性下游引物EpcoMHC2bH_R，序列如SEQ ID NO 32所示；在45条不同石斑 鱼个体中进行PCR扩增，挑取145个阳性克隆并送测序后，得到MHC IIB基因PBR区 域多态性的原始数据。测序结果表明，MHC IIB基因在石斑鱼中存在两个不同位点， 其分子量大小差异在于Intron 1的长度不同。其中一个位点的Intronl大小为138bp， 命名为DAB2;另一位点的Intronl大小在不同鱼种差异很大，但总是大于138bp，命名为DAB1。在45条鱼145个阳性克隆中共存在12个不同序列，这表明在石斑鱼MHC IIB基因中至少存在12个不同的等位基因。其中10个等位基因属于DABl位点，2个 等位基因属于DAB2位点。将10个属于DABl位点的等位基因命名为EpcoDAB*l_01 到EpcoDAB*l_10，将2个属于DAB2位点的等位基因命名为EpcoDAB*2_01和 EpcoDAB*2-02。实施例3斜带石斑鱼MHC IIB基因抗病相关标记的筛选采用自然选择和人工感染途径获得抗病群体和不抗病群体。在发病旺季，从养 殖场收集发病后存活的个体，同时用病原菌感染收集来的鱼苗，根据对病原菌感染的抵 抗存活能力大小获得抗病群体和不抗病群体。总共对81个个体的321个阳性克隆进行了 测序，结果表明，有6种MHC基因型高频率出现在抗病个体中，其中EpcoDAB*l_01， EpcoDAB*l_02，EpcoDAB*l_04，EpcoDAB*l_05，EpcoDAB*2_01 和 EpcoDAB*2_02， 所出现的频率分别为 14.81%、7.41%, 7.41%, 14.81%, 7.41%, 11.11 %和 37.04% (图 1)。实施例4斜带石斑鱼MHC IIB基因抗病相关标记辅助育种方法将在抗病群体中高频率出现的MHC IIB基因型作为抗病相关MHC IIB基因标 记，将携带这些抗病基因标记的亲鱼进行繁殖，培育后代，分离后代中的MHCIIB基 因，研究MHC IIB基因多态性，同时进行病原微生物感染实验，研究抗病MHC IIB基因 标记的遗传规律及其与鱼体抗病力的关系，从中筛选出既含有抗病MHC IIB基因标记， 抗病力又提高的鱼苗，进行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品种。将在抗病群体中高频率出现的MHC IIB基因型作为抗病相关MHC IIB基因标 记，通过对亲鱼MHC IIB基因型进行筛选，挑选出含有EpcoDAB*2-01和EpcoDAB*2-02 基因型的雌雄斜带石斑鱼亲鱼进行繁殖，培育后代。分离后代中的MHC IIB基因，研 究他们MHC IIB基因多态性，同时进行病原微生物感染实验，收集来的鱼苗，检测对病 原菌感染的抵抗存活能力。结果表明含有EpcoDAB*2-01和EpcoDAB*2_02基因型的鱼 苗，存活能力比有普通鱼苗增加27%，因此EpcoDAB*2-01和EpcoDAB*2_02可以作为 抗病MHC IIB基因标记，生产抗病力高的鱼苗，进行多代繁殖和培育后即可建立抗病新 品种。
权利要求
1.一种石斑鱼MHC IIB基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示。
2.根据权利要求1所述石斑鱼MHCIIB基因，其特征在于所述基因中至少存在12个 不同的等位基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3 14所示。
3.权利要求1所述石斑鱼MHCIIB基因编码的蛋白，其特征在于所述蛋白的等电点 为6.53，分子量为28.31千道尔顿，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.权利要求1所述石斑鱼MHCIIB基因的克隆方法，其特征在于所述方法包括如下 步骤(1)提取石斑鱼总RNA，反转录得到cDNA第一条链，制备RACEPCR反应模板；(2)根据不同物种MHCIIB的氨基酸序列的同源性设计简并引物，得到石斑鱼MHC IIB基因的cDNA片段；所述简并引物的序列如SEQ ID NO 15 16所示；(3)根据所得片段设计引物进行RACEPCR，所述引物序列如SEQ IDNO : 17 22 所示，获得1338bp的MHC IIB全长cDNA ；(4)根据与石斑鱼亲缘关系相近鱼类的已知MHCIIB外显子和内含子的分界位点设计 弓丨物，进行内含子扩增，得到石斑鱼MHC IIB的全基因序列，所述引物如SEQ ID NO : 23 30所示。
5.权利要求1所述石斑鱼MHCIIB基因序列多态性的检测方法，其特征在于所述方 法包括如下步骤根据石斑鱼MHC IIB基因的第一外显子上合成特异性上游引物，序列 如SEQ ID NO: 31所示，在第二外显子的末端和第二内含子前端合成特异性下游引物， 序列如SEQ ID NO: 32所示；在不同石斑鱼个体中进行PCR扩增，挑取阳性克隆测序， 得到MHC IIB基因PBR区域多态性的数据。
6.权利要求1所述石斑鱼MHCIIB基因的应用，其特征在于所述石斑鱼MHC IIB基 因用于标记辅助育种。
7.根据权利要求6所述石斑鱼MHCIIB基因的应用，其特征在于所述石斑鱼MHC IIB 基因用于标记辅助育种的方法如下将在抗病群体中出现的MHCIIB基因型作为抗病相 关MHC IIB基因标记，将携带这些抗病基因标记的亲鱼进行繁殖，培育后代，分离后代 中的MHCIIB基因，进行病原微生物感染实验，从中筛选出既含有抗病MHC IIB基因标 记、抗病力又提高的鱼苗，进行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品种。
全文摘要
本发明公开了一种石斑鱼MHC IIB基因及其克隆方法和应用。本发明石斑鱼MHC IIB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本发明通过同源克隆的方法，从石斑鱼中分离得到MHCIIB基因，鉴定出12种不同的MHC IIB基因型，对MHC IIB基因的多态性和抗病力之间的相互关系进行了分析，筛选出与石斑鱼抗病相关的MHCIIB基因的6种分子标记，适用于石斑鱼抗病相关标记的筛选和抗病品种的选育。
文档编号C07K14/74GK102010868SQ20101026294
公开日2011年4月13日 申请日期2010年8月24日 优先权日2010年8月24日
发明者刘晓春, 卢丹琪, 张勇, 张海发, 易诗白, 李水生, 林浩然, 王磊, 蒙子宁 申请人:中山大学