专利名称：Tt1基因在提高植物不饱和脂肪酸含量中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及TTl基因在提高植物不饱和脂肪酸含量中的 用途。
背景技术：
油莱是世界五大油料作物(大豆，棉籽，向日葵，油菜，花生)之一，分布十分广泛。 主要生产国有中国，加拿大和欧洲。目前我国油莱播种面积和总产均占世界三分之一，油菜 油也是我国的主要食用植物油源，占中国食用植物油的40%左右。油菜籽所含脂肪酸直接决定着菜籽油的品质和对人的营养价值。甘蓝型油菜的种 子油主要由6种脂肪酸组成，即棕榈酸(C16 0)、油酸(C18 1)、亚油酸(C18 2)、亚麻 酸018 3)、二十碳烯酸(C20 1)和芥酸(C22 1)。其中，棕榈酸属于饱和脂肪酸，而 油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸、芥酸均属于不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸是人体必需的 脂肪酸。棕榈酸不易消化吸收，人类过多食用，会造成肥胖和心血管疾病；油酸和亚油酸对 人具有营养价值，尤其是亚油酸是人体不能合成的，必须从膳食中补充；亚麻酸也是人体不 能合成的必需不饱和脂肪酸之一，但由于其不稳定性，极易氧化变质，易使油脂变劣，降低 油的营养价值和稳定性；芥酸对人体是有害的，在野生油菜品种中通常含量较高。目前中国推广的双低油菜品种中，普遍存在油酸含量偏低、亚麻酸含量偏高的问 题，由于缺乏相应的种质材料，尤其是低亚麻酸材料，使得油菜脂肪酸组成优化的品质育种 进展较为缓慢。研究表明，芥酸和亚麻酸、亚油酸之间分别呈极显著正相关和极显著负相 关。通过选择降低芥酸含量就可以降低亚麻酸含量，并使亚油酸含量有所增加。而油酸含量 和亚麻酸含量两者间呈极显著负相关，说明降低亚麻酸含量可以使油酸含量有所增加。这 些对比指标与油菜脂肪酸品质育种目标是一致的。现在，通过基因工程手段来改良油菜的 脂肪酸组分已取得了成功，已培育出高亚油酸、高油酸和无芥酸的油菜品种。另外，我国是世界上第二大能源消费大国，发展替代能源非常迫切。目前，以菜籽 油等为原料的生物柴油生产技术和使用在我国相继开发成功。生物柴油是一类脂肪酸甲酯，是植物油脂脱甘油后经过甲酯化而获得的一种环保 燃料，它的生产原料是可再生资源，燃烧生物柴油排放温室气体(例如二氧化碳)要比矿物 柴油减少60%。低芥酸菜油的脂肪酸碳链组成为16 18个碳，与柴油分子(15个左右的 碳链)碳数相近。因此，以低芥酸菜油为原料所制取的生物柴油是矿物柴油的理想替代品。尽管生物柴油具有巨大的发展空间，但其生产成本高，一直是阻碍该技术产业化 开发的一个世界难题。发展生物柴油的瓶颈是原料，即原料的量和价格。尽管许多木本油 料都可以加工为生物柴油，但规模有限。大豆、花生等草本油料作物与水稻、玉米等主要粮 食作物争地，扩大面积的潜力不大。而作为生物柴油的理想原料，油菜具有其独特的优势加拿大、澳大利亚、韩国、德国、法国、瑞典、奥地利等国确立油菜为优势替代生物 质能源原料作物，其中欧盟目前生产的生物柴油80%来自油菜原料(生产的油菜籽60%用 于生产生物柴油)。
按照当前油菜育种和生物质能源开发的主要目标，利用最新研究成果，克隆了一 批重要性状相关的功能基因，开展了基因工程创制油菜种子作为生物柴油原料关键技术的 系统研究，并提出了通过代谢工程途径进一步提高含油量，通过功能基因聚合育种培育具 有高油、高产、广适、多抗、适应轻型栽培等多种优异特性的“超级”油菜等一系列重要研究 课题，均取得实质性进展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为提高植物尤其是油料植物的不饱和脂肪酸含量的 转基因技术领域提供一种新的有效选择。本发明解决该技术问题的技术方案是提供了 TTl基因在提高植物不饱和脂肪酸 含量中的用途。其中，上述TTl基因的核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或者其简并序列；或O)在⑴限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同或相似的多肽。即也能提高植物 不饱和脂肪酸含量。进一步的，上述( 为在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加1个或 几个(10个以内)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同 或相似的多肽。本发明同时提供了 TTl基因编码的多肽在提高植物不饱和脂肪酸含量中的用途。上述用途中的TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其简并序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且能与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同或相似的多肽。进一步的，上述⑵为在⑴限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加1个或 几个(10个以内)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同 或相似的多肽。本发明还提供了一种培育具有高不饱和脂肪酸含量的植物的方法。该方法包括以 下步骤(1)将TTl基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成所述TTl基因的重组 载体；(2)将步骤(1)中的重组载体转入植物细胞中；(3)经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成高不饱和脂肪酸植株或其后代， 所述植物的后代包括植物种子及植物组织。上述方法中的TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其简并序列；或⑵在⑴限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且能与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同或相似的多肽。进一步的，上述⑵为在⑴限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加1个或几个(10个以内)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同 或相似的多肽。其中，上述植物可为一般的各种需要使用其组织中的不饱和脂肪酸的植物，比如 各种常见的油料作物，如常见的油菜、大豆、棉花、向日葵、芝麻、蓖麻、麻疯树、油菜或花生 等油料作物。本发明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，该 基因来源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥属(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)。上述的提高不饱和脂肪酸的含量可以为提高植物根、茎、叶花等各器官的不饱和 脂肪酸的含量，尤其是种子和果实中的不饱和脂肪酸的含量大大提高。在本发明中，“在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核 苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指编码具有SEQ ID NO. 1所编码的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同 氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 1同 源性低至约89%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 1所述的序列。另外，“在SEQ ID NO. 1 中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度 严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO. 1核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该 术语还包括与SEQID NO. 1中的核苷酸序列的同源性至少80 %，较佳地至少89 %，更佳地至 少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。在本发明中的相同功能是指提高植物的不饱和脂 肪酸含量。该术语还包括能编码具有与天然的SEQ ID NO. 1相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1 中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1 90个，较佳地1 60个，更佳地1 20个，最佳地1 10个)核苷酸的缺失、插入和/或 取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为 10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其编码的 多肽也能提高植物的不饱和脂肪酸含量。本发明所述重组载体，是将TTl基因插入到载体中获得，上述载体可选用本领域 已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如PBI121或pCAMBIA2301)。本发明用上述重组载 体转化宿主植物细胞，筛选获得转化细胞。然后将转化细胞培育成转基因高不饱和脂肪酸 植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况即线性DNA序列的某些部分能够 影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽 的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA ；如果启动子控制序 列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位 置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前 导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明的有益效果在于本发明提供了 TTl基因在提高植物不饱和脂肪酸含量方 面的用途。TTl基因可用于制备高植物不饱和脂肪酸含量的转化体，进一步培养高品质食用 型或新能源原料型的新型油料作物。在本发明的实施例中也通过实验证明转入了 TTl基因并过表达的油菜、大豆、棉花、向日葵、芝麻、蓖麻、麻疯树、油菜或花生等油料作物中，获得 过量表达TTl基因的上述油料作物的植株，结果表明不饱和脂肪酸含量提高，一些饱和脂 肪酸含量相对降低。表明TTl基因能有效的提高各种植物的不饱和脂肪酸含量。本发明培育出食用型或新能源原料型的新型油料作物的方法也简便而有效，具有 好的应用前景。
图1、TTl基因过量表达甘蓝型油菜的PCR电泳结果。图中从左至右依次为 Marker (Μ,片段大小依次为 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，待检测植株 1 4。
具体实施例方式下面通过实施例并结合附图，进一步说明而不限定本发明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的 常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实 施例中，所用甘蓝型油菜品种为蜀杂九号(四川大学生命科学学院保存)；所用农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciensp)采用 LBA4404 菌株、EHA105 菌株；大肠杆菌(E. coli)采用 DH5a菌株，菌株均购自于Qiagen公司。载体pBI 121、pCAMBIA1301购自于Clontech公司。 TA克隆试剂盒pUCm-T Vector Kit,Taq Polymerase，限制性内切酶，连接酶，DNA回收纯化 试剂盒均购于上海生工生物工程有限公司。其余化学实际均为市售分析纯。下述实施例中， "SEQ ID NO :1”单独出现时，本领域技术人员可理解其为“SEQ ID NO :1所示核苷酸序列” 的简称。实施例一TTl基因的克隆及获取以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方 法(见Clontech公司所公开的资料)，筛选到油菜中的一个EST序列(SEQ ID N0:2所示)， 再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE (见Takara公司所公开的资料)的方法获得本发明 所述的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。根据SEQ ID NO. 1所示核苷酸 序列设计引物上游引物(SEQID N0. 3) :5，-ATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID N0. 4) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。对PCR产物纯 化(见Qiagen公司所公开的PCR产物纯化资料)，经测序验证，得到SEQ ID NO. 1的基因序 列。实施例二 转TTl基因甘蓝型油菜的制备1、目的基因过量表达重组质粒构建根据SEQ ID NO 1所示核苷酸序列设计引物，上游引物(SEQID N0. 5) :5，-CGC GGATCCATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID N0. 6) :5，-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。
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经PCR，从油菜cDNA中扩增完整的SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，对PCR产物 纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，进行TA克隆，BamH I与Mc I酶切鉴定阳性重组 克隆。阳性克隆用BamHl与Mcl酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点=BamHl与 Mel)，获含SEQ ID NO :1的过量表达重组质粒。将含SEQ ID NO 1的过量表达重组质粒转 入农杆菌LBA4404中，利用下胚轴浸染的方法转化甘蓝型油菜(见步骤2)。2、胚轴浸染的方法转化甘蓝型油菜2-1、无菌苗的获取选取籽粒饱满的甘蓝型油菜种子，4°C过夜春化(保持种子发芽同步)，然后取出， 用70%乙醇浸泡30s，0. 的升汞(HgC12)溶液浸泡8-lOmin，无菌水冲洗5次，滤纸吸干， 接种于MS固体培养基上。置培养室中M°C，暗培养2-3天，然后取出光照16h/d继续萌发。 取5 7cm(约7 8天)无菌苗下胚轴作为转化受体。2-2、下胚轴的预培养将油菜下胚轴切成7mm左右小段，分散均勻置于预培养基(MS+^ig/L 6-BA，lmg/L 2，4-D，2. 5mg/L AgN03,19. 62mg/L乙酰丁香酮)中进行2 3天的预培养(可见下胚轴变 粗)。2-3、下胚轴的浸染及共培养挑取含SEQ ID NO 1的过量表达重组质粒的农杆菌，接种于含20mg/L链霉素， 50mg/L卡那霉素，40mg/L利福平的LB液体培养基中，28°C摇菌过夜后收集菌体，重悬于含 100mg/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中至0D600 = 0. 4 0. 6，摇菌1 2h。将经预培养的健壮的油菜下胚轴分别浸入含SEQ ID NO 1的过量表达重组质粒的 农杆菌菌液中30s lmin，此期间不断振荡使菌液与油菜下胚轴充分接触。用无菌滤纸迅 速吸干多余的菌液，将油菜下胚轴平放于共培养基(MS+ang/L 6-BA, lmg/L 2，4_D，2. 5mg/L AgN03,19. 62mg/L乙酰丁香酮)上，共培养2d。2-4、筛选培养与芽的诱导将共培养后的两种油菜下胚轴分别接入分化培养基(MS+aiig/L 6-BA, lmg/L 2， 4-D，2.5mg/L AgN03，19. 6aiig/L乙酰丁香酮)中继续培养。每2周更新培养基一次，培养4 周，得到愈伤芽。2-5、生根在筛选培养基(MS+2mg/L6-BA, 2. 5mg/L AgN03, 500mg/L 羧苄青霉素，lOmg/L 卡 那霉素)上待两种愈伤芽长至有4-6片真叶时，将芽从愈伤组织中切下，移入生根培养基 (1/2MS，0. 15mg/L NAA，250mg/L头孢霉素)中。待再生苗根系生长发达时，将培养罐移至室 外2 3d，然后将培养罐盖揭开，在培养室中炼苗2 3d。2-6、盆栽培养将含SEQ ID NO 1的过量表达转基因植株分别在生根培养基上发育出完整根系， 将其转入盆栽。3、转基因油菜的PCR检测待土壤中再生植株长大后，各取叶片少量用CTAB法抽提总DNA，以提取的DNA做模 板，分别进行PCR检测。目的基因过量表达甘蓝型油菜转基因株系检测上游引物(SEQID NO. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，；
下游引物(SEQID NO. 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后琼脂糖电泳检测，检测结果见图1，有目标条带出现则代表目的基因已转入甘 蓝型油菜。所检测出目的条带的大小和预期SEQ ID N0:1大小一致，约为860bp。制得SEQ ID NO 1核苷酸序列过量表达甘蓝型油菜植株和种子备用。实施例三转TTl基因甘蓝型油菜籽中脂肪酸含量的测定具体测定方法参见《油菜籽中脂肪酸含量的气相色谱分析》(《青海农林科技，2006 年第4期，王宁惠)。仪器美国安捷伦公司6890N气相色谱仪，包括氢火焰离子化检测器；北京中 惠普分析技术研究所SPA-300A型全自动氢气发生器；上海华爱色谱分析技术有限公司 TGA-2000A型低噪音空气泵。色谱柱美国安捷伦公司INN0WAX30m毛细管柱。柱箱温度初始温度175°C，保持 15min后程序升温，每分钟5°C至210°C，保持17min。汽化室温度240°C检测器温度250°C 载气氮气，进样量1 μ 1，分流比8 1。试剂石油醚，无水乙醚或苯、氢氧化钾、无水乙醇。配制成0. 4Ν氢氧化钾-甲醇 溶液；1 1石油醚-乙醚溶液。取油菜籽20粒，放入研钵中研磨粉碎。加入1 1石油醚-乙醚溶液3. 5ml，研 磨混合充分。将内溶物倒入5ml小离心管中，IOOOOrpm离心^iiin。移2ml上清至另一 5ml 小离心管中，加入ImlO. 4N氢氧化钾-甲醇溶液混勻，室温放置30min，加2ml蒸馏水摇勻， IOOOOrpm离心aiiin。吸取上清夜置于气相色谱样品瓶中将样品瓶按顺序放入自动进样器 中待用。甘蓝型油菜的种子油主要由6种脂肪酸组成，即棕榈酸(C16 0)、油酸(C18 1)、 亚油酸(C18 2)、亚麻酸(C18 3)、二十碳烯酸(C20 1)和芥酸(C22 1)，统计结果 如表1所示表1甘蓝型油菜籽脂肪酸含量统计表(单位％ )
权利要求
1.TTl基因在提高植物不饱和脂肪酸含量中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或者其简并序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同或相似的多肽。
3.TTl基因编码的多肽在提高植物不饱和脂肪酸含量中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或者其简并序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同或相似的多肽。
5.根据权利要求1或3所述的用途，其特征在于所述的植物为油料植物。
6.根据权利要求1或3所述的用途，其特征在于所述的油料植物为油菜、大豆、棉花、向 日葵、芝麻、蓖麻、麻疯树、油菜或花生。
7.培育高不饱和脂肪酸植物方法，其特征在于包括以下步骤(1)、将TTl基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成所述TTl基因的重组载体；O)、将步骤(1)中的重组载体转入植物细胞中；(3)、经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成高不饱和脂肪酸转基因植株或其后 代，所述植物的后代包括植物种子及植物组织。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或者其简并序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且与SEQ ID NO. 1的序列编码功能相同或相似的多肽。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述的植物为油料植物。
10.根据权利要求7或8或9所述的用途，其特征在于所述的油料植物为油菜、大豆、棉 花、向日葵、芝麻、蓖麻、麻疯树、油菜或花生。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及TT1基因在提高植物尤其是油料植物不饱和脂肪酸含量中的用途。本发明要解决的技术问题是为提高油料植物不饱和脂肪酸含量的转基因技术领域提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供了TT1基因在提高油料植物不饱和脂肪酸含量中的用途，经实验证明转入了TT1基因并过表达的油料植物，其种子的不饱和脂肪酸含量有了明显的提高。本发明培育出高不饱和脂肪酸含量油料植物的方法也简便而有效，为本领域提供了新的有效选择。
文档编号C07K14/415GK102140475SQ20101055252
公开日2011年8月3日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年1月28日
发明者杨毅 申请人:四川贝安迪生物基因工程有限公司