专利名称：一种甲胺磷人工抗原的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种甲胺磷人工抗原的制备方法，具体是采用重氮化法将甲胺磷与蛋白质分子偶联制备甲胺磷人工抗原的方法，属于免疫技术领域。
背景技术：
甲胺磷(Methamidophos，MTP)又名多灭灵，分子式=C2H8NO2PS,分子量141，化学名称0，S-二甲基氨基硫代磷酸酯。甲胺磷作为广谱高效的有机磷杀虫剂，曾广泛用于世界各地，主要用于小麦、水稻、棉花等农作物害虫的防治。国家农业部和国家发改委下达公告决定从2008年1月1日起停止甲胺磷生产，从根本上杜绝甲胺磷等5种高毒农药在国内的销售和使用。但是，这些农药在全国范围内仍然时有检出，已成为果蔬中农药残留的主体农药，由此导致的安全事件依然屡屡发生，对人体健康造成了极大的危害。因此很有必要建立适用于现场检测的快速、便捷的有机磷农药残留检测方法。目前对甲胺磷的检测方法主要有气相色谱(gas chromatography，GC)、薄层色ill (thin layer chromatography, TLC)、1 效液才画色i普(high performance liquid chromatography, HPLC)等。这些方法大多需要对被分析样品进行前处理，且操作复杂，不能满足现场快速检测的要求。开发特异性强、灵敏度高、方便快捷、安全廉价的新分析技术极为迫切。甲胺磷分子量141，属于小分子物质，不具备免疫原性。必需与载体蛋白偶联合成人工完全抗原才能进一步用于制备多克隆抗体。国家专利局2003年7月公开的申请号为03114895. 6的专利涉及一种适用于甲胺磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，对盒内试剂及测定方法进行了说明，但未涉及甲胺磷人工抗原的制备方法。国家专利局于2001年12月公开的申请号为01114706. 7的专利涉及一种甲胺磷人工抗原的制备，是将甲胺磷的前体产物0，S-二甲基硫化磷酰氯与蛋白质上的氨基基团直接偶联而获得人工抗原。2005年12月公开的申请号为200510126412. 0的专利也涉及一种甲胺磷半抗原、人工抗原及其制备方法，以0，S- 二甲基硫化磷酰氯为前体合成甲胺磷的结构衍生物(半抗原)该衍生物在保留甲胺磷结构的基础上引入桥结构和用于偶联大分子的活性基团。但该发明制备人工抗原步骤较繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甲胺磷人工抗原的制备方法，为以后筛选出它的特异性抗体和建立免疫分析方法奠定基础。本发明选用重氮化法，在弱酸环境下，利用亚硝酸盐先将甲胺磷分子上的氨基转化为重氮基团，再在碱性环境中利用重氮基团与蛋白质上的羧基反应将甲胺磷小分子与蛋白质分子偶联。在重氮键合成时，保持微酸环境，重氮溶液加入到蛋白质溶液中，缓慢连续搅拌可以使其反应充分，增加偶联物的结合比。
本发明依次通过以下步骤实现
(1)将牛血清白蛋白BSA溶于pH9.0的硼酸盐缓冲液中，使BSA浓度达到0. 01 0. 03g/
mL ；
(2)将甲胺磷溶于0.01mol/L的HCl溶液中，使甲胺磷浓度达到0. 01 0. 05g/mL，冰浴，边搅拌边缓慢加入预冷的0. lmol/L亚硝酸钠溶液，直至淀粉碘化钾试纸变蓝，继续搅拌反应30 60min ；
(3)将步骤(2)溶液缓慢加入到步骤(1)溶液中，使牛血清白蛋白与甲胺磷的摩尔比为 1 500 1000，冰浴搅拌2h，4°C反应24h后，置于pH7. 4的磷酸盐缓冲液中透析3 5d，每 12h换一次透析液；最后冷冻干燥，即得到合成的甲胺磷人工抗原。上述方法中，蛋白质是牛血清白蛋白(BSA)，也可以用卵清蛋白(OVA)或辣根过氧化酶(HRP)代替。本发明的优点是采用重氮化法，操作简便，试剂价廉，比一般方法节省成本15%， 并且一步完成反应，人工抗原制备的效率提高3 % 5 %。
具体实施例方式实例1
取IOOmgBSA溶于IOmL pH9. 0的硼酸盐缓冲液中；
取IOOmg甲胺磷溶于IOmL 0. 01mol/L的HCl溶液中，冰浴，边搅拌边缓慢加入预冷的 0. lmol/L NaNO2溶液，直至淀粉碘化钾试纸变蓝，继续搅拌反应30min ；然后将该溶液缓慢加入到BSA溶液中，冰浴搅拌》i，4°C反应24h后，置于pH7. 4的磷酸盐缓冲液中，透析3d， 每1 换一次透析液，最后将透析液冷冻干燥即得合成的甲胺磷人工抗原(简称MTP-BSA)。根据测得的紫外吸光值，计算各个结合物的结合比，并根据测得的磷含量计算各个偶联物的浓度。经过计算，MTP-BSA中分子的结合比为14. 17:1，可用于动物免疫。甲胺磷人工免疫抗原(MTP-BSA)与原载体蛋白BSA紫外图谱比较，MTP在221nm处有最大吸收峰，BSA在237. 5nm及276. 5nm处有最大吸收峰，而人工抗原MTP-BSA的最大吸收峰则位于229. 5nm及278nm处，偶联物与其前体物质有不同的紫外吸收特征。红外图谱比较，BSA的红外光谱呈现了蛋白质类的共有吸收，在3406 cm"1,1639 cm—1、1570CHT1处有酰胺结构的特征吸收；MTP的光谱在1206 cm—1、1044 cm—1及940CHT1处呈现甲氧基和硫氧基的特征吸收；而偶联物MTP-BSA在酰胺结构、甲氧基以及硫氧基的特征吸收带均有特征吸收， 说明偶联物MTP-BSA同时具备了 BSA和MTP的吸收峰，更进一步说明人工抗原合成成功。实例2:
取150mg0VA溶于IOmL pH9. 0的硼酸盐缓冲液中；
取200mg甲胺磷溶于IOmL 0. 01mol/L的HCl溶液中，冰浴，边搅拌边加入预冷的 0. lmol/L NaNO2溶液，直至淀粉碘化钾试纸变蓝，继续搅拌反应45min，然后将该溶液缓慢加入到BSA溶液中，冰浴搅拌》i，4°C反应24h后，置于pH7. 4的磷酸盐缓冲液中，透析5d， 每1 换一次透析液，最后将透析液冷冻干燥即得合成的甲胺磷包被抗原(简称MTP-0VA)。包被抗原(MTP-OVA)与MTP紫外扫描图比较，OVA在230. 5nm及278nm处有最大吸收峰，MTP在221nm处有最大吸收峰，MTP-OVA的最大吸收峰在227. 5nm及279nm处，与OVA 和MTP的最大吸收峰皆有偏移。OVA的红外光谱呈现了蛋白质类的共有特征吸收，MTP的光谱在1206 cm"1,1044 cm—1及940CHT1处呈现甲氧基和硫氧基的特征吸收；而偶联物MTP-OVA 在酰胺结构、甲氧基以及硫氧基的特征吸收带均有特征吸收，兼具蛋白质和甲胺磷的吸收特征，进一步说明人工抗原合成成功。实例3:
取300mgHRP溶于IOmL pH9. 0的硼酸盐缓冲液中；
取500mg甲胺磷溶于IOmL 0. 01mol/L的HCl溶液中，冰浴，边搅拌边加入预冷的 0. lmol/L NaNO2溶液，直至淀粉碘化钾试纸变蓝，继续搅拌反应60min，然后将该溶液缓慢加入到BSA溶液中，冰浴搅拌》i，4°C反应24h后，置于pH7. 4的磷酸盐缓冲液中，透析4d， 每1 换一次透析液，最后将透析液冷冻干燥即得合成的甲胺磷包被抗原(简称MTP-HRP)。酶标半抗原(MTP-HRP)与MTP紫外扫描图比较，HRP在206. 5nm处有最大吸收峰， MTP在220nm处有最大吸收峰，MTP-HRP的最大吸收峰在212nm处，与HRP和MTP的最大吸收峰皆有偏移。红外图谱中，偶联物MTP-HRP在酰胺结构、甲氧基以及硫氧基的特征吸收带均有特征吸收，兼具蛋白质和甲胺磷的吸收特征，进一步证明人工抗原合成成功。
权利要求
1.一种甲胺磷人工抗原的制备方法，其特征在于，依次通过以下步骤实现(1)将牛血清白蛋白BSA溶于pH9.0的硼酸盐缓冲液中，使BSA浓度达到0. 01 0. 03g/mL ；(2)将甲胺磷溶于0.01mol/L的HCl溶液中，使甲胺磷浓度达到0. 01 0. 05g/mL，冰浴，边搅拌边缓慢加入预冷的0. lmol/L亚硝酸钠溶液，直至淀粉碘化钾试纸变蓝，继续搅拌反应30 60min ；(3)将步骤(2)溶液缓慢加入到步骤(1)溶液中，使牛血清白蛋白与甲胺磷的摩尔比为 1 500 1000，冰浴搅拌2h，4°C反应24h后，置于pH7. 4的磷酸盐缓冲液中透析3 5d，每 12h换一次透析液；最后冷冻干燥，即得到合成的甲胺磷人工抗原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，牛血清白蛋白BSA用卵清蛋白OVA或辣根过氧化酶HRP代替。
全文摘要
一种甲胺磷人工抗原的制备方法，选用重氮化法，在弱酸环境下，利用亚硝酸盐先将甲胺磷分子上的氨基转化为重氮基团，再在碱性环境中利用重氮基团与蛋白质上的羧基反应将甲胺磷小分子与蛋白质分子偶联。在重氮键合成时，保持微酸环境，重氮溶液加入到蛋白质溶液中，缓慢连续搅拌可以使其反应充分，增加偶联物的结合比。本发明操作简便，试剂价廉，比一般方法节省成本15％，并且一步完成反应，人工抗原制备的效率提高3％～5％。
文档编号C07K14/77GK102241766SQ20111014980
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月7日 优先权日2011年6月7日
发明者朱开祥, 李垚辛, 杜小粉, 董全 申请人:西南大学