专利名称：表儿茶素没食子酸酯(ecg)单体的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种从绿茶原料中分离纯化表儿茶素没食子酸酯(ECG)单体的方法， 属于食品技术领域。
背景技术：
儿茶素类物质具有明显的抗衰老、防癌抗突变、去脂减肥、降低血糖、血脂和胆固醇、预防心血管疾病等药理功能，已广泛应用于食品加工、医药保健和日用化工等领域[1_3]。 2006年10月，美国食品和药物管理局(FDA)批准茶多酚作为新的处方药，用于局部(外部) 治疗由人类乳头瘤病毒引起的生殖器疣，这是FDA根据1962年药品修正案条例首个批准上市的植物(草本)SM。过去的二十年中，由于有关茶多酚/儿茶素的保健与药理功能研究的突破，不仅扩大了绿茶在国际市场上的份额，而且极大地推进了茶叶提取物产业的发展， 为茶叶功能成分的研究与开发奠定了良好的产业与市场基础，目前，我国已经形成年产约 5000吨茶多酚/儿茶素的产业规模。儿茶素粗品传统的提取分离工艺主要包括离子沉淀法、有机溶剂萃取法和吸附柱色谱法[5_7]。儿茶素药理保健功能研究与产业应用中最令人注目的是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素没食子酸酯 (ECG)，因而成为儿茶素单体分离、纯化与临床应用研究的焦点。但是由于茶叶的成分复杂， 从茶叶中制取高纯度的儿茶素单体具有相当难度。其技术难点是精细分离，同时还应防止有效物及茶叶赋有的天然风味不被破坏和损失，加工过程尽量采用低温。目前国内外比较成功的应用于EGCG单体分离制备的工艺主要包括高速逆流色谱萃取、模拟移动床色谱分离等技术^9]。国内外研究成果表明，ECG在抗氧化、清除脂质自由基、抑制人体病毒侵染方面作用显著；具有极强的抑菌活性，可望开发成为一种天然的类抗生素物质；也可明显改善创伤伤口愈合和瘢痕形成效果；同时，ECG还对星形胶质细胞损伤有明显的神经保护作用[1°~13]。张莹等用自制的制备型逆流色谱仪，以石油醚-乙酸乙酯-水(0. 2 1 2，ν/ν)为溶剂系统从儿茶素中分离纯化得到ECG单体，纯度达到98%[8]；黄永东等使用B型三带模拟移动床技术，以C18键合硅胶为固定相，乙醇与水(20:80，ν/ν)为流动相，采用Varicol工艺能得到纯度为91. 33%的ECG，回收率为91. 41%[9]，但上述两种方法分别存在Cw键合硅胶价格昂贵，有机溶剂用量大，分离平台(逆流色谱仪，移动床)装载量小等缺点，不适宜规模放大。迄今，国内外尚未有EGC单体产业化制备方面的报道。参考文献如下王婧，高玉堂.茶多酚抗癌的流行病学研究[J].肿瘤，2011，31(6): 553-556刘学铭，梁世中.茶多酚的保健和药理作用及应用前景[J].食品与发酵工业，1998，24(5) :47-51, 71Yokozawa Tx, Dong Ex, Nakagawa Tx, el al. In vitro and in vivo studies on the radical scavenging activity of tea [J]. J Agric Food Chem, 1998，46(6):2143-2150[4]黄芳华.从美国首个被批准植物药探讨中药药代动力学研究与评价策略[J]. 中国中药杂志，2010，35(7) :932-935黄思勇，金显平，康振兴，干国平.茶叶下脚料中茶多酚的提取纯化工艺研究[J].湖北中医药大学学报，2011，13(4): 30-32张盛，刘仲华，黄建安，刘爱玲，施兆鹏.吸附树脂法制备高纯儿茶素的研究 [J].茶叶科学，2002，22 (2) =125-130胡莉娟.绿茶中茶多酚的提取工艺研究[J].云南农业大学学报，2011， 26(3) :426-429Zhang Ying, Shi Zhao-peng, Nie Hong-yong, et al. Preparative Isolation and Purification of Catechins from Green Tea Extract by Preparative Counter-current Chromatography [J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Science), 2003, 29(5): 408-411， 417黄永东，江和源，江用文，等.传统SMB、Varicol和Partial-discard工艺分离纯化ECG和EGCG的比较研究[J],茶叶科学，2011，31 (3) =201-210Guo Q, Zhao BL, Li MF, et al. Studies on protective mechanisms of four components of green tea polyphenols against lipid peroxidation in synaptosomes biochim[J], Biophys Acta, 1996, 13 (3):210-222.Yoko Yanagawa, Yoshimasa Yamamoto, Yukihiko Hara, Tadakatsu Shimamura. A Combination Effect of Epigallocatechin Gallate, a Major Compound of Green Tea Catechins, with Antibiotics on Helicobacter pylori Growth In Vitro [J]. Current Microbiology, 2003， 47:244-249.Renata T. Abib, Andre' Quincozes-Santos, Patricia Nardin, et al. Epicatechin gallate increases glutamate uptake and SlOOB secretion in C6 cell lineage [J], Mol Cell Biochem, 2008， 310:153-158.Kapoor M, Howard R, Hall I et al. Effects of epicatechin gallate on wound healing and scar formation in a full thickness incisional wound healing model in rats [J], Am J Pathol, 2004， 165:299-307。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供从绿茶中分离纯化表儿茶素没食子酸酯单体的方法，该方法方法简便，没用毒性强的有机溶剂，制备周期短，成本低，符合环保和安全的要求，表儿茶素没食子酸酯单体的提取率及产品纯度高，适宜规模型工业化生产。本发明提供的技术方案是一种从绿茶中分离纯化表儿茶素没食子酸酯单体的方法，包括如下步骤
(1)提取绿茶原料中总儿茶素称取绿茶原料，加入Γ7BV乙酸乙酯后加热，间歇搅拌，回收乙酸乙酯，浓缩提取液，然后喷雾干燥，得到总儿茶素制品；
(2)分离酯型儿茶素与非酯型儿茶素加入纯水溶解总儿茶素制品配置成浓度为3% (w/v)的上柱料液，用吸附树脂柱分离纯化，解吸溶剂为乙醇，收集乙醇解吸馏分，用高效外循环浓缩回收乙醇，将浓缩的解吸馏分离心、喷雾干燥，得到干燥产品；(3)将上述第(2)步中的干燥产品用吸附树脂柱分离纯化加入纯水溶解所述干燥产品配置成浓度为3% (w/v)的上柱料液，用吸附树脂柱分离纯化，解吸溶剂为乙醇，收集乙醇解吸馏分，用高效外循环先浓缩回收乙醇至酒精度<5，再用反渗透膜进一步浓缩后离心喷雾干燥；
(4)将上述第(3)步干燥得到的产品用3、倍量(w/v)95%乙醇溶解，放置，结晶，过滤， 将晶体冷冻干燥得到的产品即为表儿茶素没食子酸酯单体。所述的方法，第(1)步中所述的绿茶原料为云南大叶种绿茶，加热的水浴温度 45°C 50°C，间歇30min搅拌5min ；称取绿茶原料后，用乙酸乙酯提取三次，每次提取时间为Ih，第一、二、三次加入的乙酸乙酯分为别7 BV、6BV、4BV，合并所有提取溶液，减压回收乙酸乙酯，浓缩至6 7个婆美度后用离心喷雾塔喷雾干燥，控制进风温度160°C 180°C， 排风温度70°C 80°C，一级旋风分离器每隔30min取出喷雾干粉，产品即为大叶种总儿茶素制品。所述的方法，第(2)中所述的用吸附树脂柱分离纯化，吸附树脂为D101，HP20、聚酰胺(Polyamide)或DM130之一；树脂用量为40倍总儿茶素制品的重量；上柱流速1.0 BV/h ；解吸先用2BV 25%乙醇解吸富含非酯型儿茶素馏分，再用2BV 60%乙醇解吸富含酯型儿茶素馏分，解吸流速均为1.0BV/h。所述的方法，第(3)中所述的用吸附树脂柱分离纯化，吸附树脂为HP2MGL、NKA-9、 AB-8或S-8之一，树脂用量40倍干燥产品重量；上柱流速3. 0 BV/h ；吸附完毕，用3BV的蒸馏水以同样流速淋洗除杂，解吸溶剂2BV 80%乙醇；解吸流速1. OBV/h。茶叶中的儿茶素分为酯型儿茶素(主要是EGCG和ECG)和非酯型儿茶素(主要是 EGC)两大类，本发明方法中第(2)步首先经吸附树脂柱色谱将酯型/非酯型两大类儿茶素分离开来，在该步骤中采用的树脂对于没食子酸酯集团有较强的吸附力；第(3)步再经另一类型的树脂将ECG和EGCG进行分离，本发明在该步骤中采用的树脂针对ECG和EGCG分子量、极性差异有选择吸附性。所述的方法，第(2)步和第(3)步中回收乙醇时温度控制在45°C以下，真空度控制在-0. OSMpa以下，第(3)步中反渗透膜浓缩时操作温度控制在40°C以下，进膜压力控制在 15 Bar以下。本发明具有以下有益效果
本发明方法联用乙酸乙酯提取，两种不同吸附树脂柱色谱吸附分离、反渗透膜浓缩与冷冻干燥技术，从云南大叶种绿茶原料中分离纯化表儿茶素没食子酸酯(ECG纯度>98%)单体，优化了产品分离纯化工艺流程，单体提取率及产品纯度高。产品具有抑菌，抗病毒等功效，并可显著改善创伤伤口愈合和瘢痕形成效果。也是许多功能食品开发的重要原料，可单独或者与维生素类、天然植物成分复配应用于保健食品、化妆品和药品等多个领域。本发明方法简便，制备周期短，成本低，符合环保和安全的要求，适宜规模型工业化生产。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。从云南大叶种绿茶原料中分离纯化表儿茶素没食子酸酯(ECG)单体的方法，包括如下步骤
1、乙酸乙酯提取绿茶原料中总儿茶素
称取云南大叶种绿茶原料(购自云南双江县，ECG含量为4. 10%),分别加入7 BV/6BV/4BV乙酸乙酯加热提取三次(lh/次，保持水浴温度45°C 50°C，间歇30min搅拌5min)，合并所有提取溶液，减压回收乙酸乙酯，后期加入纯水充分置换赶尽乙酸乙酯， 浓缩至6 7个婆美度后用离心喷雾塔喷雾干燥，控制进风温度160°C 180°C，排风温度70°C 80°C，一级旋风分离器每隔30min取出喷雾干粉，产品即为大叶种总儿茶素制品 (HPLC检测ECG含量为21. 08%)。HPLC检测ECG含量的方法可参考刘爱玲，张盛，杨伟丽.绿茶浸提动态研究初探[J].茶叶通讯，1999，(3): 32-35;何春雷，罗学平，陈强， 等.影响乙酸乙酯对茶多酚和儿茶素萃取效果的研究[J].食品研究与开发，2007，28 (1)四-33;邓燕莉，龚志华，胡雅蓓，等.乙酸乙酯萃取茶多酚的量效关系研究[J].分析测试学报，2009，28(10) 1115-1120。2、经Type-A吸附树脂柱色谱分离酯型儿茶素(ECG，EGCG)与非酯型儿茶素 (EGC)
加入纯水溶解大叶种总儿茶素制品配置成浓度为3% (w/v)的上柱料液，吸附树脂柱分离纯化(树脂用量40倍总儿茶素制品的重量；上柱流速1. 0 BV/h ；解吸先用2BV 25%乙醇解吸富含非酯型儿茶素馏分(主要含EGC)，再用2BV 60%乙醇解吸富含酯型儿茶素馏分 (主要含ECG和EGCG)，解吸流速均为1. OBV/h)。收集60%乙醇解吸馏分，用高效外循环浓缩回收乙醇(温度控制在45°C以下，真空度控制在-0. OSMpa以下)，浓缩至6 7个婆美度后离心喷雾干燥得到表儿茶素没食子酸酯粗品(HPLC检测ECG含量为40. 52%，检测方法可参考龚雨顺，刘仲华，黄建安，等.大孔吸附树脂分离茶儿茶素和咖啡因的研究[J].湖南农业大学学报，2005，31 (1): 50-52;张盛，刘仲华，黄建安，等.吸附树脂法制备高纯儿茶素的研究[J].茶叶科学，2002, 22(2): 125-130)。Type-A 吸附树脂为 D101，HP20、聚酰胺(Polyamide)或 DM130 之一。3、将上述表儿茶素没食子酸酯(ECG)粗品经Type-B吸附树脂柱色谱分离纯化 加入纯水溶解ECG粗品配置成浓度为3% (w/v)的上柱料液，吸附树脂柱分离纯化(树
脂用量40倍ECG粗品重量；上柱流速3. 0 BV/h ；吸附完毕，用3BV的蒸馏水以同样流速淋洗除杂。解吸溶剂2BV 80%乙醇；解吸流速1. OBV/h)。收集80%乙醇解吸馏分，用高效外循环先浓缩回收乙醇至酒精度<5 (温度控制在45°C以下，真空度控制在-0. OSMpa以下)， 再用反渗透膜进一步浓缩至6 7婆美度(操作温度控制在40°C以下，进膜压力控制在15 Bar以下)，离心喷雾干燥得到高含量表儿茶素没食子酸酯(HPLC检测ECG含量为80. 25%) 产品，检测方法可参考张盛，刘仲华，黄建安，等.高ECG型儿茶素纯化工艺研究[J].湖南农业大学学报，2003，29(2): 144-146;孙艳娟，朱跃进，李大伟，等.膜分离技术在香菇速溶茶开发中的应用研究[J].中国茶叶加工，2010，(4): 42-45。Type-B 吸附树脂为 HP2MGL、NKA-9、AB-8 或 S-8 之一。4、将上述高含量表儿茶素没食子酸酯(ECG >80%)产品用3、倍量(w/v) 95%乙醇溶解，4°C放置结晶处理，滤纸常压过滤后将晶体冷冻干燥，产品首先降温至-40°C预冻结，然后开始抽真空，真空度至30 时开始加热升华干燥，控制产品温度不超过20°C，干燥时长12 1他(具体操作可参考朱传江.冷冻干燥工艺原理及相关设备装置[J].齐鲁药事，2006，25(8): 503-504;徐成海，张世伟，关奎之，等.几种物料的冷冻干燥实验 [J].真空与低温，1998，4(3): 161-164;沈善明.热敏性药品的干燥[J].医药工程设计，2010，31(6): 1-4)，得淡黄色粉末状固体。 将上述淡黄色粉末状产品，与表没儿茶素没食子酸酯(ECG)标准品购自美国 Sigma-Aldrich 公司，C22H18Oltl, M. W. 442. 37，编号E3893，纯度彡 98% (HPLC)对照鉴定并经高效液相色谱法分析检测(具体鉴定、检测方法可参考丁平平，李延芳，宋航，等.儿茶素单体的分析方法比较[J].四川化工，2005，8 (4): 38-41 ；吴迪，杨丽珠，仇佩虹，等. 茶中儿茶素的分离分析方法研究进展[J].分析科学学报，2008，24(4): 468-472;刘婷，杨红梅，郭启雷，等.高效液相色谱法测定茶饮料中儿茶素[J].分析实验室，2009， 28: 277480 ；谷勋刚，蔡继宝，张正竹，等.HPLC-DAD分析红茶儿茶素类物质和咖啡因的方法研究[J].安徽农业大学学报，2010，37 (1): 5-10)，结果表明淡黄色粉末状固体分子量 442，(-) ESI-MS m/z :441 [Μ — ΗΓ，EGC 彡 98%，分子式为 C22H18O100
权利要求
1.一种从绿茶中分离纯化表儿茶素没食子酸酯单体的方法，其特征在于包括如下步骤(1)提取绿茶原料中总儿茶素称取绿茶原料，加入Γ7BV乙酸乙酯后加热，间歇搅拌，回收乙酸乙酯，浓缩提取液，然后喷雾干燥，得到总儿茶素制品；(2)分离酯型儿茶素与非酯型儿茶素加入纯水溶解总儿茶素制品配置成浓度为3% (w/v)的上柱料液，用吸附树脂柱分离纯化，解吸溶剂为乙醇，收集乙醇解吸馏分，用高效外循环浓缩回收乙醇，将浓缩的解吸馏分离心、喷雾干燥，得到干燥产品；(3)将上述第(2)步中的干燥产品用吸附树脂柱分离纯化加入纯水溶解所述干燥产品配置成浓度为3% (w/v)的上柱料液，用吸附树脂柱分离纯化，解吸溶剂为乙醇，收集乙醇解吸馏分，用高效外循环先浓缩回收乙醇至酒精度<5，再用反渗透膜进一步浓缩后离心喷雾干燥；(4)将上述第(3)步干燥得到的产品用3、倍量(w/v)95%乙醇溶解，放置，结晶，过滤， 将晶体冷冻干燥得到的产品即为表儿茶素没食子酸酯单体。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于第(1)步中所述的绿茶原料为云南大叶种绿茶，加热的水浴温度45°C 50°C，间歇30min搅拌5min。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于第(1)步中，称取绿茶原料后，用乙酸乙酯提取三次，每次提取时间为Ih，第一、二、三次加入的乙酸乙酯分为别7 BV、6BV、4BV，合并所有提取溶液，减压回收乙酸乙酯，浓缩至6 7个婆美度后用离心喷雾塔喷雾干燥，控制进风温度160°C 180°C，排风温度70°C 80°C，一级旋风分离器每隔30min取出喷雾干粉，产品即为大叶种总儿茶素制品。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于第(2)中所述的用吸附树脂柱分离纯化， 树脂用量为40倍总儿茶素制品的重量；上柱流速1. 0 BV/h ；解吸先用2BV 25%乙醇解吸富含非酯型儿茶素馏分，再用2BV 60%乙醇解吸富含酯型儿茶素馏分，解吸流速均为 1.OBV/ho
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于第(2)中所述的用吸附树脂柱分离纯化， 吸附树脂为D101，HP20、聚酰胺或DM130之一。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于第(3)中所述的用吸附树脂柱分离纯化， 树脂用量40倍干燥产品重量；上柱流速3. 0 BV/h ；吸附完毕，用:3BV的蒸馏水以同样流速淋洗除杂，解吸溶剂2BV 80%乙醇；解吸流速1. OBV/h。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于第(3)中所述的用吸附树脂柱分离纯化， 吸附树脂为 HP2MGL、NKA-9、AB-8 或 S-8 之一。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于第(2)步和第(3)步中回收乙醇时温度控制在45°C以下，真空度控制在-0. OSMpa以下，第(3)步中反渗透膜浓缩时操作温度控制在 40°C以下，进膜压力控制在15 Bar以下。
全文摘要
本发明公开了一种从绿茶中分离纯化表儿茶素没食子酸酯单体的方法，本方法以云南大叶种绿茶为原料，用乙酸乙酯直接提取，粗提物分别经过两种不同的吸附树脂柱色谱吸附洗脱，收集富含表儿茶素没食子酸酯(ECG)解吸馏分，高效外循环浓缩回收乙醇后再用反渗透膜低温浓缩，95%乙醇低温冷藏结晶，最终冷冻干燥得到98%表儿茶素没食子酸酯(ECG)单体。本发明方法简便，制备周期短，成本低，符合环保和安全的要求，适宜规模型工业化生产。
文档编号C07D311/62GK102432577SQ20111035388
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者刘仲华, 张盛, 李适, 李银花 申请人:湖南农业大学