肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法
【专利摘要】本发明公开了肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法，通过肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子CPAF(1-250)特异性抗原多肽，含该多肽的融合蛋白，其编码DNA，携带该DNA的重组载体，含该重组载体的转化子，产生抗体的方法，检测或测定抗体的方法和试剂，诊断肺炎嗜衣原体感染的方法和试剂。本发明可用于重组抗原的表达、医学临床病原微生物肺炎嗜衣原体感染者的诊断，特别是体外肺炎嗜衣原体诊断试剂的开发。
【专利说明】肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子CPAF(l-250)特异性抗原多肽，含该多肽的融合蛋白，其编码DNA，携带该DNA的重组载体，含该重组载体的转化子，产生抗体的方法，检测或测定抗体的方法和试剂，诊断肺炎嗜衣原体感染的方法和试剂。
【背景技术】
[0002]衣原体是一类严格的真核细胞内寄生具有独特发育周期并能通过细菌滤器的原核细胞型微生物，其中肺炎嗜衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis Ct)鹤踏热衣原体(Chlamydia psittaci)是重要的人类致病菌。而肺炎嗜衣原体(Chlamydia pneumoniae, Cpn)是于1989年确定的一种严格真核细胞内寄生的原核细胞型微生物，它是重要的人类致病菌，主要引起各种急慢性呼吸系统疾病，同时也是上、下呼吸道感染的重要病原体之一，肺炎和支气管炎最常见，也可引起上呼吸道感染如咽炎、喉炎、鼻窦炎。衣原体肺炎临床表现与其他非典型病原体如支原体、呼吸道病毒感染无明显特异性。衣原体肺炎早期多表现为上呼吸道感染症状，如鼻炎、咽喉痛、声音撕哑等；发热可伴肌痛、恶寒；这些症状持续数天到数周后好转，部分患者随后出现咳嗽(肺炎嗜衣原体感染呼吸道的主要特点)，及支气管炎、肺炎，表现为双阶段，延长了整个病程。衣原体肺炎区别与支原体肺炎的重要临床表现是大部分衣原体肺炎伴有喉炎；衣原体肺炎较肺炎链球菌肺炎更易有头痛。肺炎嗜衣原体主要引起人的非典型性肺炎，同时还可致支气管炎、咽炎、鼻窦炎、中耳炎、虹膜炎、肝炎、心肌炎、心内膜炎、脑膜炎、结节性红斑等疾病，也是艾滋病、白血病等继发感染的重要病原菌之一，另外，流行病学和病原学研究认为，肺炎嗜衣原体感染与心血管疾病相关，已引起各国学者的高度重视。
[0003]肺炎嗜衣原体感染在临床没有典型的表现，所以主要的诊断方法主要依靠实验室。可以通过病原体分离培养来直接检出，所以需要核酸检测和血清学实验。但由于肺炎嗜衣原体分离培养方法复杂、费时，而且敏感性不高，一般不用于临床诊断。所以临床上利用免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)，而衣原体蛋白酶样活性因子(chlamydialprotease-like activity factor,CPAF)做为在衣原体的致病过程中及衣原体与宿主的相互作用中发挥着重要蛋白，被认为是新颖的诊断分子蛋白。
[0004]衣原体蛋白酶 样活性因子(chlamydialprotease-like activity factor,CPAF)，是目前发现的唯一由衣原体合成并分泌到宿主细胞内的蛋白，在衣原体的致病过程中及衣原体与宿主的相互作用中发挥着重要作用。其存在于被感染的宿主细胞中而由衣原体基因组编码并依赖于衣原体的复制。CPAF具有降解宿主细胞RFX5、USF-1和裂解角蛋白8的蛋白水解活性并且具有很强的免疫活性，在致病过程中起着重要作用。CPAF发挥作用的方式可能代表了衣原体逃避宿主免疫识别从而造成持续感染的一种新机制。因此获得CPAF重组蛋白抗原可以用于的衣原体感染的诊断标准蛋白的研发。
【发明内容】
[0005]本发明所解决的技术问题在于提供一种肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法，以解决上述【背景技术】中的缺点。
[0006]本发明可用于重组抗原的表达、医学临床病原微生物肺炎嗜衣原体感染者的诊断，特别是体外肺炎嗜衣原体诊断试剂的开发。
[0007]为提高肺炎嗜衣原体感染的临床诊断的效率，提高特异性与灵敏度。筛选衣原体蛋白酶样活性因子蛋白序列，得到可能拥有特异性以及效好免疫原性的抗原多肽片段，并将其片段所编码的完整DNA片段构建于原核表达载体中进行重组诱导表达，并通过原核系统进行表达纯化得到蛋白。以及其后用免疫抗原制备单克隆抗体和多克隆，经纯化得到特异性抗体。
[0008]一种肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法，包括以下步骤:
[0009](1)抗原片段的获得:利用生物信息学方法，在开始的生物信息资源数据库上收集肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体以及鹦鹉热衣原体的衣原体蛋白酶样活性因子的同源蛋白质序列，运用多序列比对程序clustalw进行多序列比对分析，肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体以及鹦鹉热衣原体多种同源CPAF蛋白，寻找肺肺炎嗜衣原体最特异性的片段，随后进行抗原表位分析，寻找到了优势特异性CPAF的蛋白表达区段Metl-Ser250，并进一步做原核载体的构建与表达纯化；
[0010](2)抗原蛋白的获得:从CPAF编码基因调取相对应的基因核酸片段，总长度为750bp，并利用其进行亚克隆构建到原核表达重组质粒pGEX-4T-2中，通过调整诱导表达条件，确定蛋白质表达的最佳条件为:37度ImM IPTG诱导表达4小时之后可以收集菌体，并通过蛋白质纯化，得到高纯度的重组蛋白质，此蛋白质为N端谷胱转移酶融合蛋白，其重组蛋白通过SDS-PAGE鉴定纯度；
[0011](3)特异性抗体制备:将原核表达纯化得到的纯度大于95%的重组蛋白除去内毒素，再进行动物免疫，通过三次腹腔注射重组蛋白使小鼠对其产生免疫反应，取小鼠腹水纯化得到抗血清，经过进一步的纯化与分离得到多克隆抗体，将CPAF(l-250)特异性抗原免疫小鼠后，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经多次筛选获得阳性的单克隆细胞株，并进行腹水生产和单克隆抗体制备，采用ELISA技术和Western blot技术对制备的单克隆抗体和多克隆抗体进行效价以及特异性的评价，本发明涉及的特异性抗体效价大于I: 20000。
[0012]本发明还提供针对CPAF特异性抗原多肽制备单克隆抗体和多克隆抗体的方法，检测特异性抗体的方法，从而利用CPAF特异性抗原和抗体可检测肺炎嗜衣原体的感染。
[0013]附件I肺炎嗜衣原体CPAF蛋白优势抗原片段
[0014]SEQ-1D-NOl:
[0015]MKKGKLGAIVFGLLFTSSVAGFSKDLTKDNAYQDLNVIEHLISLKYAPLPWKELLFGWDLSQQTQQAR
[0016]LQLVLEEKPTTNYCQKVLSNYVRSLNDYHAGITYRTESAYIPYVLKLSEDGHVFVVDVQTSQGDIYLG
[0017]DEILEVDGMGIREAIESLRFGRGSATDYSAAVRSLTSRSAAFGDAVPSGIAMLKLRRPSGLIRSTPVRWR
[0018]YTPEHI⑶FSLVAPLIPEHKPQLPTQSCVLFRSGVNSQSSSSS
[0019]附件2肺炎嗜衣原体CPAF蛋白优势抗原位点分析
[0020]SEQ-1D-N02:119-DGHVFVVDVQTS-130, Score = 1.228 Length = 12[0021]SEQ-1D-N03:106-ESAYIPYVLKLS_117， Score = 1.176 Length = 12
[0022]SEQ-1D-N04:215-DFSLVAPLIPEHKPQLPTQSCVLFRSG-241 Score = 1.175 Length =27
[0023]SEQ-1D-N05:79-TNYCQKVLSNYVRSLNDY-96, Score = 1.166 Length = 18
[0024]SEQ-1D-N06:6-LGAIVFGLLFTSSVAGFS-23, Score = 1.156 Length = 18
[0025]SEQ-1D-N07:66-QARLQLVLEE_75，Score = 1.155 Length = 10
[0026]SEQ-1D-N09: 133-DIYLGDEILEV-143, Score = 1.058 Length = 11
[0027]SEQ-1D-N010: 195-PSGLIRSTPVRWR-207, Score = 1.092 Length = 13
[0028]SEQ-1D-N011: 179-FGDAVPSGIAMLKLR-193, Score = 1.088 Length = 15
[0029]附件3肺炎嗜衣原体CPAF基因编码DNA序列.SEQ-1D-N02:
[0030]ATGAAAAAAGGGAAATTAGGAGCCATAGTTTTTGGCCTTCTATTTACAAGTAGTGTTGCTGGTTTTT[0031 ]CTAAGGATTT GACTAAAGACAACGCTTATCAAGATTTAAATGTCATAGAGCATTTAATATCGTTAAA
[0032]ATATGCTCCTTTACCATGGAAGGAACTATTATTTGGTTGGGATTTATCTCAGCAAACACAGCAAGCT
[0033]CGCTTGCAACTGGTCTTAGAAGAAAAACCAACAACCAACTACTGCCAGAAGGTACTCTCTAACTA
[0034]CGTGAGATCATTAAACGATTATCATGCAGGGATTACGTTTTATCGTACTGAAAGTGCGTATATCCCTT
[0035]ACGTATTGAAGTTAAGTGAAGATGGTCATGTCTTTGTAGTCGACGTACAGACTAGCCAAGGGGATA
[0036]TTTACTTAGGGGATGAAATCCTTGAAGTAGATGGAATGGGGATTCGTGAGGCTATCGAAAGCCTTC
[0037]GCTTTGGACGAGGGAGTGCCACAGACTATTCTGCTGCAGTTCGTTCCTTGACATCGCGTTCCGCCG
[0038]CTTTTGGAGATGCGGTTCCTTCAGGAATTGCCATGTTGAAACTTCGCCGACCCAGTGGTTTGATCC
[0039]GTTCGACACCGGTCCGTTGGCGTTATACTCCAGAGCATATCGGAGATTTTTCTTTAGTTGCTCCTTT
[0040]GATTCCTGAACATAAACCTCAATTACCTACACAAAGTTGTGTGCTATTCCGTTCCGGGGTAAATTCA
[0041]CAGTCTTCTAGTAGCTCT
[0042]附件4肺炎嗜衣原体CPAF与沙眼衣原体与鹦鹉热衣原体同源蛋白序列比较.(I)Score= 196bits (499), Expect = 2e = 55, Method !Compositional matrix adjust.1dentities = 105/251 (42% ) ,Positives = 156/251 (62%), Gaps = 7/251 (3% ) (2) Score=252bits (644), Expect = 2e_76,Method:Compositional matrix adjust.1dentities =124/223(56% ), Positives = 157/223(70% ), Gaps = 1/223(0% )
[0043]附件5肺炎嗜衣原体CPAF构建方案序列.衡細.謝
【权利要求】
1.一种肺炎嗜衣原体特异性抗原多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)抗原片段的获得:利用生物信息学方法，在开始的生物信息资源数据库上收集肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体以及鹦鹉热衣原体的衣原体蛋白酶样活性因子的同源蛋白质序列，运用多序列比对程序Clustalw进行多序列比对分析，肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体以及鹦鹉热衣原体多种同源CPAF蛋白，寻找肺炎嗜衣原体最特异性的片段，随后进行抗原表位分析，寻找到了优势特异性CPAF的蛋白表达区段Metl-Ser250，并进一步做原核载体的构建与表达纯化；(2)抗原蛋白的获得；WCPAF编码基因调取相对应的基因核酸片段，总长度为750bp，并利用其进行亚克隆构建到原核表达重组质粒PGEX-4T-2中，通过调整诱导表达条件，确定蛋白质表达的最佳条件为:37度ImM IPTG诱导表达4小时之后可以收集菌体，并通过蛋白质纯化，得到高纯度的重组蛋白质，此蛋白质为N端谷胱转移酶融合蛋白，其重组蛋白通过过SDS-PAGE鉴定纯度；(3)特异性抗体制备:将原核表达纯化得到的纯度大于95%的重组蛋白除去内毒素，再进行动物免疫，通过三次腹腔注射重组蛋白使小鼠对其产生免疫反应，取小鼠腹水纯化得到抗血清，经过进一步的纯化与分离得到多克隆抗体，将CPAF(l-250)特异性抗原免疫小鼠后，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经多次筛选获得阳性的单克隆细胞株，并进行腹水生产和单克隆抗体制备。
【文档编号】C07K14/295GK103667318SQ201210323497
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年8月30日 优先权日:2012年8月30日
【发明者】易银沙, 曹蓬荣, 刘彩云 申请人:湖南能润医学诊断技术股份有限公司