专利名称：甲基阿魏酸在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体地说是甲基阿魏酸在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用。
背景技术：
肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是指肝组织内细胞外基质过度增生与异常沉积所致肝脏结构和功能发生异常改变的一种病理变化。几乎所有的慢性肝病，包括慢性乙型(丙型)病毒性肝炎、慢性酒精性与自身免疫性肝病等均经历这一病理过程，并随着肝纤维化的进一步发展，形成肝硬化，严重危害人类健康，寻找有效的预防与治疗肝纤维化的药物
意义重大。
蝶翼藤(Securidaca inappendiculata Hassk)为远志科远志族蝶翼藤属攀援灌木，是广西民族特色中草药，广西民间称五味藤、丢了棒、一摩消等。其根茎味辛、甘、苦，性微寒，有祛风湿、清热利尿、活血化瘀、消肿止痛的功效。现有报道表明，蝉翼藤具有较强的抗菌消炎、抗癌、抗病毒、抗HIV、免疫增强等多种活性，但至今未见到用从蝉翼藤中提取得到的甲基阿魏酸治疗肝纤维化疾病的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供甲基阿魏酸的新用途，即在制药中的应用。本发明的技术方案是一种甲基阿魏酸的新用途，它是用于治疗肝纤维化，即是将从蝉翼藤中提取出的甲基阿魏酸制成片剂、胶囊、颗粒或注射剂等剂型以治疗肝纤维化，其剂量为50-200mg/kg甲基阿魏酸/日，可分成2-3次服用。本发明所述甲基阿魏酸是从蝉翼藤茎皮提取得到的有机酸类化合物，其提取工艺为将蝉翼藤茎皮粉碎，95%乙醇回流提取3次一浸膏用100 200目硅胶拌样一以氯仿回流洗脱一洗脱液减压浓缩一中压硅胶色谱三氯甲烷乙醚(I 5)梯度洗脱一收集洗脱液，挥去溶剂得白色粉末结晶一再经重结晶和Si^phadex LH220凝胶柱色谱纯化(甲醇洗脱)—得到白色针状结晶。经结构鉴定为甲基阿魏酸，化学名为3，4- 二甲氧基-苯丙烯酸，分子结构式如下
H3CO %
TD八
H3CO^ W'ODOH
经体外细胞模型实验和在体的急、慢性动物模型实验表明甲基阿魏酸具有预防与治疗肝纤维化作用，体外细胞模型证实甲基阿魏酸对大鼠贮脂细胞株HSC-T6细胞增殖及胶原合成具有明显抑制作用；动物试验表明甲基阿魏酸对小鼠四氯化碳(CCL4)和D-氨基半乳糖(D-Gal)造成的急牲肝损伤具有保护作用，可以预防肝纤维化的发生；以CCL4K致的化学性肝纤维化大鼠模型和牛血清白蛋白所致的免疫性肝纤维化大鼠模型证实甲基阿魏酸对慢性肝纤维化具有较好的治疗作用。以上细胞与动物实验结果表明甲基阿魏酸具有确切的抗肝纤维化作用，可单方或复方用于制备预防和治疗肝纤维化的药物。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述
实施例I甲基阿魏酸对大鼠贮脂细胞株HSC-T6细胞的增殖和胶原合成的抑制作用的试验
将HSC-T6细胞用10%胎牛血清的DMEM培养基培养。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为I X 105/ml，每孔ΙΟΟμΙ，接种于96孔细胞培养板。37°C下置5%C02培养箱中培养24小时，去培养基，以含不同浓度药物(甲基阿魏酸终浓度为2. 5μ g/ml、5l·! g/ml、10l·! g/ml、20l·! g/ml,40yg/ml)的培养基孵育24小时，同时设立空白对照组，每一样品设5个复孔，然后每孔 加入MTT (5mg/ml) 20ul继续孵育4h，将培养基倒尽，吸干，每孔加入二甲亚砜200ul，混匀后置自动酶标仪(检测波长490nm)读取各孔光密度值，记录结果，并计算抑制率，结果见表I。按同样方法将生长良好的HSC细胞株接种于96孔培养板上，培养至细胞生长融合以消除细胞生长对胶原合成的影响后，通过3H-脯氨酸掺入法用液体闪烁计数仪测定样品放射性强度，计算甲基阿魏酸对HSC-T6细胞胶原合成的抑制率，结果见表I。表I.甲基阿魏酸对HSC-T6细胞增殖和胶原合成抑制率
甲基阿魏酸浓度|HSC-T6细胞增殖抑制率(％)|HSC-T6细胞胶原合成抑制率(％)
0~—O~0
Yl μ g/ml —41.11~22. 21
StTg/ml—49.06~ 30. 13
Τθ~μ g/ml— 56.92— 40.05
20~μ g/ml— 64. 70~61. 52
￥~μ g/ml 丨75· 67丨82· 87
由表I可看出，与空白对照组比较，甲基阿魏酸对HSC-T6细胞增殖和胶原合成均有明
显抑制作用，且随着甲基阿魏酸的浓度增高，对HSC-T6细胞增殖和胶原合成的抑制作用也
随之增强。对HSC-T6细胞增殖抑制率高，表明HSC-T6细胞的活力低；对HSC-T6细胞胶原
合成抑制率高，则表明HSC-T6细胞的胶原合成作用弱，而HSC-T6细胞与肝纤维化密切相
关，由此可见，甲基阿魏酸对肝纤维化的进程具有抑制作用。实施例2甲基阿魏酸对CCl4及D-Gal造成的急性肝损伤动物模型的影响的试验
I.药物和动物
I.I动物昆明种小鼠110只，雌雄各半，体重22±2g。1.2动物分组随机将动物分成11组，每组10只。第I组为正常动物对照组，其余各组为模型组。其中，第2、3、4、5、6组用CCL4造模，即使用CCl4致小鼠急性肝损伤；而第7、8、9、10、11用D-Gal造模，即用D-Gal致小鼠急性肝损伤。1.3治疗药物
(I)联苯双酯，此为传统保肝药，是经SFDA批准上市的药品，为用作阳性对照药。(2)甲基阿魏酸，为试验药物，观察其对小鼠急性肝损伤的保护作用。2.实施方案2.I剂量设置
第I组为正常对照组，第2组为CCL4模型对照组，第7组为D-Gal模型对照组。第I、
2、7组以溶媒灌胃，剂量为10ml/kg ；
第3、8组为联苯双酯治疗组，剂量为200mg/kg，作为甲基阿魏酸治疗组的阳性对照组；第4、5、6组和第9、10、11组依次分别为甲基阿魏酸低、中、高剂量治疗组，剂量依次分别为 50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。2.2给药方法
上述各组先按给药剂量灌胃2天，每天I次。第3天时，将第2、3、4、5、6组用O. 5%的CCL4-花生油以10ml/kg剂量腹腔注射I次，造急性CCL4肝损伤模型；第7、8、9、10、11组用D-Gal以800mg/kg剂量腹腔注射I次，建立急性D-Gal肝损伤模型。造模型后当天开始，各组改为每天灌胃2次，连续2天，剂量同上。2. 3观测指标
在造肝损伤模型48小时后，对试验小鼠取血和肝脏，按常规试剂盒方法测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性及肝组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Ρχ)等指标，这些指标均能反映肝损伤的情况，测定结果见表2。3.结果
表2甲基阿魏酸对急性肝损伤小鼠的血清学及肝功能指标的影响
权利要求
1.甲基阿魏酸在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用，其特征是所述甲基阿魏酸是通过将蝉翼藤茎皮粉碎，95%乙醇回流提取3次一浸膏用100 200目硅胶拌样一以氯仿回流洗脱一洗脱液减压浓缩一中压硅胶色谱三氯甲烷乙醚(I 5)梯度洗脱一收集洗脱液，挥去溶剂得白色粉末结晶一再经重结晶和Sephadex LH220凝胶柱色谱纯化得到的。
全文摘要
本发明涉及甲基阿魏酸在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用，根据体外细胞模型证实甲基阿魏酸对大鼠原代肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)增殖及胶原合成具有明显抑制作用；动物试验表明甲基阿魏酸对小鼠四氯化碳(CCl4)和D-氨基半乳糖(D-Gal)造成的急牲肝损伤具有保护作用，可以预防肝纤维化的发生；以CCL4所致的化学性肝纤维化大鼠模型和牛血清白蛋白所致的免疫性肝纤维化大鼠模型证实甲基阿魏酸对慢性肝纤维化具有较好的治疗作用，可单方或复方用于制备预防和治疗肝纤维化的药物。
文档编号C07C59/64GK102940621SQ20121048990
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者李勇文, 李丽, 李勇军, 容明智, 庞勇军, 黎荣, 程钰, 庞文箫 申请人:桂林医学院