神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法
【专利摘要】开发一种大量地制造与被形成在患者的脑的不溶性聚集体同质的不溶性聚集体的方法。本发明的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法包括:步骤（1），将来自神经退行性疾病的患者的脑的不溶性馏分植入在结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内；步骤（2），培养已植入所述不溶性馏分的所述培养细胞；步骤（3），从所述培养细胞萃取不溶性馏分。并且可能包括在培养细胞中增幅神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的步骤。
【专利说明】神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及人神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法、和通过该方法所制造的不溶性聚集体。具体为涉及在结构性地表达神经退行性疾病蛋白质的培养细胞内，通过重复将来自所述神经退行性疾病的患者的脑的不溶性馏分作为晶种，进而使其形成不溶性聚集体的步骤的不溶性聚集体的制造方法、和通过该方法所制造的不溶性聚集体。
【背景技术】 [0002]显示各种疾病的特征性细胞内包含体(聚集体)出现在多数的神经退行性疾病的患者的脑内。在阿尔茨海默病(AD)中被称为神经纤维缠结、在帕金森病(PD)中被称为路易氏体的病理结构物全部为包括各种蛋白质的不溶性聚集体。作为神经纤维缠结的主要组成成分的Tau、作为路易氏体的主要组成馏分的α突触核蛋白、以及作为被认定为肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis:ALS)的泛素阳性的细胞内包含体的主要组成成分的43kDa的TAR DNA结合蛋白质(TDP-43)被分别证实。这些在正常情况下作为可溶性蛋白质存在着，但在患者脑中则作为不溶性的异常的聚集体沉积着，且其机制至今仍不清楚。再者，由于表达这些聚集体的出现部位与神经细胞的脱落(细胞死亡)部位相关，因此，被推测为与出现在细胞内的这些聚集体具有细胞毒性，从而最终使神经细胞至死进而导致发病有关的机制。因此，被认为，通过细胞内聚集体的形成机制和聚集体去解明细胞死亡诱发机制等之事，能够对各种的神经退行性疾病的治疗药的开发等做出贡献。
[0003]为此，将于各种疾病的特征性细胞内聚集体再现于培养细胞内的体系构筑成为必要。但是，仅在细胞内表达过形成这些聚集体的蛋白质，从未出现于患者的脑中所见到的聚集体。近年，本申请的发明人们已确立了将用in vitro所制备的这些蛋白质的聚集体高效率地植入培养细胞内的方法(专利文献1、非专利文献I)。而且已表达:一旦将用in vitro所制备的所述聚集体植入事先已一时性地表达这些蛋白质的细胞内，则出现与在患者脑所见的细胞内聚集体其性质和形状类似的聚集体。这些聚集体仅为在细胞内一时性地表达该蛋白质的情况下，并不被完全认可，但一旦用in vitro所制备的所述蛋白质的聚集体被植入在所述细胞内，则该聚集体被形成为聚集的核，即成为晶种，由此在所述细胞中被形成为新的聚集体。
[0004]现有技术文献
[0005]专利文献
[0006]专利文献I国际申请第W02007/066809号公开公报
[0007]非专利文献INonaka，T.等、J.Biol.Chem.285:34885 (2010)
【发明内容】
[0008]发明需要解决的问题
[0009]由用in vitro所制备的所述蛋白质的聚集体被形成在细胞内的聚集体与伴随所述神经退行性疾病的发展所出现的不溶性聚集体毕竟不同。在此，为了再现所述神经退行性疾病的发病过程，需要开发再现将在所述神经退行性疾病的患者的脑内所形成的不溶性聚集体作为种，进而在细胞内形成聚集体的过程的实验体系。再者，为了详细地解析在细胞内形成聚集体的过程，需要大量地得到在患者的脑内所形成的不溶性聚集体。但是，由于在患者的脑内所形成的不溶性聚集体其量受限，因此，需要开发制备相同性质的不溶性聚集体的方法。
[0010]为解决以上问题的方法
[0011]本发明提供一种神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法，其包括:步骤(1)，其将来自神经退行性疾病的患者的脑的不溶性馏分植入在被结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内；步骤(2)，其培养已被植入所述不溶性馏分的所述培养细胞；步骤(3)，其从所述培养细胞中萃取不溶性馏分。
[0012]本发明的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法包括:步骤
(4)，其为在培养细胞中增幅神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的步骤，该步骤包括将从培养细胞中所萃取的不溶性馏分植入在结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内，且培养已植入所述不溶性馏分的所述培养细胞，并且从所述培养细胞中萃取不溶性馏分。
[0013]本发明的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法可能包括:步骤
(5)，其进一步至少I次连续重复所述步骤(4)。
[0014]本发明的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法中，其神经退行性疾病关联蛋白质有可能为从包括TAR、DNA结合蛋白质、α突触核蛋白、Tau蛋白质、β -淀粉样蛋白、多聚谷氨酰胺、SODl以及朊蛋白质的组中所选择。
[0015]本发明提供通过本发明的制造方法所获得的所述神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体。
[0016]本发明提供从生物学性试样制造神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的方法。其包括:
[0017]步骤(1)，其将从生物学性试样中所萃取的不溶性馏分植入在被结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内；步骤(2)，其培养已被植入所述不溶性馏分的所述培养细胞；步骤(3 )，其从所述培养细胞中萃取不溶性馏分。
[0018]本发明的从生物学性试样制造神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的方法包括:步骤(4)，其为在培养细胞中增幅神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的步骤，该步骤包括将从培养细胞中所萃取的不溶性馏分植入在结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内，且培养已植入所述不溶性馏分的所述培养细胞，并且从所述培养细胞中萃取不溶性馏分。
[0019]本发明的从生物学性试样制造神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的方法有时包括:步骤(5)，其进一步至少I次连续重复所述步骤(4)。
[0020]本发明提供通过从本发明的生物学性试样制造神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的方法所得到的来自生物学性试样的所述神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体。
[0021]本发明提供一种生物学性试样的细胞毒性的检查方法，其包括:将本发明的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体，或将来自所述神经退行性疾病的患者的脑的不溶性馏分植入在结构性地表达所述神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内的步骤；和定量化所述培养细胞的细胞死亡的程度的步骤。
[0022]一种神经退行性疾病的治疗候补药的筛选方法，其包括:将本发明的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体，或将来自所述神经退行性疾病的患者的脑的不溶性馏分植入在结构性地表达所述神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内的步骤；和使神经退行性疾病的治疗药的候补化合物接触所述培养细胞的步骤；以及将具有抑制所述培养细胞的细胞死亡的效果的所述候补化合物作为所述神经退行性疾病的治疗候补药进行筛选的步骤。
[0023]在本说明书中的神经退行性疾病是指于患者脑的神经细胞内的特征性的病理结构物，即为伴随由各种蛋白质组成的纤维性的不溶性聚集体的出现的疾病，现知为阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性症(frontotemporallobar degeneration:FTLD)、进行性核上性麻痹症(progressive p supranuclear palsy:PSP)、皮质基底节变性症(corticobasal degeneration:CBD)、皮克病(Pick)等。所述不溶性聚集体被推测为与成为细胞毒性的原因，从而最终使神经细胞至死进而导致发病有关。
[0024]在本说明书中的神经退行性疾病关联蛋白质，是指成为出现在神经退行性疾病的不溶性聚集体的主要结构成分的蛋白质。其被分别认定为在阿尔茨海默病中为微小管结合蛋白质之一的滔蛋白、在帕金森病中的α突触核蛋白以及在肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶变性症中的43kDa的TAR DNA結合蛋白质(TDP-43)。滔蛋白为分子量55~62kDa的蛋白质，且通过选择性 的链接存在着6种同源异构体。被划分为具有4个微小管结合部位的4重复滔蛋白和具有3个微小管结合部位的3重复滔蛋白。现知，伴随滔蛋白的蓄积的神经退行性疾病被统称为滔蛋白病(滔蛋白病变)，且依据疾病其蓄积的滔蛋白的同源异构体不同。6种所有的同源异构体蓄积在于AD中的聚集体PHF，但在、进行性核上性麻痹症(P SP)、皮质基底节变性症(C B D)等，被认定为主要蓄积4重复滔蛋白的聚集体。再者，在皮克病中，出现主要蓄积3重复滔蛋白的特征性的聚集体。之外，β_淀粉样蛋白、多聚谷氨酰胺、SODl以及朊蛋白也被包括在本说明书中的神经退行性疾病关联蛋白质中。
[0025]在本发明中，“结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞”，是指为将能够在各种的疾病中形成不溶性聚集体作为条件，其不妨为各种细胞类型的细胞。所述结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞，其优选为具有与神经细胞类似性质的细胞。其来自既可为来自当该疾病的患者的细胞，也可为来自与疾病无关而得到的细胞。所述结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞的来自，不妨为属于神经细胞的细胞系谱的细胞和来自神经细胞的细胞系谱的肿瘤细胞。虽包括KELLY、SH-SY5Y、SK-N-AS,SK-N-F USK-N-DZ.BE (2) -C,BE (2) - Ml7, SK-N-BE (2)、以及 SK-N-SH，但也并不限定于这些，有时也将神经母细胞瘤细胞系作为所述结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞来使用。所述结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞，不妨来自由具有IPS细胞、ES细胞、间充质干细胞的其它的多能性的干细胞被分化为神经细胞的细胞。或者，不妨为来自由神经细胞以外的细胞类型的细胞通过直接分化转换进而被分化的神经细胞的细胞。
[0026]在本发明中，“结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质”是指一时性或持久性地表达所有的神经退行性疾病关联蛋白质，也可在植入不溶性馏分时，将在众多的细胞中所表达的所述神经退行性疾病关联蛋白质之事作为条件，也不妨以任何方法去表达所述神经退行性疾病关联蛋白质。其包括电穿孔法、磷酸钙法、病毒载体法等的方法，但也并不仅限定于这些。其优选为在将外来DNA植入于细胞时不损伤细胞的脂质体转染法。用于这些方法的试剂不妨使用本领域技术人员已知的任何试剂。除在本说明书的实施例中已使用的X-tremeGENE9外,有时也使用FuGENE6、阳离子脂质体、脂质体转染试剂、MultiFectam等的在市场中出售的试剂。
[0027]在本说明书中的“不溶性馏分”是指不溶解在含有表面活性剂的水溶液的馏分。在本说明书中是指用十二烷基肌氨酸钠也不溶解，能够通过离心而沉淀分离的馏分。不溶性馏分或来自所述神经退行性疾病的患者的脑组织、或来自所述培养细胞。本发明的不溶性馏分有时为:来自所述脑的不溶性馏分和、将来自所述脑的不溶性馏分植入所述培养细胞，再经数日培养后所萃取的不溶性馏分和、将该不溶性馏分植入所述培养细胞，再经数日培养后所萃取的不溶性馏分、以及将不溶性馏分的植入和萃取经I次或2次以上重复所得到的不溶性馏分。
[0028]在本发明中，将不溶性馏分植入于结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞的步骤，不妨使用和实行任何的方法。其优选为在将不溶性馏分植入细胞时不损伤细胞的脂质体转染法。运用于这些方法的试剂也不妨使用本领域技术人员已知的任何试剂。除在本说明书的实施例中已使用的MultiFectam外，有时也使用X_tremeGENE9、F11GENE6、阳离子脂质体、脂质体转染试剂等的在市场中出售的试剂。在本发明中，来自不溶性馏分的神经退行性疾病和于细胞所表达的蛋白质关联的神经退行性疾病，有时为相同，但也有时为不同。
[0029]在本发明中，获得结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质之事和将不溶性馏分植入所述培养细胞之事，将起到与实施例同样效果作为条件，也不妨按比例增加培养容器和培养细胞数以及所植入的不溶性馏分的量。
[0030]在本发明中的细胞毒性的检查方法中，所说的细胞毒性是指细胞膜被破坏和细胞质流出于培养基之事。有时通过色素排出能力的丧失或，通常通过在局部存在于细胞质的LDH (乳酸脱氢酶)等的酶活性的培养基中的检出而定量。
[0031]在本发明中的筛选方法中，促进或抑制不溶性聚集体的形成的候补化合物包括由微生物、菌类、植物以及动物所制备的化合物和化学性所合成的化合物，但也不限定于这些。促进不溶性聚集体的形成的化合物，是为了加大神经退行性疾病的风险管理和解明疾病的病理机制的需要。抑制不溶性聚集体的形成的化合物，能够用于为了神经退行性疾病的预防、治疗、改善以及抑制病状的恶化等的有效的医药的开发。
[0032]本发明的神经退行性疾病关联蛋白质、培养细胞、不溶性馏分以及生物学性试样的动物种，将以植入的不溶性馏分作为聚集的核(晶种)，将由在培养细胞内所表达的神经退行性疾病关联蛋白质所形成的新的不溶性聚集体作为条件，则不妨为任何的动物种的组合。除人以外，有时也可从包括转基因动物创造出的模型动物，例如包括小白鼠、较大白鼠、兔子以及山羊等的哺乳 类和，可利用ES细胞的猕猴等的灵长类的组中所选择。在利用来自患者的脑的不溶性馏分的情况下，使用表达人神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞，但若为表达人神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞，则即使为来自人以外的动物种的细胞也无妨。例如，有时使用来自蛋白质激酶和蛋白水解酶等的基因敲除动物的培养细胞。
[0033]在本发明中的生物学性试样是指具有包括为了形成人神经退行性疾病关联蛋白质聚集体的成为核的不溶性馏分的可能性的所有生物学性试样。其包括含有脑脊液、血液、血浆、淋巴液、以及精液，但也不限于这些的体液和，含有脑、脊髓、骨髓、以及胸腺，但也不限于这些的脏器或组织。其优选的生物学性试样为脑或脑脊液。
[0034]在本发明中所言及的所有的文献其整体通过引用被收入在本说明书中。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]【图1-1】已植入来自ALS患者的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞的蛋白质印迹图。
[0036]【图1-2】已植入来自ALS患者的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞的蛋白质印迹图。
[0037]【图1-3】已植入来自ALS患者的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞的蛋白质印迹图。
[0038]【图2-1】已植入来自ALS患者的不溶性馏分的aS表达细胞的蛋白质印迹图。
[0039]【图2-2】已植入来自ALS患者的不溶性馏分的aS表达细胞的蛋白质印迹图。
[0040]【图3-1】为了检出通过来自ALS患者的不溶性馏分所蓄积的不溶性聚集体进而被免疫细胞化学染色的培养细胞的共聚焦显微镜照片。
[0041]【图3-2】为了检出通过来自ALS患者的不溶性馏分所蓄积的不溶性聚集体进而被免疫细胞化学染色的培养细胞的共聚焦显微镜照片。
`[0042]【图3-3】为了检出通过来自ALS患者的不溶性馏分所蓄积的不溶性聚集体进而被免疫细胞化学染色的培养细胞的共聚焦显微镜照片。
[0043]【图3-4】为了检出通过来自ALS患者的不溶性馏分所蓄积的不溶性聚集体进而被免疫细胞化学染色的培养细胞的共聚焦显微镜照片。
[0044]【图4-1】已植入来自DLB患者的不溶性馏分的aS表达细胞的蛋白质印迹图。
[0045]【图4-2】已植入来自DLB患者的不溶性馏分的aS表达细胞的蛋白质印迹图。
[0046]【图4-3】为了检出通过来自DLB患者的不溶性馏分所蓄积的不溶性聚集体进而被免疫细胞化学染色的培养细胞的共聚焦显微镜照片。
[0047]【图5-1】已植入来自PSP患者的不溶性馏分的HA-3R1N表达细胞的蛋白质印迹图。
[0048]【图5-2】已植入来自PSP患者的不溶性馏分的HA-4R1N表达细胞的蛋白质印迹图。
[0049]【图5-3】已植入来自CBD患者的不溶性馏分的HA-4R1N表达细胞的蛋白质印迹图。
[0050]【图5-4】已植入来自皮克病患者的不溶性馏分的HA-3R1N表达细胞的蛋白质印迹图。
[0051]【图6】表示已植入来自各种疾病的患者的不溶性馏分的培养细胞的细胞毒性实验的结果的条形图。
[0052]【图7-1】使用相对于HA信息标记的抗体所检出的已植入增幅用的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞的蛋白质印迹图。
[0053]【图7-2】使用相对于磷酸化TDP的抗体所检出的已植入增幅用的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞的蛋白质印迹图。
[0054]【图8】使用相对于ant1-409/410抗体所检出的，且由来自ALS患者的不溶性馏分的植入经I次、2次以及3次的增幅后的TDP表达细胞的不溶性馏分的蛋白质印迹图。
[0055]【图9】使用相对于ant1-409/410抗体所检出的，且在神经退行性疾病的治疗药的候补化合物存在下所增幅的不溶性馏分的蛋白质印迹图。
[0056]【图10】用在对照溶剂DMSO的存在下的增幅结果作为100%的百分率，去表示通过图9的各等相位区的不溶性聚集体的显象密度计所定量的结果的聚集体形成率的柱形图。
[0057]为了实施发明的方式
[0058]以下所说明的本发明的实施例仅将例示作为目的，并非限定本发明的技术性的范围。本发明的技术性的范围仅通过权利要求范围的记载所限定。将不脱离本发明的宗旨作为条件，能够进行本发明的变更，例如，能够进行本发明的结构要件的追加、删除以及置换。
[0059]实施例1
[0060]1.材料及其方法
[0061]1.1样品的获得
[0062]本实施例的实验在得到公益财团法人东京都医学综合研究所(原东京都精神医学综合研究所)的研究伦理委员会的许可后(许可号码:17-36，许可日期:2005年9月3日)进而进行了实施。
[0063]1.2来自脑样品的不溶性馏分的制备
[0064]从所述患者所采取的脑的冻结样品(0.5g)在5倍容量的A68缓冲液(IOmMTris (pH7.5)、0.8M NaClUmM EGTAUmM DTT)中使其均质化，从而作成悬浮液。在该悬浮液中添加最终浓度1%的N-月桂酰肌氨酸钠，在37°C条件下进行30分钟繁殖。将所述悬浮液进行离心分离(12，000g、10分钟、25°C条件下)，收回上清液。将所述上清液进一步离心分离(100，000g、20分钟、25 °C条件下)，得到了沉淀。将所述沉淀在PBS中使用Biomic7040Ultrasonic Processor装置(精工有限责任公司)进行超声波处理,然后将500 μ L左右的沉淀试样分别注入艾本德型试管内。再离心分离(100，00(^、20分钟、25°〇条件下)后，除去上清液，从而制备出了来自ALS患者的不溶性馏分。
[0065]1.3用于植入细胞的试样的制备
[0066]将PBS150y L添加在所述不溶性馏分中，使用VP-5S装置(TIETECH C0.，Ltd)进行超声波处理。经离心分离(2，300g、5分钟、25°C条件下)后收回上清液。为了植入于6孔细胞培养板的I个孔分的培养细胞内，所述上清液各5μ L被分别注入于1.5mL的艾克潘德道夫管内。然后在每该I根管内添加MultiFectam (Promega Ltd.) 62.5 μ L和Opt1-MEM (Life Tec hnologies Japan Ltd.)120 μ L,于室温 30 分钟繁殖。进一步添加所述0pt1-MEM62.5 μ L，于室温5分钟繁殖。所得到的细胞植入用试样的全量被植入在已接种在6孔细胞培养板的单一孔内的培养细胞。
[0067]1.4细胞培养
[0068]作为培养细胞，使用了神经母细胞瘤细胞系的SH-SY5Y细胞和在这些细胞一时性表达所望的蛋白质的转染子。SH-SY5Y细胞使用含有10%胎牛血清的细胞培养用培养基(D_MEM/F_12、Life Technologies Japan Ltd.)所培养。以下,在没有特别记载的情况下，SH-SY5Y细胞以及该转染子为在37°C、5%C02以及饱和水蒸气的条件下所培养。SH-SY5Y细胞于接种的翌日在孔中以为30%至50%融合的方式、被接种在市场出售的6孔细胞培养板内。
[0069]1.5转染子的制作
[0070]制作了 2种转染子细胞。一种称为(I)表达人α突触核蛋白(以下称之“a S ”)的SH-SY5Y细胞(以下称之“ a S表达细胞”);另一种称为(2)表达用HA已信息标记化的TARDNA结合蛋白质(以下、称之“HA-TDP”)的SH-SY5Y细胞(以下、称之“HA-TDP表达细胞”)。简明说来，准备了用于编码a S或HA-TDP的多核苷酸已被插入在pc DNA3载体的结构(Ueda.K等、Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.90:11282 (1993)、0u.SH 等、J Virol.3584:394 (1995))。将所述转染子 I P g 和 X-tremeGENE9DNA 转染试剂(Roche Diagnostics Ltd.)3 μ L 和所述Opti MEMlOO μ L的混合液，添加在所述DNA转染试剂的30%至50%融合的所述SH-SY5Y细胞中，经整夜培养后，被用于以下的不溶性馏分的植入。
[0071]1.6于培养细胞植入不溶性馏分
[0072]所述6孔细胞培养板的I个孔用的植入试剂被添加在I个孔的所述细胞培养用培养基中后，所述培养细胞被进行6小时培养。进行所述繁殖后，其培养基被替换为新鲜的细胞培养用培养基(2mL)再培养3天。然后，所述培养细胞通过蛋白质印迹法或免疫细胞化学法被解析。在不立刻使用的情况下，被于_20°C下保存。
[0073]1.7通过蛋白质印迹法的解析
[0074]1.7.1各种细胞萃取馏分的制备
[0075]在于培养细胞植入不溶性馏分后，除去所述细胞培养用培养基，然后添加ImLPBS0剥离所述培养细胞，进行离心分离(l，800g、5分钟、4°C的条件下)。除去上清液后，再添加ImL PBS0将所述培养细胞再度进行离心分离(l，800g、5分钟、4°C的条件下)后洗涤。
[0076]1.7.2三羟甲基氨基甲烷缓冲液不溶性馏分的制备
[0077]将所述培养细胞悬浊在100 μ L的细胞破碎溶液(50mM Tris-HCl (pH7.5),0.15MNaCl、5mM EDTA、5mM EGTA以及蛋白酶抑制剂混合物组III (目录号:539134,Merck Ltd.))中，于37°C条件下繁殖30分钟。在使用VP-5S装置(TIETECH C0.，Ltd)进行超声波处理后，通过超离心分离(290，000g、20分钟、4°C条件下)分离上清液和沉淀，从而所述上清液被作为三羟甲基氨基甲烷缓冲液不溶性馏分(以下称之「TS馏分」使用。
[0078]1.7.3含有Triton X-100三羟甲基氨基甲烷缓冲液不溶性馏分的制备
[0079]将在所述TS馏分的制备中所得到的沉淀使其悬浊在含有l%Triton X-100的IOOmL的所述细胞破碎溶液中，并于37°C条件下进行30分钟的繁殖。在使用VP-5S装置(TIETECH C0.,Ltd)进行超声波处理后，通过超离心分离(290，00(^、20分钟、41:条件下)分离上清液和沉淀，从而所述上清液被作为含有Triton X-100的三羟甲基氨基甲烷缓冲液不溶性馏分(以下称之「T X馏分」)使用。
[0080]1.7.4含有N-月桂酰肌氨酸钠的三羟甲基氨基甲烷缓冲液可溶性馏分以及不溶性馏分的制备
[0081]将在所述T X馏分的制备中所得到的沉淀悬浊在含有1%N_月桂酰肌氨酸钠的所述细胞破碎溶液中，并于37°C条件下进行30分钟的繁殖。在使用VP-5S装置(TIETECHC0.，Ltd)进行超声波处理后，通过超离心分离(290，000g、20分钟、4°C条件下)分离上清液和沉淀，从而所述上清液被作为含有N-月桂酰肌氨酸钠的三羟甲基氨基甲烷缓冲液不溶性馏分(以下、称之「Sar馏分」使用。再者，所述沉淀被作为不溶性馏分(以下、称之「ppt馏分」)使用。
[0082]1.7.5通过蛋白质印迹法的解析
[0083]TS馏分、T X馏分、Sar馏分以及ppt馏分，以在本领域技术人员所周知的标准的方法的蛋白质印迹法被解析。简明说来，所述馏分通过13.5%SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳被各自分离。已被分离的蛋白质被转录在PVDF膜，并与以下的I级抗体以及2级抗体反应，进而使用ECL Plus蛋白质印迹法检出系统(GE Healthcare/Japan Ltd)和ImageQuant (商标)LAS4000mini (GE Healthcare/Japan Ltd)所检出。
[0084]所使用的I级抗体和其稀释倍率如下:
[0085](I)识别TDP单体的抗TDP抗体(目录号60019-2_Ig、ProteinTech、转基因股份有限公司、以下称之“抗TDP单体抗体”)、1:1000稀释。
[0086](2)识别 HA 信息标记的抗 HA 抗体(目录编号 H9658Sigma_Aldrich Japan K.K.)、(以下称之“ant1-HA”)、l:2000 稀释。
[0087](3)识别序号409/序号410的磷酸化丝氨酸的抗TDP抗体(TDP43_pS409/410、独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄托中心、受领编号:FERM ABP-10984、W02009/008529)、(以下称之 “ant1-409/410”)、1:1000 稀释。
[0088](4)识别α突触核蛋白以及β突触核蛋白的抗体(抗Synl02抗体、Nonaka T等、Bioc hemistry, 44:361 (2005))、(以下称之 “anti_Synl02 抗体”)、1:2000 稀释。
[0089](5)识别序号129的磷酸化丝氨酸的抗α -突触核蛋白抗体(Fujiwara H等,Nat.Cell Biol.4:160 (2002))(以下称之 “anti_PSerl29 抗体”)、1:2000 稀释。
[0090](6)将突触核蛋白的序号131-序号140的肽作为抗原的抗突触核蛋白抗体(Masuda M 等，FEBS.Lett.583:787 (2009))(以下称之 “ 131-140 抗体”)、1:1000 稀释。
[0091]所使用的2级抗体和其稀释倍率如下:
[0092](I)抗兔子-HRP标记IgG (目录编号170-6515、伯乐生命医学产品有限责任公司)1:20，000 稀释。
[0093](2)抗小鼠-HRP标记IgG (目录编号170-6516、伯乐生命医学产品有限责任公司)1:20，000 稀释。
[0094](3)生物素化抗兔子 IgG (目录编号 BA 1000、Funako shi Ltd.) 1:500 稀释。
[0095](4)生物素化抗小鼠 IgG (目录编号 BA2000、Funakoshi Ltd.) 1:500 稀释。
[0096]1.8共聚焦显微镜观察
[0097]免疫细胞化学染色依据本领域技术人员所周知的标准的方法所进行。简明说来，所述培养细胞用4%多聚甲醛固定。然后，用0.2%Triton X-100进行渗透处理，再用含有5%胎牛血清的PBS溶液进行封端。适当地稀释所述ant1-HA和ant1-409/410抗体,并将其作为I级抗体使用。适当地稀释Alexa Fluor488goat ant1-rabbit IgG (目录编号A11008、(Invitrogen Japan K.K.))和、Alexa Fluor568goat ant1-mouse IgG (目录编号 A11004、(Invitrogen Japan K.K.))，并将其作为 2 级抗体使用。细胞核用 T0-PR0-3 (MolecularProbes、Life Technologies Japan Ltd.)染色。所述培养细胞用 ProLong Gold antifade reagent (目录编号P36934、Invitrogen Japan Κ.Κ.)包埋，进而用共聚焦显微镜(CarlZeiss Microscopy Ltd.)观察。
[0098]2.结果
[0099]2.1蛋白质印迹解析
[0100]图1-1、1-2以及1-3为被分别使用抗TDP单体抗体、ant1-HA抗体以及ant1-409/410抗体所检出的已植入来自ALS患者的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞馏分的蛋白质印迹图。“HA-WT”表示为未植入来自患者脑的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞。“ ALSpp t ”表示为来自ALS患者脑的不溶性馏分已植入在未进行转染的SH-SY5Y细胞。“HA-WT+ALSppt”表示为已植入来自ALS患者脑的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞。“TS”、“TX”、“Sar” 以及 “ppt” 表示为其在 “HA-WT”、“ALSppt” 或 “HA-WT+ALSppt” 的条件所处理的细胞的TS馏分、TX馏分、Sar馏分以及ppt馏分适用于各自的等相位区。由图1_1、1_2以及1-3所清楚地显示，抗TDP单体抗体、ant1-HA以及ant1-409/410抗体，对HA-TDP表达细胞的PPt馏分和已植入来自ALS患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞的ppt馏分不发生反应。但是，所述抗TDP单体抗体、ant1-HA以及ant1-409/410抗体对已植入来自ALS患者的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞的ppt馏分发生反应。尤其，所述ant1-409/410抗体已检出约50kDa的完好的TDP和约25kDa的TDP的C末端断片。该交差反应性与在神经退行性疾病患者、尤其是在来自ALS患者的试样的蛋白质印迹解析中所检出的交差反应性非常相似。 [0101]图2-1以及2- 2为被分别使用anti_Synl02抗体以及anti_PSerl29抗体所检出的，并已植入来自ALS患者的不溶性馏分的a S表达细胞的蛋白质印迹图。“ a S”表示为未植入来自患者脑的不溶性馏分的a S表达细胞。“ALSppt”表示为来自ALS患者脑的不溶性馏分已植入在未进行转染的SH-SY5Y细胞。“ a S+ALSppt”表示为已植入来自ALS患者脑的不溶性馏分的a S表达细胞。“TS”、“TX”、“Sar”以及“ppt”表示为其在“ a S”、“ALSppt”或“ a S+ALSppt”的条件所处理的细胞的TS馏分、TX馏分、Sar馏分以及ppt馏分适用于各自的等相位区。由图1-1、1-2以及1-3所清楚地显示，anti_Synl02抗体以及anti_PSerl29抗体，对a S表达细胞的ppt馏分和已植入来自ALS患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞的PPt馏分以及已植入来自ALS患者的不溶性馏分的a S表达细胞的ppt馏分不发生反应。
[0102]从以上的结果显示出，来自ALS患者的不溶性馏分于HA-TDP表达细胞显著地促进不溶性聚集体的蓄积；另一方面，于aS表达细胞不促进不溶性聚集体的蓄积。因此，显示出不溶性聚集体的蓄积需要成为聚集的核(晶种)的不溶性馏分和形成所述不溶性聚集体的蛋白质单体的特异性的组合。
[0103]2.2共聚焦显微镜观察
[0104]图3-1、3-2、3_3以及3-4，为用于检出由来自ALS患者的不溶性馏分所蓄积的不溶性聚集体而被免疫细胞化学染色的培养细胞的共聚焦显微镜照片。于图的照片的各个左上部分表示为已使用的I级抗体。“merge”的意思是指已合成剩下的3张照片的图像。HA-TDP表达细胞被使用在图3-1、3-3以及3-4，SH-SY5Y细胞被使用在图3_2。不溶性馏分虽未被植入在图3-1,但来自ALS患者脑的不溶性懼分被植入在图3_2、3_3以及3_4。由图3_1可知，在不植入来自ALS患者的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞中，未检出磷酸化TDP。由图3-2可知，在已植入来自ALS患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞中，其磷酸化TDP略有检出。由图3-3以及3-4可知，在已植入来自ALS患者的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞中，磷酸化TDP和HA-TDP其局限模式彼此相同。在图3-4中，表达磷酸化TDP和HA-TDP的细胞成为钻石状的独特的形态。
[0105]实施例2
[0106]1.材料及其方法
[0107]1.1不溶性聚集体和神经退行性疾病关联蛋白质的组合[0108]样品的获得、来自脑样品的不溶性馏分的制备、含有不溶性馏分的植入试样的制备、细胞培养、转染子的制作、于培养细胞的不溶性馏分的植入、蛋白质印迹法的解析以及共聚焦显微镜观察等与实施例1同样地进行。脑样品，由路易氏体型失智症(dementia withIe wy bodies:DLB)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy:PSP)、皮质基底节变性症(corticobasal degeneration:CBD)、皮克病(Pick disease)以及额颞叶变性症(frontotemporal lobar degeneration:FTLD)的患者获得，并且被制备成不溶性懼分。进一步制作2种转染子，其是指(I)用HA所信息标记化，且表达具有3个重复顺序的微小管结合的蛋白质蛋白的同源异构体(以下，称之为“HA-3R1N”)的SH-SY5Y细胞(以下，称之为“HA-3R1N表达细胞”)和、(2)用HA所信息标记化，且表达具有4个重复顺序的微小管结合的蛋白质蛋白的同源异构体的同源异构体(以下，称之为“HA-4R1N”)的SH-SY5Y细胞(以下，称之为“HA-4R1N表达细胞”)。简明说来，准备了将编码HA-3R1N或HA-4R1N的核苷酸已插入于pcDNA3载体的结构。将(Goedert M等、Neuron3:519 (1989))所述结构物I μg 和、X-tremeGENE9DNA 转染试剂(Roche Diagnostics Ltd.) 3 μ L 以及 OptiMEM (LifeTechnologies Japan Ltd.) 100 μ L的混合液，添加在所述DNA转染试剂的30%至50%融合的所述SH-SY5Y细胞中经整夜培养后，被用于以下的不溶性馏分的植入。在蛋白质印迹法解析中，进一步使用作为I级抗体，且认知396号的磷酸化丝氨酸的抗蛋白抗体(目录号577815Merck Ltd.)(以下称之“anti_PS396抗体”)和、作为2级抗体，且抗兔子-HRP标记IgG (目录编号170?6515、伯乐生命医学产品责任有限公司)1:20，000稀释或、生物素化抗兔子 IgG (目录编号 BA 1000、Funakoshi Ltd.) 1:500 稀释。
[0109]1.2细胞毒性实验
[0110]细胞毒性实验，有关SH-SY5Y细胞和被植入来自ALS、FTLD或皮克病患者的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞，使用市场出售的细胞毒性实验试剂盒(CytoToX96 (登录商标)Non-Radioactive Cytotoxicity Assay、G1780、Promega KK),且按照制造者的说明书而进行。细胞毒性率(％)其通过用细胞培养液中和活细胞中的乳酸脱氢酶的测定值去除细胞培养液中的乳酸脱氢酶的测定值所得到的商作为百分率所算出。
[0111]2.结果`
[0112]图4-1和4-2分别为使用anti_Synl02抗体和anti_PSerl29抗体所检出的，已植入来自DLB患者的不溶性馏分的a S表达细胞的蛋白质印迹图。“ a S”表示为不植入来自患者脑的不溶性馏分的a S表达细胞。“DLBppt”表示为来自DLB患者的脑的不溶性馏分被植入在未进行转染的SH-SY5Y细胞中。“ a S+DLBppt”表示为已被植入来自DLB患者的脑的不溶性馏分的a S表达细胞。“TS”、“TX”、“Sar”以及“ppt”表示为其在“ a S”、“DLBppt”或“ a S+DLBppt”的条件下所处理的细胞的TS馏分、TX馏分、Sar馏分以及ppt馏分适用于各自的等相位区。由图4-1以及4-2所清楚地显示，ant1-Synl02抗体，对a S表达细胞的PPt馏分和已植入来自DLB患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞的ppt馏分，以及已植入来自DLB患者的不溶性馏分的a S表达细胞的ppt馏分不发生反应。anti_PSerl29抗体，对a S表达细胞的ppt馏分和已植入来自DLB患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞的ppt馏分不发生反应，相反，对已植入来自DLB患者的不溶性馏分的a S表达细胞的ppt馏分发生反应。从以上的结果，于aS表达细胞，无论是否植入来自DLB患者的不溶性馏分，其大体上的a S存在于可溶性馏分，不溶性聚集体为非常微量。但是，在已植入来自DLB患者的不溶性馏分的a S表达细胞中，相当多的量的磷酸化a S移至在不溶性馏分。由于在未进行转染而已植入来自DLB患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞中，其基本上完全检测不出磷酸化α S，因此，其暗示在已植入来自DLB患者的不溶性馏分的a S表达细胞中，来自DLB患者的不溶性成分成为晶种，进而被形成为新的不溶性聚集体。
[0113]图4-3，是为了检出由来自DLB患者的不溶性馏分而已蓄积的不溶性聚集体，而被免疫细胞化学染色的培养细胞的共聚焦显微镜照片。于图的照片的各自的左上部表示为I级抗体。“merge”的意思是指已合成剩下的3张照片的画面。在已植入来自DLB患者的不溶性馏分的aS表达细胞中，该a S在细胞质整体被局部检出，但磷酸化a S在包涵体(inclusion body)被局部检出。
[0114]图5-1为使用anti_PS396抗体所检出的，已植入来自PSP患者的不溶性馏分的HA-3R1N表达细胞的蛋白质印迹图。“HA-tau3RlN”表示为不被植入来自患者脑的不溶性馏分的HA-3R1N表达细胞。“PSP”表示为来自PSP患者脑的不溶性馏分被植入在未进行转染的SH-SY5Y细胞。“HA-tau3RlN+PSP”表示为已被植入来自PSP患者脑的不溶性馏分的 HA-3R1N 表达细胞。“TS”、“TX”、“Sar” 以及 “ppt” 表示为其在 “HA_tau3RlN”、“PSP” 或“HA-tau3RlN+PSP”的条件下所处理的细胞的TS馏分、TX馏分、Sar馏分以及ppt馏分适用于各自的等相位区。由图5-1所清楚地显示，ant1-PS396抗体，对HA-3R1N表达细胞的ppt馏分和已植入来自PSP患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞的ppt馏分以及已植入来自PSP患者的不溶性馏分的HA-3R1N表达细胞的ppt馏分不发生反应。
[0115]图5-2为使用anti_PS396抗体所检出的，已植入来自PSP患者的不溶性馏分的HA-4R1N表达细胞的蛋白质印迹图。“HA-tau4RlN”表示为不植入来自患者脑的不溶性馏分的HA-4R1N表达细胞。“PSP”表示为来自PSP患者的不溶性馏分被植入在不进行转染的SH-SY5Y细胞中。“HA-tau4RlN+PSP ”表示为已被植入来自PSP患者的不溶性馏分的HA-4R1N 表达细胞。“TS”、“TX”、“Sar” 以及 “ppt” 表示为其在 “HA_tau4RlN”、“PSP” 或“HA-tau4RlN+PSP”的条件下所处理的细胞的TS馏分、TX馏分、Sar馏分以及ppt馏分适用于各自的等相位区。由图5-2所清楚地显示`，ant1-PS396抗体，对HA-4R1N表达细胞的ppt馏分和已植入来自PSP患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞的ppt馏分不发生反应，另一方面，对已植入来自PSP患者的不溶性馏分的HA-4R1N表达细胞的ppt馏分发生了反应。
[0116]图5-3为使用anti_PS396抗体所检出的，已植入来自CBD患者的不溶性馏分的HA-4R1N表达细胞的蛋白质印迹图。“HA-tau4RlN”表示为不被植入来自患者脑的不溶性馏分的HA-4R1N表达细胞。“CBD”表示为来自CBD患者脑的不溶性馏分被植入在未进行转染的SH-SY5Y细胞中。“HA-tau4RlN+CBD”表示为已被植入来自CBD患者脑的不溶性馏分的 HA-4R1N 表达细胞。“TS”、“TX”、“Sar” 以及 “ppt” 表示为其在 “HA_tau4RlN”、“CBD” 或“HA-tau4RlN+CBD”的条件下所处理的细胞的TS馏分、TX馏分、Sar馏分以及ppt馏分适用于各自的等相位区。由图5-3所清楚地显示，ant1-PS396抗体，对HA-4R1N表达细胞的ppt馏分和已植入来自CBD患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞的ppt馏分不发生反应，另一方面，对已植入来自CBD患者的不溶性馏分的HA-4R1N表达细胞的ppt馏分发生了反应。
[0117]图5-4为使用anti_PS396抗体所检出的，已植入来自皮克病患者的不溶性馏分的HA-3R1N表达细胞的蛋白质印迹图。“HA-tau3RlN”表示为不被植入来自患者脑的不溶性馏分的HA-4R1N表达细胞。“Pick”表示为来自皮克病患者的不溶性馏分被植入在未进行转染的SH-SY5Y细胞中。“HA-tau3RlN+Pick”表示为已被植入来自Pick患者的不溶性馏分的 HA-4R1N 表达细胞。“TS”、“TX”、“Sar” 以及“ppt”表示为其在“HA_tau3RlN”、“Pick” 或“HA-tau3RlN+Pick”的条件下所处理的细胞的TS馏分、TX馏分、Sar馏分以及ppt馏分适用于各自的等相位区。由图5-4所清楚地显示，ant1-PS396抗体，对HA-3R1N表达细胞的ppt馏分和已植入来自Pick患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞的ppt馏分不发生反应，另一方面，对已植入来自Pick患者的不溶性馏分的HA-3R1N表达细胞的ppt馏分发生了反应。
[0118]图6为表示已被植入来自不同的疾病的患者的不溶性馏分的培养细胞的细胞毒性实验的结果的图表。其细胞毒性率(％)，在未进行转染且已植入来自ALS患者的不溶性馏分的SH-SY5Y细胞实验组中为5%，在不被植入来自患者的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞实验组中为约6%，其在向HA-TDP表达细胞植入来自ALS、FTLD、以及皮克病患者的不溶性馏分的实验组中，其分别为约11%、约15%以及约4.5%。
[0119]从以上的结果已被显示出，其各种各样的神经退行性疾病的不溶性聚集体的蓄积，需要成为聚集的核(晶种)的不溶性聚集体和形成该神经退行性疾病的关联蛋白质的特异性的组合。再者，也显示出伴随不溶性聚集体的蓄积其细胞坏死增大。进一步，还显示出利用从各种各样的神经退行性疾病的患者所制备的不溶性馏分和该神经退行性疾病的关联蛋白质，能够构筑不溶性聚集体的蓄积模型细胞培养体系。
[0120]实施例3 [0121]1.材料及其方法
[0122]样品的获得、来自脑样品的不溶性馏分的制备、含有不溶性馏分的植入试样的制备、细胞培养、转染子的制备、于培养细胞的不溶性馏分的植入以及蛋白质印迹法的解析，以与实施例1同样的方式进行。在向HA-TDP表达细胞植入来自ALS患者的不溶性馏分后，其由所述HA-TDP表达细胞所制备的ppt馏分(以下称之“增幅用不溶性馏分”)已被植入在新的HA-TDP表达细胞。
[0123]2.结果
[0124]图7-1为使用ant1-HA抗体所检出的，已植入增幅用的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞的蛋白质印迹图。图7-2为使用ant1-409/410抗体所检出的，已植入增幅用的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞的蛋白质印迹图。“none”表示为来自患者脑的不溶性馏分不被植入在未进行转染的SH-SY5Y细胞中的条件。“HA-WT”表示为来自患者脑的不溶性馏分不被植入在HA-TDP表达细胞中的条件。“HA-WT+Cell ppt”表示为已植入增幅用不溶性馏分的HA-TDP表达细胞。“ TS ”、“ TX”、“ Sar ”以及“ppt ”表示为其在“none ”、“HA-WT ”或“HA-WT+Cellppt”的条件下所处理的细胞的TS馏分、TX馏分、Sar馏分以及ppt馏分适用于各自的等相位区。由图7-1以及7-2所清楚地显示，ant1-HA，对已被植入增幅用的不溶性馏分的HA-TDP表达细胞的ppt馏分发生了强烈反应。再者，ant1-409/410抗体，对约50kDa的完好的TDP和约25kDa的TDP的C末端断片发生了反应。从以上的结果已显示出，与来自神经退行性疾病患者的不溶性馏分同样，来自培养细胞的不溶性馏分也能够形成不溶性聚集体。即，在已被强制表达了神经退行性疾病关联蛋白质的单体的培养细胞中，一旦植入来自该神经退行性疾病患者的脑的不溶性馏分，则该不溶性成分作为晶种，进而被形成为新的不溶性聚集体。换一种方式说来，不溶性聚集体被增幅在所述培养细胞内。而且，于培养细胞内所形成的不溶性聚集体，一旦将其自身作为晶种且被植入在新的培养细胞内，则能够形成不溶性聚集体。这样，通过重复不溶性聚集体的形成，能够大量地增幅来自神经退行性疾病患者的脑的不溶性馏分。
[0125]用显像密度计定量化图1-3和图7-2的印迹图的条带的浓度，并将该测定值作为基准，进而推定了于本实施例中的不溶性聚集体的增幅倍率。作为使用显像密度计测定图1-3的“HA-WT+ALS ppt”的ppt相位区(将来自ALS患者脑的十二烷基肌氨酸钠不溶性馏分植入在HA-WT表达细胞后已培养3天的细胞，适用从该细胞的破碎液所得到的十二烷基肌氨酸钠不溶性馏分的相位区)的20至55kDa的范围的条带的结果，其读取值为187419461。该PPt馏分被悬浊在100 μ L的PBS内，在实行图1-3的由蛋白质印迹法所进行的解析时，其15 μ L被适用在所述等相位区，5 μ L被用于新的HA-WT表达细胞的植入。因此，增幅前的不溶性聚集体的量以显像密度计的读取值的单位为62473153.65。作为使用显像密度计测定图7-2的“HA-WT+Cell ppt”的sar和ppt相位区(已适用在本实施例中所增幅的十二烷基肌氨酸钠可溶性馏分和不溶性馏分的相位区)的20至150kDa的范围的条带的结果，其读取值为278226669。该sar和ppt馏分都被悬浊在100 μ L的PBS内，在实行图7_2的由蛋白质印迹法所进行的解析时，其10μ L被适用在所述等相位区。因此，增幅后的不溶性聚集体的量以显像密度计的读取值的单位为2782266690。这样，用62473153.65去除2782266690所得到的商约为44.5则为在本实施例中的不溶性聚集体的增幅倍率的推定值。从该结果被显示出，本发明的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法具有至少数十倍的增幅效率。
[0126]实施例4
[0127]1.材料及方法
[0128]样品的获得 、来自脑样品的不溶性馏分的制备、含有不溶性馏分的植入试样的制备、细胞培养、转染子的制备、于培养细胞的不溶性馏分的植入、蛋白质印迹法的解析，以与实施例3同样的方式进行。在本实施例中，也使用了表达不被HA信息标记化的完好的TARDNA结合蛋白质(以下称之“TDP”)的SH-SY5Y细胞(以下称之“TDP表达细胞”)。在从往TDP表达细胞植入来自ALS患者的不溶性馏分的3天后，再收回所述TDP表达细胞的ppt馏分(以下称之“第1次增幅后的不溶性馏分”)，其用于蛋白质印迹法的解析并且被植入在第I的HA-TDP表达细胞内。在从植入所述第1次增幅后的不溶性馏分的3天后，再收回第I的HA-TDP表达细胞的ppt馏分(以下称之“第2次的增幅后的不溶性馏分”)，其用于蛋白质印迹法的解析并且被植入在第2的HA-TDP表达细胞内。在从植入所述第2次增幅后的不溶性馏分的3天后，再收回第2的HA-TDP表达细胞的ppt馏分(以下称之“第3次的增幅后的不溶性馏分”)，其用于蛋白质印迹法的解析。
[0129]2.结果
[0130]图8为使用409/410抗体所检出的，第1次、第2次以及第3次的增幅后的不溶性馏分的蛋白质印迹图。各自的蛋白质印迹图的等相位区I为不被转染的SH-SY5Y细胞的ppt馏分。各自的蛋白质印迹图的等相位区2为不被植入不溶性馏分的HA-TDP表达细胞(第I次)或TDP表达细胞(第2次和第3次)。各自的蛋白质印迹图的等相位区3为第1次、第2次以及第3次的增幅后的不溶性馏分。若比较第1次、第2次以及第3次的增幅后的不溶性馏分的蛋白质印迹图的等相位区3的条带，由于第1次增幅后的不溶性馏分其以患者脑的不溶性馏分作为晶种由未信息标记化的TDP成为不溶化，因此，被信息标记化的TDP与成为不溶化的第2次和第3次的增幅后的不溶性馏分相比，其分子量小。与实施例3同样，在用显像密度计定量第1次增幅后的不溶性聚集体和第3次增幅后的不溶性聚集体时，分别以显像密度计的读取值的单位为1534573.82和52345813.5。因此，由本实施例的2阶段的增幅的增幅倍率为用前者去除以后者的商的34.1倍。
[0131]实施例5
[0132]1.材料及方法
[0133]样品的获得、来自脑样品的不溶性馏分的制备、含有不溶性馏分的植入试样的制备、细胞培养、转染子的制备、于培养细胞的不溶性馏分的植入以及蛋白质印迹法的解析以与实施例3同样的方式进行。于本实施例中，在从往HA-TDP表达细胞植入来自患者脑的不溶性馏分的6小时后，各自以最终浓度为20 μ M的方式添加了神经退行性疾病的治疗药的候补化合物。作为所述候补化合物，被使用了脑复清(exifone、东京化成工业责任有限公司、H1065)、棉花皮素(gossypetin、ChromaDex Inc.(加利福尼亚州欧文)、ASB-00007390-010、和光纯药工业责任有限公司)、杨梅素(myricetin、Sigma-AldrichJapan K.K.、M6760-10MG)以及没食子酸酯((-)-Epicatechin gallate、Sigma-AldrichJapan K.K.E-3893-10MG)和，作为对照实验所使用的溶剂DMS0。所述候补化合物将100%DMS0作为溶剂，且作为20mM的溶液而制备，再以1000倍稀释被添加在HA-TDP表达细胞的培养液中。因此，对照实验的DMSO也以最终浓度为0.1%的方式被添加。于植入来自患者脑的不溶性懼分的3天后收回HA-TDP表达细胞的ppt懼分，并用于蛋白质印迹解析，其不溶性聚集体的量被用显像密度计所定量。
[0134]2.结果
[0135]图9为用ant1-4 09/410抗体所检出的，在神经退行性疾病的治疗药的候补化合物的存在下所增幅的不溶性馏分的蛋白质印迹图。箭头表示为构成不溶性馏分的信息标记化TDP的条带。等相位区分别表示HA-WT (来自患者脑的不溶性馏分不被植入在HA-TDP表达细胞的条件)、DMSO (神经退行性疾病的治疗药的候补化合物的对照溶剂)、脑复清、棉花皮素、杨梅素以及没食子酸表儿茶素。图10为，将图9的各等相位区的不溶性聚集体的由显像密度计所定量的结果，以在对照溶剂DMSO的存在下的结果为100%所表示的百分率的柱形图。由图10所清楚地显示，在神经退行性疾病的治疗药的候补化合物中，脑复清虽基本上不显示出阻碍聚集体形成的效果，但、没食子酸表儿茶素和杨梅素以及棉花皮素已被认定具有阻碍聚集体形成的效果。为最有效的棉花皮素，其近40%的聚集体形成被阻碍。从该结果显示出，本发明的不溶性聚集体的蓄积模式细胞培养体系可使用于神经退行性疾病的治疗药的候补的筛选。
[0136]产业实用性
[0137]如本说明书所说明的那样，若通过本发明的不溶性聚集体的制造方法，能够大量地制备均质的不溶性聚集体。因此，通过本发明的不溶性聚集体的制造方法，也可对不能获得含有不溶性聚集体的活性检测试样的研究机构提供不溶性聚集体，进而能够推进神经退行性疾病的研究。再者，通过本发明的不溶性聚集体的制造方法，可提供神经退行性疾病的治疗药候补的简便且廉价的筛选方法。
【权利要求】
1.一种神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法，其特征在于，包括: 步骤(1)，其将来自神经退行性疾病的患者的脑的不溶性馏分植入在结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内； 步骤(2)，其培养已植入所述不溶性馏分的所述培养细胞； 步骤(3)，其从所述培养细胞中萃取不溶性馏分。
2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，包括: 步骤(4)，其为在培养细胞中增幅神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的步骤，该步骤包括将从培养细胞中所萃取的不溶性馏分植入在结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内，且培养已植入所述不溶性馏分的所述培养细胞，并且从所述培养细胞中萃取不溶性馏分。
3.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于，包括: 步骤(5 )，其将所述步骤(4 )进一步至少连续重复I次。
4.如权利要求1至3的任一项所述的制造方法，其特征在于， 所述神经退行性疾病关联蛋白质为从包括TAR、DNA结合蛋白质、α突触核蛋白、Tau蛋白质、β-淀粉样蛋白、多聚谷氨酰胺、SODl以及朊蛋白质的组中所选择。
5.一种神经退行性 疾病关联蛋白质的不溶性聚集体，其特征在于， 其通过如权利要求4所述的制造方法而获得。
6.一种来自生物学性试样的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法，其特征在于，包括: 步骤(I )，其将从生物学性试样中所萃取的不溶性馏分植入在结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内； 步骤(2)，其培养已植入所述不溶性馏分的所述培养细胞； 步骤(3 )，其从所述培养细胞中萃取不溶性馏分。
7.如权利要求6所述的制造方法，其特征在于，包括: 步骤(4)，其为在培养细胞中增幅神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的步骤，该步骤包括将从培养细胞中所萃取的不溶性馏分植入在结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内，且培养已植入所述不溶性馏分的所述培养细胞，并且从所述培养细胞中萃取不溶性馏分。
8.如权利要求7所述的制造方法，其特征在于，包括: 步骤(5 )，其将所述步骤(4 )进一步至少连续重复I次。
9.一种来自生物学性试样的所述神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体，其特征在于， 其通过如权利要求6至8的任一项所述的制造方法而获得。
10.一种生物学性试样的细胞毒性的检查方法，其特征在于，包括: 将如权利要求9所述的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体，或将来自所述神经退行性疾病的患者的脑的不溶性馏分植入在结构性地表达所述神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内的步骤；和 定量化所述培养细胞的细胞死亡的程度的步骤。
11.一种神经退行性疾病的治疗候补药的筛选方法，其特征在于，包括:将如权利要求9所述的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体，或将来自所述神经退行性疾病的患者的脑的不溶性馏分植入在结构性地表达所述神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内的步骤；和 使神经退行性疾病的治疗药的候补化合物接触所述培养细胞的步骤；以及将具有抑制所述培养细胞的细胞死亡的效果的所述候补化合物作为所述神经退行性疾病的治疗候补药进行筛选的步骤。
【文档编号】C07K14/47GK103781914SQ201280044001
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年5月18日 优先权日:2011年11月18日
【发明者】野中隆, 增田雅美, 山下万贵子, 秋山治彦, 长谷川成人 申请人:公益财团法人东京都医学综合研究所