纯化fc-融合蛋白的方法

纯化fc-融合蛋白的方法
【专利摘要】本发明主要涉及纯化在真核表达系统中产生的Fc融合蛋白的方法。更具体地，本发明提供了稳定的和可扩展的下游纯化方法，其适合在用于人施用的TNFR:Fc的制造中使用，所述方法包括优化的蛋白A亲和层析步骤和都以结合和洗脱模式操作的两个离子交换层析步骤。
【专利说明】纯化FC-融合蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及用于纯化在真核表达系统中产生的Fe-融合蛋白的方法。更具体地，本发明提供了稳健的和可扩展的下游纯化方法，其适合在制造用于人施用的TNFR:Fc中使用。
[0002]发明背景
为了保证生物药物的安全性，监管机构对于旨在用于人施用的蛋白施行严格的纯化标准和质量属性(同一性、强度和纯度)。标准要求基于蛋白的治疗性产品基本上无杂质，包括与产品相关的污染物，如重组蛋白的聚集物、片段和变体，以及与方法相关的污染物，如浸出层析树脂、培养基组分、DNA、宿主细胞蛋白、病毒污染物和内毒素。
[0003]在用于临床实验的合适量的生物制药药物候选物的生产中，方法的开发可以经常是限速步骤。重组生物药物的制造商必须交付具有稳定的质量属性的产物，以保证可重现的临床性能。支持临床开发的高纯度生物药物的生产通常需要多于单个步骤的纯化方法。在生物药物开发中的最大挑战之一是高效和成本效益的制造方法的建立，其可以重现性地生产足够纯度和生物活性的产品。
[0004]通常，重组蛋白的下游加工严重依赖于方法层析，具有二至五个之间的层析单元操作。因为下游加工构成所有的制造成本的50-80%之间，生物制药工业考虑生物加工开发作为产品开发的整体组分并作为竞争性优势的来源。因此，参与单克隆抗体(mAb)大规模制造的企业已做出了显著的投资，以建立上游和下游生物加工平台，以保证其持续生产大量的制药级mAb的能力。
[0005]商业规模的纯化方法通常包括至少下列步骤:细胞裂解以回收细胞内蛋白或在分泌蛋白的情况下从培养基回收蛋白；使用差速离心或过滤去除细胞碎片，以获得包含目的蛋白的澄清样品；在多步骤的方法中利用各种层析介质，以将目的蛋白与样品中的各种杂质分离。下游方法开发中主要考虑的是药物纯度。另外，方法必须是稳健的、可靠的和可扩展的(Shukla, A 等人，Tournal of Chromatography B, 848:28 (2007))。
[0006]尽管建立的纯化平台具有公认的优势，但个别单克隆抗体在生化特性和纯化行为中的差异，已致使认识到下游加工不能被缩减成将普遍适用于每种生物药品的单一模板化方法。结果，下游纯化方法已经朝向定义的操作参数和一组单元操作发展，其用于建立适合于使用产品特异性方法的开发的公共框架。操作参数用来建立对个别单元操作的性能预期和用来包括可接受的操作条件，从而限制开发蛋白特异性纯化方案所需的实验量。在实践中，可以对HlAb的下游加工最初开发的单元操作进行修改，以在适合用于另一类型的生物药物，包括人IgG Fe融合蛋白的制造的方法的开发中使用。
[0007]目前，仍存在对于用于Fe融合蛋白的高效和稳健的纯化方法的未满足的需要，所述方法可修改为适合用于人施用的最终产品的大规模生产。
[0008]不承认本申请中引用的参考文献是所请求保护的发明的现有技术。
[0009]发明概述
已开发了用于TNFR = Fc的下游方法，其产生高度纯化的TNFR:FC，并导致错误折叠的Fe融合蛋白总体减少到小于5% (范围从4.5%至0.2%)，聚集物减少到小于5% (范围5%至0.5% )并且片段(包括游离的Fe水平)减少到小于5% (范围4.5%至0% )。另外，本文公开的方法改善了唾液酸化的TNFR:Fc的总产量。
[0010]本发明部分基于纯化方法的开发，其包括优化的收获前调节方案结合三个优化的层析单元操作，包括蛋白A捕获步骤和都是以结合和洗脱模式运行的两个离子交换层析步骤。本发明的方法概括在图1和2中提供的流程图中。本发明的纯化方法显著降低杂质的量和程度，如可存在于从真核表达系统获得的源培养基中的不完整的含Fe的蛋白片段、聚集物和宿主细胞蛋白(HCPs)，并生产高产量的适于人施用的有生物活性且纯的蛋白。
[0011]在一个实施方案中，本发明提供从样品中除去存在的一种或多种杂质，纯化Fe融合蛋白的方法，其包括以下步骤:a)提供包含在真核表达系统中产生的Fe融合蛋白的样品；b)使存在于样品中的Fe融合蛋白结合蛋白A亲和层析树脂；c)从所述蛋白A树脂洗脱Fe融合蛋白，其中洗脱产物提供了第二样品，其任选地被称为蛋白A产物(PAP) ；d)使PAP结合阳离子交换(CEX)层析树脂；e)从CEX树脂洗脱第二样品，其中所述洗脱产物提供了第三样品，其任选地被称为CEX产物(CEXP) ；f)使CEXP结合阴离子交换(AEX)层析树脂；以及g)从AEX树脂洗脱第三样品，其中所述洗脱产物提供了纯化的Fe融合蛋白组合物。 [0012]在具体实施方案中，下游纯化方法用于纯化在任一种糖工程化(glycoengineered)的毕赤酵母表达系统中产生的二聚体重组糖蛋白(例如，Fe融合蛋白)。在可选的实施方案中，所述方法用来纯化在哺乳动物(CH0细胞)表达系统中产生的Fe融合蛋白。更具体地，本文提供的实例通过使用所公开的下游方法纯化p75 TNFR = Fc融合蛋白举例说明了本发明的方法，所述融合蛋白包括由到人IgGl恒定区(Fe)的人75千道尔顿人肿瘤坏死因子受体的胞外配体结合部分组成。然而，该具体的Fe-融合蛋白在实例中的使用并不旨在限制本发明的范围，本发明更广泛用于任何Fe融合蛋白的下游纯化。
[0013]如本文所示，本发明的优化的下游纯化方法可以用于制备从CHO细胞培养表达系统分离和纯化的高度纯化的T NF R: F C蛋白，其中所述纯化的蛋白具有> 9 9 %的纯度和>18mMol的TSA水平。根据本文公开方法，TNFRiFc蛋白使用线性伪梯度从蛋白A洗脱，其并入柠檬酸钠缓冲液(50mM至IOOmM的柠檬酸盐)的洗脱强度和从pH5.0至3.5的降低的PH梯度。如本文所示，从高pH值和低缓冲强度开始，使用伪梯度洗脱，减轻了在蛋白A洗脱过程中由于浅pH过渡曲线而产生的聚集物形成效应。
[0014]如本文所示，使用本文所公开的优化的运行参数发挥减少在后续层析步骤上的负担的作用。本文公开的优化的蛋白A步骤在第一捕获步骤后将蛋白A产物的纯度改善到大于80%。所公开的蛋白A层析步骤已进行了优化，以去除产品相关的杂质(错误折叠的目的蛋白、聚集物、片段和不适当唾液酸化的种类)，其具有降低下游纯化步骤负担的效果。
[0015]本发明的两个离子交换层析步骤均以结合和洗脱模式操作。阳离子交换层析优选使用在PH 4.0的NaCl洗脱梯度进行。在可选的实施方案中，可以使用在阻止聚集物和HCPs洗脱的电导率和PH的缓冲液进行等度洗脱。优选地，使用从约10至约50mS/cm的范围的电导率，在约3.5至约6.0的pH的分步梯度从阳离子交换树脂上洗脱包含Fe的蛋白。所述方法的CEX步骤已被优化以高效地消除宿主细胞蛋白(HCP)、DNA和浸出的蛋白A配体，同时保留具有高TSA水平的TNFR = Fc融合蛋白。所公开的方法的CEX步骤提供包含Fe的蛋白的中间纯化步骤。
[0016]根据本发明，随后，对来自阳离子交换步骤的洗脱物进行作为产品精加工步骤的以结合和洗脱模式操作的阴离子交换层析(AEX)。在pH8.0进行AEX，使用通过20CV的从0-0.3M NaCl的线性离子强度梯度洗脱，并收集ICV级分。本发明公开的优化的AEX单元操作进一步减少聚集物I至2倍和宿主细胞蛋白I至5倍。使用本文公开的优化的操作条件，所述阴离子交换层析步骤进一步富集TSA水平并去除剩余的方法残留物。
[0017]使用优化的蛋白A捕获步骤和顺次的均以结合和洗脱模式运行的两个优化的离子交换精加工层析步骤，进一步将Fe融合蛋白制品的纯度增加到>90%，同时控制最终纯化的蛋白的总唾液酸(TSA)含量。在实践中，所公开的纯化方法可以用于纯化具有>99%纯度的Fe融合蛋白产品。在一个实施方案中，本发明的下游纯化方法用于制备从CHO细胞培养表达系统获得的，高度纯化的TNFR = FC蛋白，其具有>99%的纯度和>18 mMol的TSA水平。
[0018]所提及的开放式的术语，例如“包括”，允许额外的元件或步骤。有时，短语例如“一种或多种”与或不与开放式的术语一起使用，以强调额外元件或步骤的可能性。
[0019]除非明确说明，所提及的术语，例如“一”或“一个”(a或an)，不限于一。例如“一个细胞”不排除“多个细胞”。有时，短语，例如一种或多种，用于强调可能存在的复数。
[0020]本发明的其它特征和优点从本文所提供的包括不同实施例的附加描述中是显而易见。所提供的实例说明可用于实施本发明的不同的组分和方法。所述实例不限制所请求保护的发明。基于本公开，技术人员可以鉴定并采用可用于实施本发明的其它组分和方法。
[0021]附图简述
图1描绘了用于在糖工程化的巴斯德毕赤酵母(pichia pastor is)中生产的TNFR:Fc的纯化方案。
[0022]图2描绘了用于在CHO细胞中生产的TNFR = Fc的纯化方案。
[0023]图3:MabSelect和Poros MabCapture A的QPAP流在分析型HIC层析图上的比较。
[0024]图4:蛋白A洗脱条件的开发。在合并的蛋白A产物中，本发明人观察到TSA水平的富集，同时减少了错误折叠和聚集物。
[0025]图5:离心过程期间加料速率和上清液浊度。灰色实线表明从分批离心O 4700rpm进行20分钟获得的上清液浊度。
[0026]图6:通过作为加载的函数的通量和浊度而确定的MF性能。
[0027]图7 =CEX的洗脱概况和对应TSA值的重现。报告了相对于参考化合物的TSA值。虚线表示对于最终产品指定的TSA最小百分比。
[0028]图8:经过离子梯度洗脱的CEX级分的cIEF电泳图。
[0029]图9:作为柱电导率函数的AEX TSA概况。报告了相对于参考化合物的TSA值。虚线表示对于最终产品指定的TSA最小百分比。
[0030]图10:经过离子梯度洗脱的AEX级分的cIEF电泳图。
[0031]图11:在M0010681纯化过程 中的杂质清除。
[0032]图12:最终配制的散装品(bulk)的SDS-PAGE分析。
[0033]图13:在CHO细胞系中的两个克隆在蛋白A层析期间的洗脱产物概况。
[0034]图14:作为产量的函数的合并的蛋白A级分的TSA水平。报告了相对于参考化合物的TSA值。
[0035]图15:来自CHO细胞系克隆18G10的蛋白A洗脱级分相比于参考化合物的cIEF概况。
[0036]图16:来自CHO细胞系克隆23D8的蛋白A洗脱级分相比于参考化合物的cIEF概况。
[0037]图17:在CHO细胞系中的两个克隆在CEX层析期间的洗脱产物概况。
[0038]图18:作为产量的函数的合并的CEX级分的TSA水平。报告了相对于参考化合物的TSA值。
[0039]图19:来自CHO细胞系克隆23D8的CEX洗脱级分相比于参考化合物的cIEF概况。
[0040]图20:来自CHO细胞系克隆18G10的CEX洗脱级分相比于参考化合物的cIEF概况。
[0041]图21:在CHO细胞系中的两个克隆在AEX层析期间的洗脱产物概况。
[0042]图22:作为产量的函数的合并的AEX级分的TSA水平。报告了相对于参考化合物的TSA值。
[0043]图23:来自CHO细胞系克隆23D8的AEX洗脱级分相比于参考化合物的cIEF概况。
[0044]图24:来自CHO细胞系克隆18G10的AEX洗脱级分相比于参考化合物的cIEF概况。
[0045]发明详述
定义
如本文所用的术语“上游方法”指通过与培养和繁殖宿主细胞而生产重组蛋白相关的方法步骤。上游步骤考虑的因素包括克隆选择方法、培养基选择、加料分批培养操作条件、培养加料策略。
[0046]如本文所用的术语“下游方法”指与纯化重组蛋白和去除杂质相关的方法步骤。
[0047]如本文所用的术语“稳健的方法”指在其操作参数内充分执行，持续地提供定义的质量、纯度和产量的方法。
[0048]术语“层析”指将目的分析物(例如，包含Fe区的蛋白，例如IgG融合蛋白)与存在于混合物中的其它分子分离的任何种类的技术。通常，目的分析物与其它分子分离，是作为混合物的分子个体在移动相的影响下移动通过静止介质的速率中的差异的结果，或在结合和洗脱方法中的差异的结果。
[0049]术语“纯化”、“分开”或“分离”在本文中可互换使用，指提高目的多肽或蛋白或来自包含所述多肽和一种或多种杂质或污染物的组合物或样品的目标蛋白的纯度的程度。通常，通过从组合物去除(完全或部分地)至少一种杂质而提高目标蛋白的纯度的程度。
[0050]“纯化步骤”或“单元操作”可以是总体纯化方法的一部分，导致“均质”组合物或样品，其用于本文以指在包括目的蛋白的组合物中包括少于1000ppm HCP的组合物或样品，可选地，少于900ppm、少于800ppm、少于700ppm、少于600ppm、少于500ppm的HCP。
[0051]如本文可互换使用的术语“污染物”、“杂质”和“碎片”指任何外来或不适宜的分子，包括生物大分子例如DNA、RNA、一种或多种宿主细胞蛋白、内毒素、脂质和一种或多种添加剂，其可以存在于包含含有Fe的目标蛋白的样品中，其中正使用本发明的方法将所述目标蛋白与一种或多种外来与不适宜的分子分离。另外，这样的污染物可以包括在可在纯化方法之前出现的任何步骤中使用的试剂。
[0052]术语“中国仓鼠卵巢细胞蛋白”和“CHOP”可互换使用，是指衍生自中国仓鼠卵巢(“CH0”)细胞培养物的宿主细胞蛋白(“HCP”)的混合物。HCP或CHOP通常作为杂质存在于细胞培养基或裂解物中，例如包括目的蛋白(例如在CHO细胞中表达的融合蛋白)的收获的细胞培养液(“HCCF”)。存在于包括目的蛋白的混合物中的CHOP的量提供了对于目的蛋白纯度的程度的量度。HCP或CHOP包括但不限于，通过宿主细胞(例如CHO宿主细胞)表达的目的蛋白。通常，蛋白混合物中CHOP的量表示为相对于混合物中的目的蛋白的量的百万分率。可以理解，当宿主细胞是另一种细胞类型时，例如CHO之外的真核细胞，昆虫细胞或植物细胞，酵母细胞，HCP指在宿主细胞的裂解物中发现的除目标蛋白之外的蛋白。
[0053]如本文所用的术语“收获前调节”指在收获或获得收获的细胞培养物或任何形式的纯化之前，对包含细胞的发酵液的处理或调整。这包括但不限于调整温度、添加稳定赋形剂、添加氧化和还原剂、稀释发酵液以降低蛋白浓度、添加表面活性剂、添加盐和添加有机溶剂。
[0054]如本文所用的术语“亲和分离”或“亲和纯化”指任何纯化或分析技术，其涉及将包含目标分析物(例如，包含Fe区的蛋白)的样品与已知结合目标分析物的亲和介质(例如其上携带已知结合分析物的亲和配体的固体支持物，例如，如，诸如蛋白A或其变体)接触。
[0055]如本文可互换使用的术语“亲和层析”和“蛋白亲和层析”，指蛋白分离技术，其中目标蛋白(例如包含Fe区域的目的蛋白或抗体)特异性地结合对目标蛋白特异性的配体。该配体通常称作生物特异性配体。在一些实施方案中，`生物特异性配体(例如蛋白A或其功能性变体)共价连接到层析固相材料上并当溶液接触层析固相材料时，所述配体可接触溶液中的目标蛋白。在层析步骤期间，目标蛋白通常保留其对生物特异性配体的特异性结合亲和力，而在混合物中的其它溶质和/或蛋白不明显地或特异性地结合配体。
[0056]目标蛋白对固定的配体的结合允许污染的蛋白或蛋白杂质经过层析介质，而目标蛋白仍然特异性地结合固相材料上的固定的配体。然后，在合适地条件(例如，低pH、高pH、高盐、竞争性配体等)下，特异性结合的目标蛋白以活性形式从固定的配体上去除，并与洗脱缓冲液一起通过层析柱，不含早先允许经过柱子的污染蛋白或蛋白杂质。在根据本发明的各种方法中，使用蛋白A作为包含Fe的目标蛋白的配体。
[0057]如本文所用的术语“加料分批培养”指基于向培养物供给生长限制性营养物(growth limiting nutrient)的生产方法。这允许培养物在生产生物反应器中实现高细胞密度，并有助于细胞的代谢控制以避免副产物的生成。
[0058]如本文所用的术语“细胞培养上清液”指细胞在其中培养并且蛋白向其中分泌的培养基，前提是所述蛋白包含适当的细胞信号，即信号肽。优选表达所述包含Fe的蛋白的细胞在无血清培养条件下培养。因此，优选地，所述细胞培养上清液不含动物血清衍生的组分。更优选地，所述细胞培养基是化学成分确定的培养基。
[0059]如本文所用的术语“聚集物”含义是指蛋白聚集物。其涵盖待纯化的Fe融合蛋白的多聚体(例如，二聚体、四聚体或更高级的聚集物)，并且可以导致，例如高分子量聚集物。
[0060]如本文所用的术语“错误折叠的Fe融合蛋白”指不正确或不合适地折叠从而改变三级结构的Fe融合蛋白。错误折叠还可以涵盖术语“聚集物”。但是，聚集物不一定必须是错误折叠的。
[0061]术语“重折叠剂”指在不合适地折叠的、解折叠的或变性的蛋白的正确折叠过程中起协助作用的化合物或化合物和/或条件的组合。这些化合物可以通过稳定蛋白的天然构象发挥作用(即，精氨酸、甘油)，或充当螯合剂(即EDTA)，或防止聚集(即三甲胺N-氧化物(TMAO)、PEG-3500)，氧化还原剂(即谷胱甘肽，半胱氨酸)。
[0062]术语“解聚剂(disaggregation agent) ”指在逆转蛋白聚集过程(例如二聚体、四聚体或更高级的聚集物)的过程中起协助作用的化合物或化合物和/或条件的组合。这些化合物可以作为温和变性剂(即，尿素、盐酸胍)、蛋白天然构象的稳定剂(即，精氨酸、甘油)发挥作用，和充当螯合剂(即，EDTA)。
[0063]术语“酸性变体”指比目标蛋白更酸性(例如，如通过阳离子交换层析所确定的)的目标蛋白的变体。酸性变体的实例是脱酰胺化的变体。
[0064]如本文所用术语“捕获步骤’指第一下游加工步骤，其从收获的培养基中捕获目的产物(POI)，浓缩产物并实现POI与杂质(例如，细胞、细胞碎片、DNA、宿主细胞蛋白)的第
一分离。
[0065]如本文所用的术语“精加工步骤”指下游加工步骤，其在初始捕获步骤后发生，并且其旨在去除存在于产品流中的更小量的杂质，并且与在捕获步骤过程中去除的杂质相t匕，所述杂质通常 与产品具有更多的类似性(例如产品的聚集形式、结构变体，包括错误折叠的产品和修饰的产品)。
[0066]如在本文可互换使用的术语“目标蛋白”和“目的蛋白”，指蛋白或多肽，包括但不限于，待通过本发明的方法从蛋白混合物和任选地其它材料例如细胞碎片、DNA、宿主细胞蛋白、培养基组分等纯化的Fe融合蛋白。
[0067]分子与层析树脂的“结合”指将在适当的条件(pH/电导率)下将分子暴露于层析树脂，使得分子借助配体-蛋白相互作用可逆地固定于层析树脂中或层析树脂上。非限制性的实例包括分子和离子交换材料的一个带电基团或多个带电基团之间的离子相互作用，和蛋白A和免疫球蛋白之间的生物特异性相互作用。
[0068]如本文所用的术语“特异性结合”，例如描述目标蛋白(例如，含有Fe区的蛋白)和结合于固相支持物的配体(例如，结合固相基质或树脂的蛋白A)之间的相互作用，指通过蛋白和配体结构在结合位点的空间互补性并结合静电力、氢键键合、疏水力和/或范德华力的组合效应，目的蛋白与配体的通常可逆的结合。通常，在结合位点的空间互补性越大并且其它力越强，蛋白对其相应配体的结合特异性越强。特异性结合的非限制性实例包括抗体-抗原结合、酶-底物结合、酶-辅因子结合、金属离子螯合、DNA结合蛋白-DNA结合、调节蛋白-蛋白相互作用等。
[0069]如本文所用的术语“非特异性结合”，例如描述目的分子(例如，如本文所述目标蛋白)和配体或结合到固体支持物的其它化合物(例如，结合到固相基质或树脂的蛋白A)之间的相互作用，是指目的蛋白与固体支持物上的配体或化合物通过在相互作用位点的静电力、氢键键合、疏水力和/或范德华力，但缺乏可增强非结构力的效果的结构互补性的结合。非特异性相互作用的实例包括但不限于，静电力、疏水力和范德华力以及氢键键合。
[0070]所述“清洗”层析介质，是指使合适的缓冲液通过或越过介质。[0071 ] 在本文可互换使用的术语“流通方法”、“流通模式”和“流通层析”，指一种产品分离技术，其中预定使连同一种或多种污染物一起包含在样品中的至少一种产品(例如，含有Fe区的蛋白)流过层析树脂或者介质，而至少一种潜在的污染物或杂质结合到层析树脂或者介质的。“流通模式”通常是等度操作(即期间流动相的组成没有变化的层析方法)。
[0072]如本文所用的术语“缓冲液交换步骤”指在线溶液条件调整，在很多常规方法中，其通常是使用容纳槽(holding tank)的备选方案。在典型的缓冲液交换步骤中，可以使用在管道或混合容器，过滤装置或设备中的溶液共混的转移期间，混合或滴定两种溶液。例如，可需要稀释溶液，以通过使所述溶液与另一种电导率较低的溶液混合而降低电导率。缓冲液交换可以在过滤装置的帮助下实现，例如渗滤、超滤等。
[0073]从层析树脂“洗脱”分子(例如，目的多肽或杂质)是指通过改变溶液的条件，使得缓冲液与目的分子竞争层析树脂上的配体位点，以从层析树脂去除该分子。非限制性实例是通过改变包围离子交换材料的缓冲液的离子强度，使得所述缓冲液与该分子竞争离子交换材料上的带电荷的位点，以从离子交换树脂洗脱所述分子。
[0074]术语“等度洗脱”用于本文，是指这样的条件，其中在整个洗脱方法过程中，流动相的组成没有改变。
[0075]术语“梯度洗脱”用于本文，一般是指这样的条件，其中在起始于离子强度相对低的溶剂的洗脱过程中，所述流动相的盐的强度增加。
[0076]术语“预洗脱步骤”是指洗脱前的倒数第二个层析步骤，其中目标分子仍结合柱子，但在加载到下一个柱子过程中的缓冲液混合对目标产量或目标纯度不产生不利影响。非限制性的实例包括平衡加载有包含Fe的蛋白的蛋白A柱，所述蛋白在适合用于阳离子交换柱加载的缓冲液中，例如PH 5.4的乙酸钠或pH 5.0的柠檬酸钠，然后柱子用pH 3的乙酸钠洗脱到阳离子交换柱上。
[0077]如在本文可互换使用的术语“结合和洗脱模式”和“结合和洗脱方法”，指产品分离技术，其中样品中包含的至少一个产品(例如，包含Fe区的蛋白)结合层析树脂或介质，并随后被洗脱。
[0078]如在本文可互换使用的术语“合并策略”和“合并标准”，是用来描述结合和消除层析方法洗脱级分以实现目标杂质清除和提高所需产品质量属性的方法。
[0079]术语“层析树脂”或“层析介质”在本文中可互换使用，并指任何类型的固相，其将目的分析物(例如，含有Fe区的蛋白，如免疫球蛋白)与存在于混合物中的其它分子分离。通常，目的分析物与其它分子的分离是作为混合物的分子个体在移动相的影响下移动通过静止固相的速率中的差异，或在结合和洗脱方法中的差异的结果。非限制性实例包括阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换膜、疏水相互作用树脂及离子交换整料。树脂的体积、待使用的柱子的长度和直径，以及动态容量和流速取决于几个参数，如待处理的流体的体积，待进行本发明方法的流体中蛋白的浓度等。用于每个步骤的这些参数的确定完全在本领域技术人员的平均技能内。
[0080]术语“P0R0S层析介质”指层析树脂，其特征在于具有非常大的穿透孔和较小的扩散孔。在制造中操纵 二者的相对平衡以优化表面面积，并由此优化容量。表面涂层和官能团的引入独立地扩大容量且控制选择性。官能团类型、配体密度和涂层结构的控制用于细调选择性。[0081]术语“蛋白Α”、“Ρι.οΑ”和“PrA”在本文可互换使用，并且涵盖从其天然来源回收的蛋白A、合成生产的蛋白A (例如，通过肽合成或通过重组技术)，以及它们的保留结合具有CH2/CH3区，例如Fe区的蛋白的能力的变体。蛋白A通常固定在固相支持材料上。术语“ProA”还指共价连接蛋白A的亲和层析树脂或包含共价连接蛋白A的层析固体支持物基质的柱子。
[0082]在根据本发明的方法中使用的蛋白A的功能衍生物、片段或变体可以表征为对于小鼠IgG2a或人IgGl的Fe区为至少K=10〃 8 M的结合常数，并且优选Κ=Ι0〃9 Μ。在本文中，对于结合常数符合这样数值的相互作用称为“高亲和力结合”。优选地，蛋白A的这种功能性衍生物或变体包含野生型蛋白A的至少部分的功能IgG结合结构域,选自天然结构域E、D、A、B、C或其具有保留的IgG结合功能的工程化突变体。
[0083]此外，在所要求保护的方法中的亲和层析步骤中，也可以使用经过工程化以允许单点连接的蛋白A的衍生物或变体。单点连接通常是指该蛋白部分通过单个共价键连接到蛋白A亲和层析的层析支持材料上。这样的单点连接也可以通过使用合适的反应性残基而发生，所述反应性残基放置在暴露的氨基酸位置上，即在环中，接近N-或C-末端或在蛋白折叠的外部环境的其它地方。合适的反应性基团是，例如巯基或氨基官能。
[0084]如本文所用的术语“污染物蛋白A”是蛋白A的任何类型的功能性的IgG结合性的产物或如上文所限定的其功能性衍生物，所述污染物蛋白A在从蛋白A亲和层析柱洗脱结合的抗体后获得。这种污染物蛋白A种类可以由，例如，肽键的水解而产生，这很可能通过酶作用的方式而发生，特别是在工业制造中。例如，在细胞培养液中将死的细胞，或在初始离心或过滤步骤中被破碎的细胞有可能释放游离的蛋白酶，其可降解蛋白A树脂。这是特别有可能的，因为蛋白A层析在下游加工中作为早期步骤应用，此时粗纯化的、新鲜的产品溶液仍然包含相当大 的蛋白酶活性。
[0085]如本文所用的术语“离子交换”和“离子交换层析”用来指层析方法，其中在混合物中的目的溶质或分析物(例如，含有Fe区的目标蛋白)与连接(如通过共价连接)到固相离子交换材料的带电荷的化合物相互作用，使得目的溶质或分析物与带电荷的化合物非特异性相互作用多于或少于混合物中的溶质杂质或污染物。在混合物中的污染性溶质比目的溶质更快或更慢地从离子交换材料的柱上洗脱，或相对目的溶质结合树脂或从树脂排除。“离子交换层析”特异性包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式的离子交换层析。
[0086]多肽的“pi”或“等电点”指多肽的阳性电荷与其阴性电荷平衡的pH，pI可以根据多肽的氨基酸残基或多肽连接的碳水化合物的唾液酸残基的净电荷计算，或者可以通过等电聚焦确定。
[0087]短语“离子交换材料”指带负电(即，阳离子交换树脂)或带正电(即，阴离子交换树脂)的固相。可以通过将一个或多个带电的配体连接到固相，例如，通过共价连接提供电荷。可选地或额外地，电荷可以是固相的固有性质(例如，在硅胶的情况下，其具有总体的负电荷)。
[0088]短语“阳离子交换树脂”指带负电的固相，并且其从而具有游离阳离子，用于与越过或通过固相的水溶液中的阳离子交换。连接到固相以形成阳离子交换树脂的带负电的配体可以是，例如羧酸盐或磺酸盐。可商购获得的阳离子交换树脂包括羧甲基纤维素，固定在琼脂糖上的磺丙基(SP)(例如，SP-SEPHAROSE FAST FLOW?或 SP-SEPHAROSE HIGHPERFORMANCE ?,来自Pharmacia)，和固定在琼脂糖上的磺酰基(例如，来自Pharmacia的S-SEPHAROSE FAST FLOW?)。例如，可以在树脂结合目标分子(例如，含有Fe区的目标蛋白)的条件下进行阳离子交换层析，随后是洗脱(阳离子交换结合和洗脱层析或“CIEX”)。或者，CEX可以在主要结合杂质而目标分子“流通”柱子模式下运行(阳离子交换流通层析FT-CIEX)。本文所公开的纯化方法利用以结合和洗脱模式进行的阳离子交换层析步骤。
[0089]术语“阴离子交换树脂”在本文中用来指带正电的固相，例如，具有与其连接的一个或多个带正电荷的配体，例如季铵基团。可商购获得的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、QAE SEPHADEX?iP FAST Q SEPHAROSE? (Pharmacia)。阴离子交换层析可以结合目标分子(例如，含有Fe区的目标蛋白)随后洗脱，或可以主要结合杂质，而目标分子“流通”柱子。本文所公开的纯化方法利用以结合和洗脱模式进行的阴离子交换层析步骤。
[0090]如本文所用术语“缓冲液”指通过其酸碱缀合组分的作用抵抗pH的变化的溶液。取决于例如所期望的缓冲液pH,可以采用的各种缓冲液描述于Buffers, A Guide forthe Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroyj D.，ed.Calbiochem Corporation (1975)。
[0091]“盐”是通过酸和碱的相互作用形成的化合物。可以在本文所述的缓冲液中使用的各种盐包括，但不限于，乙酸盐(例如，乙酸钠)、柠檬酸盐(如柠檬酸钠)、氯化物(例如，氯化钠)、硫酸盐(例如，硫酸钠)或钾盐。
[0092]术语“阳离子交换缓冲液”指具有使目标分子(例如，免疫球蛋白)将结合到阳离子交换材料的PH和电导率的平衡缓冲液。
[0093]如本文所用术语“加载缓冲液”指用来将包括目的目标分子(例如，包含Fe区的目标蛋白)和一种或多种杂 质的样品或组合物加载到层析柱(例如，亲和柱或离子交换柱)上的缓冲液。加载缓冲液具有使得一种或多种目的分子(通常和一种或多种杂质)结合到层析树脂或使得目的蛋白流通该柱而杂质结合到树脂的电导率和/或pH。
[0094]“中间缓冲液”用于在洗脱目的多肽分子之前从层析树脂上洗脱一种或多种杂质。中间缓冲液的电导率和/或PH是使得一种或多种杂质从离子交换树脂洗脱，但没有显著量的目的多肽从离子交换树脂洗脱的电导率和/或pH。
[0095]术语“清洗缓冲液”或“平衡缓冲液”在本文可互换使用，指用于在洗脱目的多肽分子之前清洗或再平衡层析树脂的缓冲液。在一些情况下，清洗缓冲液和加载缓冲液可以是相同的。
[0096]“洗脱缓冲液”用于将目标蛋白从固相洗脱。洗脱缓冲液的电导率和/或pH通常是使得目标蛋白从层析树脂洗脱的电导率和/或pH。术语“等度洗脱”用来指这样的洗脱条件，其中流动相的组成在整个洗脱方法过程中没有改变。
[0097]术语“梯度洗脱”和“线性梯度洗脱”在本文可互换使用，指这样的条件，其中在起始于相对低的溶剂强度的溶剂的洗脱期间，流动相中的溶剂强度，或洗脱液离子的浓度增加。
[0098]术语“伪梯度洗脱”用于指这样的条件，其中在梯度洗脱期间，两种或更多种条件被改变。伪梯度方法的实例包括但不限于在蛋白A层析的洗脱阶段增加流动相的溶剂强度，而同时降低流动相的PH，以达到相比进行等度洗脱或改变一个流动相条件的梯度更高的纯度水平。在离子交换洗脱过程中同时改变PH和盐浓度的组合效果是伪梯度洗脱的另一个实例。
[0099]如本文可互换使用的术语“病毒灭活”、“病毒清除”或“病毒减少”，指可致使病毒不能感染细胞或通过物理化学手段抑制病毒功能的任何手段。典型的病毒灭活方法包括但不限于，低pH处理(例如，低于pH4.5、低于4.0或低于3.8)、热处理、用表面活性剂和辐射处理(例如，紫外线光暴露)。在一些实施方案中，病毒灭活方法是针对反转录病毒。在具体实施方案中，将低PH值条件用于病毒灭活，因为这样的条件通常破坏病毒的脂质包膜，从而灭活病毒。
[0100]如本文所用，术语“Fe区”和“包含Fe区的蛋白”指包含免疫球蛋白的重链和/或轻链恒定区或结构域(如先前定义的CH和CL区)的蛋白。包含“Fe区”的蛋白可以具有免疫球蛋白恒定区的效应子功能。“Fe区”，例如CH2/CH3区，可以选择性结合亲和配体，例如蛋白A或其功能性变体。在一些实施方案中，包含Fe区的蛋白特异性结合蛋白A或其功能性衍生物、变体或片段。
[0101 ] 如本文所用的术语“Fe融合蛋白”，其含义包括蛋白，特别是治疗性蛋白，其包含免疫球蛋白衍生的结构部分，这将在本文中称为“Fe-部分”，和从非免疫球蛋白的第二蛋白衍生的部分，这将在本文中被称为“治疗性部分”，与是否旨在治疗疾病无关。在可替代的实施方案中，Fe融合蛋白包括选自下列的治疗性部分:TNFRl、TNFR2或TNF超家族成员的胞外结构域，或其TNF结合和任选地抑制片段。TNFR超家族的成员的特点是在胞外结构域存在富含半胱氨酸的假重复，如例如 Naismith J.H.和 Sprang S.R.Trends Biochem.Sc1.23,74 - 79 (1998)所述。两个 TNF 受体，p55 (TNFRl)和 p75 TNFR (TNFR2)是这样的 TNFR超家族成员的实例。在一个具体的实施方案中，Fe-融合蛋白是依那西普(Etanercept),这是一种含有人p75 TNF受体(TNFR)的可溶部分的Fe-融合蛋白(例如W091/03553，WO94/06476)。依那西普在本文中也称为“TNFR:Fc”。
`[0102]如本文所用，术语“参考产品”用于指依那西普(ENBREL)。本文使用ENBREL批号1009164、1011147、1011803、1011858 和 1008885 用于比较目的。
[0103]Fe融合蛋白
依那西普(Enbrel?)是二聚体重组治疗性糖蛋白，其在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达系统中产生，并且由连接到人IgGl的恒定区(Fe)的人75千道尔顿(p.75、TNFRI1、W091/03553、WO 94/06476)人肿瘤坏死因子受体的胞外配体结合部分组成。依那西普销售用于至少类风湿性关节炎、银屑病关节炎、银屑病和强直性脊柱炎的治疗。依那西普通过结合并中和促炎细胞因子TNF-α的作用，在这些慢性炎性疾病中介导其有益作用。
[0104]为了产生释放到细胞培养上清中的可溶的、分泌的Fe-融合蛋白，使用Fe-融合蛋白的治疗性部分的天然信号肽，或优选使用异源信号肽，即衍生自另一分泌蛋白的在所使用的具体表达系统中有效的信号肽。如果待纯化的Fe融合蛋白通过分泌该蛋白的哺乳动物细胞表达，则本发明纯化方法的起始材料是细胞培养上清液，也称为收获物或粗收获物。如果细胞在包含动物血清的培养基中培养，则细胞培养物上清液也包含作为杂质的血清蛋白。
[0105]根据本发明，重组Fe融合蛋白可以在真核表达系统中生产，包括哺乳动物细胞和糖工程化的酵母细胞，产生糖基化的Fe融合蛋白。优选地，表达和分泌Fe融合蛋白的细胞在无血清条件下培养。Fe融合蛋白还可以在化学成分确定的培养基中生产。典型地，本发明的纯化方法的起始材料是主要包含作为杂质的宿主细胞蛋白的无血清细胞培养上清液。
[0106]糖某化/TSA
TNFRiFC (依那西普)是由连接到人IgGl的恒定区(Fe区)的人75kDa (本文称为p75、TNFR2或TNFRII)人TNF-α受体的胞外配体结合部分组成的治疗性重组融合蛋白。如大部分具有治疗重要性的蛋白，对于其生物学活性，依那西普需要N-糖基化。众所周知，哺乳动物细胞和酵母细胞在它们掺入见于天然人蛋白上的翻译后修饰的能力上是不同的。只有哺乳动物细胞具有在分泌过程中进行蛋白的N连接的糖基化的固有能力。
[0107]糖基化蛋白是复杂的分子，并且甚至控制良好的产品也可以由几百种或更多在相同氨基酸序列上具有不同聚糖组成的糖型组成。已知糖基化蛋白的体内生物活性依赖于每个分子的唾液酸单元的数量，这是可用的唾液酸化位点、N-聚糖的天线性质(antenniarity)以及唾液酸化的完整性的结果(Shiestl, M.等人，Nature Biotechnology29(4):310 (2011)) ο
[0108]酵母提供了可选的蛋白表达系统，但是，在野生型酵母中产生的糖蛋白含有潜在免疫原性的高甘露糖型N-聚糖。哺乳动物细胞和酵母之间的糖基化模式中的差异限制了酵母表达系统用于生产单克隆抗体和其它治疗性蛋白，包括IgG Fe融合蛋白的应用。人糖基化的途径已经被工程化到酵母巴斯德毕赤酵母中以提供宿主细胞，其以高保真度执行特异性的人源化的N-糖基化反应。巴斯德毕赤酵母的糖工程化的细胞系已用于成功地生产具有人源化N-聚糖结构的重组单克隆抗体(Jiang, Y.,等人,Protein Expression andPurification.(76) 7 (2011))和 Fe 融合蛋白。
[0109]依那西普显示O连接和N连接的聚糖。N-连接的碳水化合物结构表现出天然出现在人蛋白中的聚糖特有的很多特征。例如，所产生的它的大部分双天线结构具有复合类型的分支，所述分支主要由被末端唾液酸残基封端的双糖Gall, 4GlcNAc组成。然而,这些结构在CHO细胞中的不完整的合成常常赋予蛋白一系列的结构异质性，导致批次与批次之间的变异性。见于依那西普上的O连接的聚糖是所谓的粘蛋白型。因为依那西普的药代动力学性质强烈地依赖于复杂的N连接的碳水化合物的结构和对O连接的聚糖封端的唾液酸的程度，所以不充分的或不一致的唾液酸化和半乳糖苷化可以进而导致通过去唾液酸糖蛋白或甘露糖/GlcNAc受体介导的途径的可变清除率，潜在地提出了对于药物的足够的可重现的给药的显著问题。
[0110]异质性可以从克隆到克隆广泛变化并且依赖于培养条件和生产模式二者。因此，富集特定糖型的能力将是非常期望的，并且GlycoFi的巴斯德毕赤酵母的酵母表达平台提供生产这种具有更均匀的，尽管不完全相同的，人源化的糖基化模式的治疗性蛋白。为了被认为是生物类似物，毕赤酵母产生的蛋白的N-连接的复杂聚糖的末端单糖应该由唾液酸占据。然而，不足或不一致的唾液酸化会在实现方法一致性中产生显著的障碍。通过定义适当的单元操作和优化每个层析步骤的条件(例如，树脂的选择、操作模式、缓冲液、洗脱条件)，本文公开的下游方法解决了由于唾液酸化水平的变化而带来的纯化挑战。
[0111]由于大多数糖蛋白的半衰期和治疗效力依赖于末端唾液酸的存在，所以在TNFR:Fc融合蛋白的纯化过程中仔细监测糖基化模式和末端唾液酸化的控制。作为人糖基化的最后一步，唾液酸化在酵母中特别难以实现，因为野生型酵母缺乏产生终止于β -1, 4-半乳糖的N-糖基化前体的所有能力、产生糖核苷酸前体胞苷单磷酸(CMP)-唾液酸[具体地，CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NANA)]的生物合成能力、转运CMP-唾液酸到高尔基体的转运蛋白和转移唾液酸到新生糖蛋白上的末端半乳糖的唾液酸转移酶。唾液酸频率的丧失导致降低的糖蛋白溶解度，和减少的循环半衰期。结果是，纯化和治疗有效性依赖于唾液酸含量。Brousseau, D.T.和 Sliwkowski, M.B., Biotechnology, 13, 692-698(1995) οShantha Raju, T.S..等人，Biochemistrv 40.8868-8876 (2001)显示，增加在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的TNFR-Fc分子中的末端唾液酸化水平增加了血清半衰期。
[0112]治疗性蛋白的唾液酸含量使用下列方法确定。简而言之,将10_20ug蛋白样品与400ul 0.1M盐酸混合。此后，在80°C加热I小时。所获得的混合物在SpeedVac中干燥I小时。然后产品用500uL HPLC水重构和处理，用于在Dionex HPAEC-PAD系统上的层析分析。使用曲线下面积计算以pmol计的唾液酸的量，并且然后计算唾液酸对蛋白的摩尔比例。参考产品以100% TSA计算，并且POI中的TSA以相对参考产品的百分数表示。
[0113]有助于改善洗脱物流中的TSA水平的参数存在于所有三个层析步骤中。对于蛋白A步骤，所采用的伪梯度选择性将TSA水平主要富集在产品洗脱的开始。伪梯度同时使用pH和缓冲液强度二者，并允许展示高水平的TSA的独特且高选择性的产品概况。用于蛋白A步骤的合并策略还显示在糖工程化的毕赤酵母宿主细胞和CHO细胞系二者中产生的TNFR = Fc的TSA含量的一致性富集。改善的TSA概况也可见于CEX层析过程中。尽管在多个CHO细胞系和糖工程化的毕赤酵母中存在异质性，但在CEX层析的产品合并物中存在唾液酸含量的一致性改善。这可以归于CEX层析操作的模式(结合和洗脱)以及在单元操作的结束时采用的合并策略。AEX操作的方式(结合和洗脱)是在产品合并物中所显示的增强的TSA水平的促进因素。AEX典型地在流通(F/T)模式下操作，但是已经观察到AEX F/T单元操作的使用在F/T产品中提供最低限度的TSA水平的改善。
[0114]重折叠/错误折叠
TNFRiFC在该蛋白的Fe区包`含7个二硫键并且在TNF受体区域包含22个二硫键。因此，在下游加工方案过程中存在二硫键打乱(scrambling)的高度可能性。从毕赤酵母宿主细胞的发酵获得的TNFR = FC具有少于20%的正确折叠的目的产品(POI)，其余是聚集或错误折叠的，这对于下游纯化的成效提出了显著的挑战。在W02002/068455中描述的发明的前提是，观察到TNFR:Fc (p75TNFRI1:Fc融合蛋白，也称为依那西普)在CHO中的表达产生包括正确折叠的TNFR:Fe、片段和错误折叠和/或聚集蛋白产物的混合物的制品。本公开表明尽管重组蛋白的一些区域或结构域可以适当地折叠，但其它区域或结构域可具有不期望的构象。本公开表明，疏水相互作用柱(HIC)的级分#3特别令人感兴趣，因为它可以包括从20到60%的样品，并且被证明相比HIC柱洗脱物的级分#2中的蛋白收集显示低TNF结合活性和生物活性。
[0115]WO 2002/068455提供了一种方法，其中，在约7至约11的pH，使已通过哺乳动物细胞产生的重组蛋白(即，p75 TNFR:FC)制品接触还原/氧化偶合试剂，并分离该重组蛋白制品具有所需构象的级分。在WO 2002/068455中公开的所有实验性研究都使用从CHO细胞产生的材料获得的部分纯化的TNFR = Fc蛋白混合物，其从蛋白A或HIC柱上洗脱。
[0116]现有技术纯化方案
WO 03/059935公开了 p75 TNFR = Fc融合蛋白的纯化方法，其使用羟磷灰石层析和蛋白A上的亲和层析的组合。所公开的纯化方法提供用于分离包括至少一个恒定抗体免疫球蛋白结构域的蛋白，使用以流通模式的羟基磷灰石树脂，使得Fe-融合蛋白不结合但其它一种或多种蛋白结合羟基磷灰石。本文公开的方法不利用羟基磷灰石层析。除此之外，没有提及使用离子交换层析纯化P75 TNFRiFc融合蛋白。
[0117]US7427659公开了一种从包含目标蛋白和污染物(例如HCP)的混合物分离目标蛋白，包括在细胞培养中生产的重组TNFR = FC融合蛋白的纯化方法，其通过将所述混合物与包括支链烃官能团的疏水吸附剂(例如，HIC树脂)在盐水溶液中接触，并收集含有目标蛋白的未结合的流通部分。流通形式的HIC的使用被描述为令人惊讶地高效，导致目标蛋白在单个步骤中显著地更高的收率，从而简化并改善了蛋白纯化方法的效率和成本。本文公开的方法不利用HIC层析。[0118]US6870034公开了通过蛋白A亲和层析纯化含CH2/CH3区的蛋白，例如抗体和免疫粘附素的方法。该公开描述了中间清洗缓冲液的使用，而非TMAC或TEAC (两者公开于美国专利号6，127，526和6，333，398)，其用于在蛋白A层析，以去除结合到蛋白A柱的污染物，但不去除固定的目的蛋白。所公开的中间缓冲液之一包括去垢剂和盐，另一个包括溶剂和盐，并且第三种清洗缓冲液包括聚合物和盐。在公开中示例的包含CH2/CH3区的蛋白是抗体。
[0119]与US 6，870，034中描述的清洗缓冲液相反，在本文公开的蛋白A纯化步骤中使用的清洗缓冲液(其针对非产品相关杂质)是具有盐的，在PH5.5-5.8的基于水(磷酸盐)的缓冲液。另外，在洗脱过程中使用的伪梯度去除非产品相关的杂质、片段、聚集物和错误折叠物。使用所公开的优化的蛋白A条件还导致所期望的蛋白唾液酸化模式的增强(即，改善的TSA含量)。
[0120]EP1561756公开了单独的基于蛋白A或G的层析对于DNA污染物与蛋白的分离可能是不够的，并且，为了纯化蛋白，可以使用进一步的步骤，如阴离子或阳离子交换层析、羟基磷灰石层析或它们的组合。对于这些层析步骤没有提出特定的顺序。另外，EP1561756提到的蛋白是造血因子、细胞因子和抗体。在EP1561756中没有提到Fe融合蛋白。
[0121]EP1614693描述了基于蛋白A亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析的纯化抗体的方法。在此文件中，其指定经由阴离子交换和阳离子交换层析纯化的顺序，或可选地，经由阳离子交换层析随后是疏水层析，而纯化抗体。所述疏水层析可以替换为任何其它类型的层析，包括羟基磷灰石层析。在EP1614693中没有提到Fe融合蛋白。
[0122]US2010/0267932公开了用于纯化具有6.9和9.5之间的pi的Fe融合蛋白的方法，包括蛋白A或G亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析和羟基磷灰石层析。用于纯化的纯化步骤的序列或顺序与US2010/0267932中使用的不同。本文所公开的下游方法包括层析步骤的少一个，并利用以结合和洗脱模式操作的AEX纯化步骤，而不是US2010/0267932中所述的流通模式。
[0123]因此，对于获得适于人施用的纯度的Fe-融合蛋白的有效的纯化方法仍然有未满足的需要。
[0124]本发明
本发明部分地基于纯化方法的开发，所述纯化方法基于优化的收获前调节方案组合三个优化的层析单元操作，包括蛋白A捕获步骤和两个离子交换层析步骤，其可以显著减少杂质的量或程度，所述杂质例如可能存在于包含Fe的蛋白的流体或组合物中的不完整的包含Fe的蛋白片段、聚集物和宿主细胞蛋白(HCPs)。
[0125]本文所公开的下游方法包括新的pH移动重折叠策略，其掺入到收获步骤中以提高生产率，并且使用高通量方法以快速优化亲和蛋白A层析步骤，由此在初级捕获步骤后将POI的纯度提升至〉80%。将这些步骤与两个新开发的离子交换精加工层析步骤(其在结合和洗脱模式下运行)整合，进一步将纯度增加至>90%，并同时控制最终药物物质的总唾液酸含量。所述下游方法最初开发用于毕赤酵母表达的TNFR:Fc融合蛋白，并且随后经改变而适用于CHO表达的TNFR = Fc的纯化。
[0126]CHO表汰的TNF-R融合蛋白
在本文公开的方法中，TNFR = FC的生产通过大规模培养糖工程化的巴斯德毕赤酵母或已工程化成表达重组二聚体TNFR DNA构建体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞而实现。重组蛋白是通过基因工程化的方法生产的蛋白。术语“基因工程化”指用于产生宿主细胞的任何重组DNA或RNA方法，所述宿主细胞以升高的水平、较低的水平表达基因，和/或基因的突变体形式。换句话说，所述细胞已用重组多核苷酸分子转染、转化或转导，并且由此改变以便导致细胞改变所期望蛋白的表达。用于基因工程化细胞和/或细胞系以表达目的蛋白的方法和载体是本领域技术人员熟知的，例如，多种技术阐释于Current Protocols in MolecularBiology, Ausubel 等人编辑(Wiley & Sons, New York, 1988,并且每个季度更新)和Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring LaboratoryPress, 1989)。
[0127]从本发明的下游加工方法获得的纯化的Fe融合蛋白优选地是高度纯化的Fe融合蛋白。高度纯化的Fe融合蛋白确定是通过，例如在银染的非还原的SDS-PAGE凝胶中单个条带的存在。纯化的Fe融合蛋白还可以 定义为在HPLC中作为单个峰洗脱。
[0128]从本发明的纯化方法获得的Fe融合蛋白制品可以包含少于20%的杂质，优选少于10%、5%、3%、2%或1%的杂质，或其可以纯化到均一性，即不含任何可检测的蛋白性污染物，如通过例如上文所解释的银染的SDS-PAGE或HPLC所确定的。
[0129]纯化的Fe融合蛋白可以旨在用于治疗性用途，尤其用于施用到人患者。如果纯化的Fe融合蛋白施用给患者,其优选全身施用，并且优选皮下或肌内，或局部(topically),即局部地(locally)施用。对于此目的，本发明的纯化的Fe融合蛋白可以配制成药物组合物，即与药学可接受的载体、赋形剂等一起配制。
[0130]层析步骤
一般来说，层析单元操作用于基于蛋白电荷、疏水性程度或大小，而将目的蛋白与存在于混合物中的其它蛋白和污染物分离。对于这些技术的每一种有多种不同的可用层析树月旨，允许精确调整纯化方案适应所涉及的具体蛋白。这些分离方法的每一种的实质是，可以导致蛋白以不同的速率向长柱下方移动，实现物理分离，该物理分离随着蛋白进一步向下通过柱子而增加，或者导致蛋白选择性地粘附到分离介质，然后被不同的溶剂差异洗脱。
[0131]通常，开发用于单克隆抗体的下游方法平台利用蛋白A亲和纯化步骤作为捕获步骤，随后是两个或更多精加工层析步骤，其在它们之间具有足够的冗余以保证产品纯度和下游方法的稳健操作。通常，一种或多种精加工步骤以流通模式操作(其中POI不结合柱子，柱子保留杂质)。对于趋于具有高等电点的单克隆抗体，羟基磷灰石相互作用层析步骤(HIC)和阴离子交换层析(AEX)步骤通常以流通模式操作。[0132]蛋白A捕获步骤
蛋白A是43000道尔顿蛋白，其通过细菌金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aureus、f11生并包含对于IgG的Fe区的四个结合位点。蛋白G从G组链球菌{Streptococci')产生，并且具有对于IgG Fe区的两个结合位点。两个蛋白均已充分表征为它们对各种类型的免疫球蛋白的亲和力。由于对于蛋白A和蛋白G的结合位点位于免疫球蛋白的Fe区中，所以蛋白A和蛋白G亲和力层析还允许纯化所谓的Fe融合蛋白。
[0133]蛋白A在开发用于制造在哺乳动物细胞培养中表达的单克隆抗体的下游方法中广泛使用。通常，蛋白A亲和层析用作第一纯化步骤以在中性pH直接捕获mAb产品，并且它通常在设计用于清除方法残留物(例如宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA和培养基组分)的条件下操作。在低PH从蛋白A柱洗脱的产品通常包含方法和产品相关的杂质(包括聚集的、变体和错误折叠的产品)，其需要后续的层析步骤。
[0134]用于亲和层析的蛋白A可以是重组的。其还可以被修饰以改善其性质(例如，如在被称为MabSelect SuRe的树脂中,可从GE Healthcare商购获得)。在一个实施方案中，捕获步骤使用POROS MabCapture A灌注层析介质进行。POROS MabCapture A介质是设计用于制备性纯化mAb的聚合物介质。该介质由刚性的交联聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通颗粒组成，该颗粒的孔结构经过优化用于非常快速的质量运输。颗粒表面包被有多羟基化聚合物，其进一步通过共价固定重组蛋白A进行衍生化。
[0135]本文公开的纯化方法利用蛋白A亲和层析步骤作为捕获步骤以结合在真核表达系统(包括哺乳动物宿主细胞和糖工程化的酵母菌株)中产生的TNFR = Fc融合蛋白。在实践中，蛋白A单元操作功能在于消除宿主细胞蛋白(HCP)，以浓缩Fe融合蛋白流并去除Fe融合蛋白聚集物。蛋白A捕获步骤的另一个目标是富集POI的总唾液酸(TSA)。如本文所示，使用优化的操作参数，所公开的下游加工方法的蛋白A捕获步骤可以减少Fe融合蛋白聚集物水平到0.5%-3%范围的`最终聚集物值。宿主细胞蛋白值也降低到1000ppm-200ppm的范围。
[0136]在本文公开的方法中，优选6mM磷酸钠，500mM NaCl,pH5.5的清洗缓冲液。但是，也可以使用400mM至IM的盐浓度和/或pH 5.3至pH 7.0范围的pH的组合。还可以使用范围从2mM至35mM的磷酸钠的磷酸钠缓冲液强度。清洗缓冲液用于清除非产品相关的杂质，例如宿主细胞蛋白、DNA和其它培养基相关的添加物。
[0137]在本文公开的方法中，POI使用线性梯度从蛋白A洗脱，其并入柠檬酸钠缓冲液(50mM至IOOmM的柠檬酸盐)的洗脱强度和从pH 5.0至3.5范围的降低的pH梯度。蛋白A洗脱步骤可以在选自乙酸钠或柠檬酸钠的缓冲液中进行。合适的缓冲液浓度是，例如选自50 mM或100 mM或150 mM或200 mM。对于这些产品，蛋白A洗脱所需的低pH条件可以经常导致聚集问题(Shukla, A.A.等人，.T Chromatogr A.(2007))。起始于较高pH值和较低缓冲强度的蛋白A伪洗脱梯度，减轻了在蛋白A洗脱过程中由于浅pH过渡曲线而导致的聚集体形成效应。在使用较低PH洗脱的蛋白A产品流中也遇到较高水平的浸出的蛋白A配体。伪梯度洗脱衰减了在产品流中浸出高水平蛋白A配体的作用。
[0138]在实践中，有一些与蛋白A树脂的使用相关的显著缺点，包括蛋白A残基(其可以是免疫原性的)可以浸出到洗脱物中的事实，考虑需要使用额外的层析步骤以清除蛋白A残基。其它缺点包括树脂的成本，其可以代表用于商业规模纯化方法的原材料的总成本的30%,以及树脂难以消毒的事实，因为其容易被常规消毒液例如氢氧化钠变性。
[0139]离子交换层析
离子交换层析系统用于主要基于电荷的差异而分离蛋白。在离子交换层析中，溶质表面上的带电斑片被连接在层析基质上的相反电荷吸引，前提是周围缓冲液的低离子强度。虽然在IEX树脂上的蛋白保留主要随静电相互作用而变，但已知蛋白与带电表面的相互作用机制是多模式的，并包括非静电相互作用包括，疏水相互作用、氢键键合和范德华相互作用。
[0140]通常通过增加缓冲液的离子强度(即电导率)以与溶质竞争离子交换基质的带电位点来实现洗脱。改变PH并从而改变溶质的电荷是实现溶质洗脱的另一种方式。电导率或PH的变化可以是渐变的(梯度洗脱)或逐步的(分步洗脱)。
[0141]蛋白的“等电点”或“pi”是蛋白具有等于零的净总体电荷的pH，即蛋白具有相等数目的正和负电荷的pH。对于任何给定蛋白的pi的确定可以根据充分确立的技术完成，例如，如通过等电聚焦完成。本发明的方法用于纯化具有在6.9至9.5范围的pi的TNFR = Fc融合蛋白。
[0142]IEX方法的优化需要考虑许多相互关联的参数，包括操作模式(结合和洗脱或流通)、柱的尺寸、加载缓冲液(类型、浓度、pH)、洗脱模式(梯度、逐步、等度)，洗脱梯度的斜率和操作流速。在实践中，最显著的因素是操作模式和加载pH。
[0143]CEX
阳离子交换剂还可以分类为弱或强阳离子交换剂。强阳离子交换剂包含强酸(如磺基丙基)其从PH 1-14保持带电；而弱阳离子交换剂包含弱酸(如羧甲基)，其当pH下降低于4或5时逐渐丧失其电荷。例如，羧甲基(CM)和磺基丙基(SP)具有钠作为平衡离子。
[0144]根据本发明，来自蛋白A层析单元操作的洗脱物进行阳离子交换层析。阳离子交换层析可以在任何合适的阳离子交换树脂上进行，例如，如弱或强阳离子交换剂。在本发明的一个实施方案中，CEX纯化步骤在以结合和洗脱模式运行的POROS HS强阳离子交换树脂上进行。POROS HS是用于肽、蛋白和其它生物分子的以灌注层析模式的阳离子交换层析的聚合物填料。其由交联聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通颗粒组成，该颗粒具有用于非常快速的质量运输的双模式孔径分布。颗粒表面包被有用磺基丙基官能化的多羟基化聚合物。POROS HS是强阳离子交换剂，在1-14的pH范围中具有完全的表面离子化。POROS HS具有最高的结合能力并且推荐用于通往规模放大的应用。可以考虑的其它树脂包括Source 30S、Toyopearl SP 和 SP Sepharose0
[0145]Jiang等公开了使用在pH4.5-6.0的NaCl洗脱梯度的阳离子交换层析的应用，以纯化在糖工程化的巴斯德毕赤酵母中表达的重组抗HER2单克隆抗体(Protein Expressionand Purification 76:7 (2011))。
[0146]所公开的方法的阳离子交换层析CEX步骤优选以结合和洗脱模式操作。阳离子交换层析优选使用在PH4.0的NaCl洗脱梯度进行。此缓冲液还包含稳定化赋形剂(精氨酸)，其允许在较低PH的成功操作。如本文所示，已经发现CEX高效地消除宿主细胞蛋白(HCP)、DNA和浸出的蛋白A配体，同时保留具有高TSA水平的TNFR = Fc融合蛋白。所公开的方法的CEX步骤提供用于包含Fe的蛋白的中间纯化步骤。该步骤旨在提供宿主细胞蛋白、包含Fe的蛋白聚集物和不完全的包含Fe的蛋白的片段的减少、降低或消除，以及旨在浓缩包含Fe的蛋白的制品。
[0147]优选地，蛋白A洗脱物(PAP)直接加载到阳离子交换柱上。优选在比待纯化的Fe融合蛋白的Pl低至少一个单位的pH下进行加载。将包括包含Fe的蛋白的流体加载到阳离子交换树脂上之前，蛋白A洗脱物的pH调整到低于5的pH，优选约pH 4，或者作为替代，用水稀释到在约PH 7低于约4mS/cm的电导率。优选pH调整到约4，因为它通过添加浓缩的乙酸而容易地进行，而不显著增加加载体积。这对于允许包含Fe的蛋白结合到阳离子交换树脂是必要的。
[0148]加载后，CEX柱使用优选为基于20mM至50mM磷酸盐的缓冲液清洗，其包含在pH
4.0的精氨酸。在步骤过程中，可以在蛋白稳定赋形剂(即，精氨酸，尿素)的存在下和/或较低的温度下使用3.5至6.0 ( 即，pH3.8)的pH范围。也可以使用基于乙酸盐的缓冲液(20-50mM)替换基于磷酸盐的缓冲液。CEX清洗也可以采用中间电导率，其高于平衡条件，但低于洗脱电导率，即8mS/cm、10mS/cm、12mS/cm。
[0149]在本发明的CEX步骤中，使用递增的盐梯度，在比包含Fe的蛋白的等电点低I个单位的PH下从阳离子交换树脂上洗脱包含Fe的蛋白。可以使用任何合适的盐，例如NaCl或KCl进行包含Fe的蛋白的洗脱。在一个实施方案中，根据本发明的方法的递增的盐梯度优选是浅的NaCl梯度。优选地，使用范围从约10至约50mS/cm的电导率在约3.5至约
6.0的pH的递增的NaCl梯度，将包含Fe的蛋白从阳离子交换树脂洗脱。可以通过使氯化钠浓度从OmM增加至约400mM或600mM，或800mM或1000mM或1200mM产生范围从约10至约60mS/cm的电导率梯度。在梯度过程中pH保持恒定并且可以在3.5-6.0之间。
[0150]可选地， 可以使用在阻止聚集物和HCPs洗脱的电导率和pH的缓冲液进行等度洗脱。优选地，使用从约10至约50mS/cm范围的电导率在约3.5至约6.0的pH的分步梯度，将包含Fe的蛋白从阳离子交换树脂上洗脱。可以通过分步使氯化钠浓度从至约400mM或600mM，或800mM或1000mM或1200mM产生范围从约10至约60mS/cm的电导率等度洗脱。作为洗脱步骤，也可以使用高于结合过程中使用的PH的提高的pH。
[0151]众所周知，精氨酸有效抑制蛋白聚集，并且将其以中等浓度包括在柱层析期间是常规实践(Arakawa, T 等人，Protein Expression and Purification 54:110 (2007))。CEX清洗和洗脱缓冲液还包含稳定化赋形剂(例如，精氨酸)，其允许在较低pH的成功操作。在包含TNFR-Fc的溶液中存在5mM至400mM的赋形剂(例如，精氨酸，胍)降低蛋白聚集和/或片段化的倾向，并且可以在一些情况下逆转效果或聚集或错误折叠。在不存在稳定化赋形剂的情况下，在CEX步骤过程中可能发生不可接受水平的聚集。
[0152]根据本发明，阳离子交换层析可以优选用于在2至5倍范围内消除或减少污染的蛋白A。
[0153]另外，本发明公开的方法的优化的CEX单位操作还减少了来自Fe融合蛋白制品的宿主细胞蛋白的浓度，例如在2至5倍范围内，从而显著地促进宿主细胞蛋白(HCP)的清除。
[0154]通过在280nm的吸光度监测包含Fe的蛋白的洗脱，并且在吸光度峰的下降阶段过程中收集级分。然后合并级分以避免洗脱峰尾部中聚集物和HCP并富集TSA水平，这在本文中称为“切掉尾部”。洗脱峰的尾部可以显示明显的肩峰，其可以优选地从主峰中去除。
[0155]AEX阴离子交换剂可以分类为弱或强阴离子交换剂。弱阴离子交换剂上的带电基团是弱碱，其在高PH下变为去质子化的并且因此丧失其电荷。DEAE-S印harose是弱阴离子交换剂的实例，其中的氨基在低于Ph-9可以带正电荷并在更高的pH值逐渐失去其电荷。例如，二乙基氨基乙基(DEAE)或二乙-(2-羟基-丙基)氨基乙基(QAE)具有氯作为平衡离子。另一方面，强阴离子交换剂包含强碱，其在正常用于离子交换层析的整个PH范围(pHl-14)保持带正电荷。Q-S印harose (Q代表季铵)是强阴离子交换剂的实例。
[0156]根据本发明，所述来自阳离子交换步骤的洗脱物然后进行阴离子交换层析，其在本发明中用作产品精加工步骤。根据本发明，来自阳离子交换步骤的洗脱物进行阴离子交换层析。阴离子交换层析可以在任何合适的阴离子交换树脂上进行，例如，如弱或强阴离子交换剂。在POROS HQ的名称下可商购获得的柱子是阴离子交换树脂的实例，其特别适合于本方法的AEX单元操作。
[0157]POROS HQ是设计用于肽、蛋白、多核苷酸和其它生物分子的阴离子交换层析的聚合物填料树脂。其由交联聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通颗粒组成，该颗粒具有用于非常快速的质量运输的专利授权的双模式孔径分布。POROS HQ介质表面包被有完全季铵化的聚乙烯亚胺。其是强阴离子交换剂，在1-14的pH范围具有完全的表面离子化。
[0158]典型地，CEX柱洗脱物在将其加载到阴离子交换柱之前稀释或透析到合适的加载缓冲液中。阴离子交换柱用加载缓冲液平衡。对于加载缓冲液优选的PH是高于pi—个单位。合适的pH值范围从6.0至8.5。对于加载缓冲液优选的电导率在2.0至4.6mS/cm的范围内。在所公开的纯化方法中使用的合适的平衡/加载缓冲液是浓度在从5至35，优选从20至30mM的范围的磷酸钠。对于洗脱缓冲液优选的pH是高于pi—个单位。合适的pH值范围从6.0至8.5。对于洗脱缓冲液优选的电导率在7至20mS/cm的范围内。合适的洗脱缓冲液可以是例如浓度在从5至35，优选从70至200mM的范围的磷酸钠。
[0159]所公开的本发明的下游加工方法的优化的AEX单元操作进一步减少聚集体I至2倍并减少宿主细胞蛋白I至5倍。AEX层析进一步富集TSA水平并去除剩余的方法残留物。优选地，通过在280nm的吸光度监测从OmM至IOOmM的NaCl梯度洗脱和包含Fe的蛋白的洗脱，并且在吸光度峰的下降阶段过程中收集级分。然后合并级分以便避免聚集物和HCP。在峰的尾部包含富集的TSA水平。
[0160]轺滤
本发明的本纯化方法包括一个或多个超滤步骤。超滤可用于去除从先前的层析步骤获得的洗脱物中的有机小分子和盐，以将Fe融合蛋白平衡到下游纯化方法的下一步骤所需的缓冲液中，或浓缩Fe融合蛋白到所期望的浓度。这样的超滤可以在超滤膜上进行，所述膜具有允许去除具有低于5、10、15、20、25、30 kDa或更多kDa的分子量的组分的孔径。
[0161]如果根据本发明的方法纯化的蛋白旨在用于施用给人，则在方法中包括一个或多个病毒去除步骤是有利的。在实践中，病毒去除过滤步骤在最终的层析步骤之后，在散装产品(bulk product)配制之前进行。
[0162]下文提供实施例以进一步阐释本发明的不同特征。这些实施例也阐释用于实践本发明的可用方法。这些实例不限制所请求保护的发明。
_3] 缩略语的词汇 表
阴离子交换层析AEX
【权利要求】
1.从样品中除去一种或多种杂质，纯化Fe融合蛋白的方法，其包括以下步骤: a)提供包含在真核表达系统中产生的Fe融合蛋白的样品； b)使存在于样品中的Fe融合蛋白结合到蛋白A亲和层析树脂； c)从蛋白A树脂洗脱Fe融合蛋白，其中洗脱的产品提供第二样品，任选地称为蛋白A产品(PAP)； d)使PAP结合到阳离子交换(CEX)层析树脂； e)从CEX树脂洗脱第二样品，其中洗脱的产品提供第三样品，任选地称为CEX产品(CEXP)； f)使CEXP结合到阴离子交换(AEX)层析树脂；和 g)从AEX树脂洗脱第三样品，其中洗脱的产品提供纯化的Fe融合蛋白组合物。
2.根据权利要求1的方法，其中Fe融合蛋白是p75TNFR:Fc。
3.根据权利要求1的方法，其中使用50mM柠檬酸盐pH 5.0至100 mM柠檬酸盐pH4.0的梯度进行步骤c)中的洗脱。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤b)进一步包括: b’)使用具有从3至7范围的 pH和10 ms/cm至50 ms/cm范围的电导率的缓冲液，清洗结合的Fe融合蛋白。
5.根据权利要求1的方法，其中使用包含25mM精氨酸的25mM磷酸钠缓冲液，pH4.0，作为线性离子强度梯度进行步骤e)中的洗脱。
6.根据权利要求1的方法，其中步骤d)进一步包括: d’)使用具有从3至7范围的pH和10 ms/cm至50 ms/cm范围的电导率的缓冲液，清洗结合的Fe融合蛋白。
7.根据权利要求1的方法，其中使用12.5mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，作为线性离子强度梯度进行步骤g)中的洗脱。
8.根据权利要求1的方法，其中步骤d)进一步包括: d’)使用具有从3至7范围的pH和10 ms/cm至50 ms/cm范围的电导率的缓冲液，清洗结合的Fe融合蛋白。
9.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白A层析树脂是POROSMabCapture A。
10.根据权利要求1的方法，其中所述CEX层析步骤在选自下列的强阳离子交换树脂上进行:Poros HS、Poros XS> SP Sepharose、Toyopearl SP> SP Sepharose BB、Source 30S、TSKGel SP-5PW-HR20和Toyopearl SP 650，并且所述AEX层析步骤在选自下列的强阴离子交换树脂上进行:Poros HQ、Q-Sepharose、Q-Ceramic Hyper D、Toyopearl Q.UNO Q。
11.根据权利要求10的方法，其中所述CEX层析树脂是PotosHS强阳离子交换树脂并且所述AEX层析树脂是Poros HQ强阳离子交换树脂。
12.根据权利要求1的方法，其中所述包含Fe融合蛋白的样品是哺乳动物细胞培养液或酵母发酵培养液。
13.根据权利要求12的方法，其中所述包含Fe融合蛋白的样品是酵母发酵培养液，并且步骤a)进一步包括: a’)将所述包含Fe融合蛋白的样品的pH调整到pH 8_9之间，和使所述样品与重折叠剂和解聚剂接触。
14.根据权利要求13的方法，其中所述重折叠剂选自:精氨酸、甘油、EDTA、TMAO,PEG-3500或氧化还原剂，并且所述解聚剂选自尿素或盐酸胍。
15.根据权利要求13的方法，其中将所述包含Fe融合蛋白的样品的pH调节到8.6。
16.根据权利要求1的方法，其中在步骤g)中获得的纯化的Fe融合蛋白组合物提供具有>99%的纯度的产品。
17.根据权利要求1的方法，其中在步骤g)中获得的纯化的Fe融合蛋白组合物的特征在于>18mMol的TSA水平。
18.通过根据权利要求1的方法获得的纯化的包含Fe的融合蛋白。
19.通过根据权利要求1的方法获得的纯化的TNFR:Fc蛋白。
20.高度纯化的TNFR= Fc蛋白，其在CHO细胞培养表达系统中产生并通过权利要求1的方法纯化，其 中所述纯化的蛋白具有>99%的纯度和>18mMol的TSA水平。
【文档编号】C07K16/00GK103814044SQ201280043885
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年7月3日 优先权日:2011年7月8日
【发明者】I.C.伊克楚库, J.恩蒂-吉亚巴, M.佩特罗夫, C.李 申请人:默沙东公司