含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法
【专利摘要】含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，通过在该含有胰液成分的生物试样中添加至少一种以上的具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂，对该生物试样中的蛋白酶的酶活性进行抑制。此外，该含有胰液成分的生物试样用蛋白酶抑制剂是具有氟磺酰基的化合物，具有蛋白酶抑制活性且为了抑制该生物试样中的蛋白酶而被添加到含有胰液成分的生物试样中。进而，该含有胰液成分的生物试样的保存用试剂盒，含有至少1种以上的具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂，被用于保存含有胰液成分的生物试样。
【专利说明】含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于抑制含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的酶活性的方法，对胰液或十二指肠液中的来自胰液的成分的分解的抑制有效的蛋白酶抑制剂、及含有该蛋白酶抑制剂的胰液等生物试样保存用试剂盒。
[0002]本申请基于2011年9月13日在日本提出的日本特愿2011-199357号主张优先权，在此引用该内名
【背景技术】
[0003]体液是用于获知脏器状态的重要的生物试样。胰液也是用于了解胰腺状态的重要的生物试样，可以用于细胞诊断、碳酸氢盐测定、细菌检查、由蛋白质和/或核酸等组成的标志物的检查等。在研究中，也在广泛进行胰腺癌等胰腺相关疾病的新标记物的探索。
[0004]由于胰液是消化液，因此含有各种各样的消化酶。已经知道这些消化酶虽然在胰腺内以非活性状态存在，在排出到十二指肠后活化。胰液中的消化酶，在由十二指肠上皮细胞分泌的小肠肠激酶的作用下，进行分解级联反应。已知胰液中含有的胰蛋白酶原在小肠肠激酶的作用下活化，变成胰蛋白酶，进而该胰蛋白酶成为诱因，将胰凝乳蛋白酶原、酯酶原等各种消化酶(蛋白酶)活化。另外，据说胰蛋白酶原占胰液总蛋白量的约12%左右(例如，参照非专利文献2)。通过这些各种消化酶的活化，胰液中含有的蛋白质、核酸、脂质、细胞等生物分子在排出到十二指肠之后被分解、变性。因此，在对排向十二指肠的胰液进行细胞检查、生物分子测定等 检查、研究发挥作用的场合，担心胰液中的作为目的物的细胞、蛋白质等会受到蛋白酶的影响，导致不能进行准确地测定。因此，如何抑制排出到十二指肠的胰液中的蛋白酶活性变得重要。
[0005]作为以往为使胰液、十二指肠液中的各种分解酶的活性降低的方法之一，已有将采集到的胰液在冷却状态下保存，通过避开酶活性的最适温度来抑制活性的方法。一般而言，需要将采集到的胰液等立即置入冰中，并且，也需要迅速对该胰液等进行检查(例如，参照非专利文献I)。但是，在该方法中，一旦胰液等的温度升高，有可能再次进行酶反应。因此，通常使采集到的胰液总是保存在低温下，处理繁杂。此外，根据蛋白质的种类不同，即使是低温有时也会进行分解，因此单纯在低温下保存，对于抑制来自胰液成分的分解/变性等是不充分的。
[0006]已经公开为了测定胰液中的蛋白质，在于内窥镜下采集到的胰液0.5mL中添加抑肽酶0.2mL进行冷冻保存的方法(例如，参照非专利文献2)。通过冷冻保存，在保存期间内可以抑制胰液中几乎全部的蛋白酶的活性，可以稳定保存该胰液中的细胞、蛋白质等。但是，冷冻保存的胰液需要在测定前进行溶解，有时会再次进行溶解后的细胞、蛋白质等的分解。并且，在冷冻保存中作为解析对象的分子本身也有可能受损。
[0007]此外，作为保存生物试样、特别是保存血液的方法，已经公开在含有至少两种以上的蛋白酶抑制剂的容器中直接采集血液的方法(例如参见专利文献I。)。通过使采集到的血液立即与蛋白酶抑制剂接触，可以防止血液中的蛋白质的分解等。在该方法中，使用丝氨酸蛋白酶抑制剂和其他蛋白酶抑制剂，例如，将血液采集到含有AEBSF、抑肽酶、亮抑酶肽等丝氨酸蛋白酶抑制剂和E-64等半胱氨酸蛋白酶等的容器中。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1:日本专利第4496407号公报
[0011]非专利文献
[0012]非专利文献1:勝沼等I人、“分析”、1978年、第10卷、第682~689页。
[0013]非专利文献2:横山等8人、Pancreas、2002年、第24卷、第4号、第344~347页
【发明内容】
[0014]发明要解决的问题
[0015]为了使采集到的胰液、十二指肠液等稳定且容易处理，可以认为与专利文献I中所记载的方法同样地在采集到的体液中添加蛋白酶抑制剂的方法是有用的。
[0016]但是，在血液中和胰液中含有的蛋白酶的种类差异很大。因此，即使在胰液、十二指肠液等含有胰液成分的体液中添加专利文献I中记载的有效地降低血液中的蛋白酶活性的蛋白酶抑制剂，也不能抑制该体液中的蛋白酶的活性。
[0017]本发明的目的在于，提供能够有效抑制胰液、十二指肠液等含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶活性的蛋白酶抑制剂，使用该抑制剂的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法及含有该蛋白酶抑制剂的胰液等生物试样保存用试剂盒。
`[0018]用于解决问题的方案
[0019]本发明人等为了解决上述课题进行了锐意研究，结果发现具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂对胰液中含有的蛋白酶的活性抑制效果最高，从而完成了本发明。
[0020](I)本发明的第一方式是一种含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，其通过在含有胰液成分的生物试样中添加至少I种以上的具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂，对该生物试样中的蛋白酶的酶活性进行抑制。
[0021](2)在前述(I)的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂优选为选自由PMSF、AEBSF、p-APMSF、4-(氟磺酰)苯甲酸、3_(氟磺酰)苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟及4-硝基苯磺酰氟组成的组中的I种以上的化合物。
[0022](3)在前述(I)的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂优选为选自由PMSF、AEBSF及p-APMSF组成的组中的I种以上的化合物。
[0023](4)在前述(I)的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂优选为选自由PMSF、AEBSF及p-APMSF组成的组中的2种以上。
[0024](5)在前述(I)~(4)的任一项的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法中，优选按照PMSF的最终浓度为ImM以上、AEBSF的最终浓度为4mM以上、或p-APMSF的最终浓度为2mM以上的方式，在所述生物试样中添加PMSF、AEBSF或p-APMSF。
[0025](6)在前述(I)~(5)的任一项的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法中，优选在所述生物试样中进而添加至少I种以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制剂。[0026](7)在前述(6)的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有磺酰基的蛋白酶抑制剂优选为氨基酸氯甲基酮类。
[0027](8)在前述(6)的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有磺酰基的蛋白酶抑制剂优选为选自由TLCK及TPCK组成的组中的I种以上。
[0028](9)在前述(6)的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法中，所述具有磺酰基的蛋白酶抑制剂优选为TLCK。
[0029](10)在前述(I)~(9)的任一项的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法中，所述生物试样优选为胰液或十二指肠液。
[0030](I I)本发明的第二方式是含有胰液成分的生物试样用蛋白酶抑制剂，其是具有氟磺酰基的化合物，具有蛋白酶抑制活性且为了抑制该生物试样中的蛋白酶而被添加在含有胰液成分的生物试样中。
[0031](12)前述(11)的含有胰液成分的生物试样用蛋白酶抑制剂优选为选自由PMSF、AEBSF, p-APMSF、4-(氟磺酰)苯甲酸、3_(氟磺酰)苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟及4-硝基苯磺酰氟组成的组中的化合物。
[0032](13)前述(11)的含有胰液成分的生物试样用蛋白酶抑制剂优选为选自由PMSF、AEBSF及p-APMSF组成的组中的化合物。
[0033](14)本发明的第三方式是蛋白酶抑制剂混合物，其含有至少I种以上的前述
(11)~(13)中任一项的生物试样用蛋白酶抑制剂。
[0034](15)前述(14)的蛋白酶抑制剂混合物进而优选为含有至少I种以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制剂。
[0035](16)本发明的第四方式是含有胰液成分的生物试样的保存用试剂盒，其含有至少I种以上的具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂，被用于保存含有胰液成分的生物试样。
[0036](17)前述(16)的含有胰液成分的生物试样的保存用试剂盒，进而优选为含有至少I种以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制剂。
[0037](18)前述(16)或(17)的含有胰液成分的生物试样的保存用试剂盒，进而优选含有具有用于储存所采集的体液的储存部的保存用容器，并且在所述储存部预先包含所述具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂。
[0038]发明的效果
[0039]本发明的第二方式的含有胰液成分的生物试样用蛋白酶抑制剂及本发明的第三方式的蛋白酶抑制剂混合物能够非常有效地抑制胰液、十二指肠等含有胰液成分的生物试样中含有的蛋白酶。因此，使用该蛋白酶抑制剂的本发明的第一方式的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，可以有效抑制含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的活性。因此，通过该抑制方法，可以抑制来自胰液的成分的分解等，可以稳定地保存含有胰液成分的生物试样。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1是表示PMSF、AEBSF及p-APMSF的化学式的图。
[0041]图2是表示在实施例1中由各胰酶溶液测定的荧光量的图。[0042]图3是表示在实施例2中各试样溶液的S100P的测定结果的图。
[0043]图4是表示在实施例3中由各试样溶液测定的荧光量的图。
[0044]图5是表示在实施例4中由各试样溶液测定的荧光量的图。
[0045]图6是表示在实施例5中由各试样溶液测定的荧光量的图。
[0046]图7是表示在实施例5中由各试样溶液测定的荧光量的图。
[0047]图8是表示在实施例6中各试样溶液的蛋白酶活性(相对值:%)的结果的图。
[0048]图9是表示在实施例7中添加了 PMSF的各试样溶液的蛋白酶活性(相对值:%)的结果的图。
[0049]图10是表示在实施例7中添加了 AEBSF的各试样溶液的蛋白酶活性(相对值:%)的结果的图。
[0050]图11是表示在实施例7中添加了 P-APMSF各的试样溶液的蛋白酶活性(相对值:%)的结果的图。
[0051]图12是表示在实施例8中由添加了 I种蛋白酶抑制剂的各试样溶液测定的荧光量的图。
[0052]图13是表示在实施例8中由添加了 2种蛋白酶抑制剂的各试样溶液测定的荧光量的图。
[0053]图14是表示在实施例9中由添加了各种蛋白酶抑制剂的各试样溶液测定的荧光量的图。
【具体实施方式】
[0054]胰液是指从胰管排出的体液。在本发明及本申请说明书中，所谓的含有胰液成分的生物试样是指含有包含来自胰液的成分的体液的试样。作为含有来自胰液的成分的体液，可以列举通过导管直接从胰腺采集到的胰液、在十二指肠采集到的液体(十二指肠液)等。在十二指肠液中，除了含有胰液，还含有同样地从乳头部排出的胆汁、原本就存在于十二指肠的液体、血液等。关于胰液、十二指肠液，可以通过常用方法进行采集。
[0055]<含有胰液成分的生物试样用蛋白酶抑制剂>
[0056]本发明的第二方式的含有胰液成分的生物试样用蛋白酶抑制剂(以下，有时称作“本发明的蛋白酶抑制剂”)，其特征在于，其是具有氟磺酰基的化合物，具有蛋白酶抑制活性且为了抑制该生物试样中的蛋白酶而被添加到含有胰液成分的生物试样中。
[0057]本发明的蛋白酶抑制剂只要是具有氟磺酰基且具有蛋白酶抑制活性的化合物就没有特别的限制，但是优选具有氟磺酰基直接或通过碳原子数为I~6的烃基键合在苯环上的结构的化合物，优选为PMSF (苯甲基磺酰氟)，AEBSF (4- (2-氨乙基)-苯磺酰氟))，P-APMSF (对脒基苯基甲磺酰氟盐酸盐)，4-(氟磺酰)苯甲酸(CAS号:455-26-5)、3-(氟磺酰)苯甲酸(CAS号:454-95-5)、2_氨基苯磺酰氟(CAS号:392_86-9)、3_氨基苯磺酰氟(CAS号:368-50-3)、4_氨基苯磺酰氟(CAS号:98-62_4)、2-硝基苯磺酰氟(CAS号:433-98-7)、3-硝基苯磺酰氟(CAS号:349-78-0)或4-硝基苯磺酰氟(CAS号:349_96_2)，更优选为PMSF、AEBSF或p-APMSF。PMSF、AEBSF及p-APMSF的化学式如图1所示。图1中被虚线包围的官能团是氟磺酰基。
[0058]本发明的蛋白酶抑制剂也可以作为由多种蛋白酶抑制剂组成的混合物中的有效成分之一。作为蛋白酶抑制剂混合物，可以是仅由本发明的蛋白酶抑制剂组成的物质，也可以是I种或2种以上的本发明的蛋白酶抑制剂与其他的蛋白酶抑制剂的混合物。作为其他的蛋白酶抑制剂，只要是不损害本发明的蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制活性的物质就没有特别的限制，可以列举例如抑肽酶、亮抑酶肽、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性酶抑制剂(elastatinal)、抗凝血酶等肽系蛋白酶抑制剂，EDTA等螯合剂,弹性蛋白酶酶抑制剂(Elastase Inhibitor), TLCK, TPCK,膜蛋白酶抑制剂，Ecotin, E.coli 等。此外，也可以使用甲磺酸加贝酯(FOY)、甲磺酸卡莫司他(Foipan)、甲磺酸萘莫司他(Futhan)、乌司他丁等胰腺炎治疗药。
[0059]作为与本发明的蛋白酶抑制剂组合使用的其他蛋白酶抑制剂，优选至少一种以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制剂，更优选为氨基酸氯甲基酮类。作为该氨基酸氯甲基酮类，只要是具有蛋白酶抑制活性的物质就没有特别的限制，可以列举TLCK (N-a-甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲基酮)、TPCK (N-a-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮)等。在本发明中，特别优选选自由TLCK及TPCK组成的组中的I种以上物质，更优选为TLCK。
[0060]作为包含以本发明的蛋白酶抑制剂为首的多种蛋白酶抑制剂的混合物，优选含有2种以上的本发明的蛋白酶抑制剂，更优选含有2种以上的本发明的蛋白酶抑制剂和至少I种具有磺酰基的蛋白酶抑制剂，进而优选含有2种以上的本发明的蛋白酶抑制剂和至少I种具有蛋白酶抑制活性的氨基酸氯甲基酮类，特别优选含有选自由PMSF、AEBSF及p-APMSF组成的组中的2种以上和选自由TLCK及TPCK组成的组中的I种以上。
[0061]<含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法>
[0062]本发明的第一方式的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法(以下，有时称作“本发明的蛋白酶抑制方法”)，其特征在于，通过在含有胰液成分的生物试样中添加至少I种以上的具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂(即、本发明的蛋白酶抑制剂)，抑制该生物试样中的蛋白酶的酶活性。本发明的蛋白酶抑制剂与其他的蛋白酶抑制剂相比，对胰液、十二指肠液中含有的蛋白酶的抑制活性非常高。因此，通过在含有胰液成分的生物试样中添加本发明的蛋白酶抑制剂，能够简便且`有效地抑制该生物试样中的来自胰液、十二指肠液的蛋白酶引起的胰液成分的分解。
[0063]供于本发明的蛋白酶抑制方法的含有胰液成分的生物试样，只要是含有包含来自胰液的成分的体液的试样就可以。例如，可以是仅由含有来自胰液成分的体液组成的物质，也可以是以适当缓冲液等对该体液进行稀释后的液体，也可以是在该体液或其稀释液中添加了各种添加剂的物质。作为添加剂，可以列举表面活性剂、核酸酶抑制剂、pH调整剂、pH指示剂等。作为供于本发明的蛋白酶抑制方法的含有胰液成分的生物试样，优选为含有胰液、十二指肠液的试样。具体而言，可以列举胰液、十二指肠液、胰液或十二指肠液的稀释液、或在这些液体中添加了前述各种添加剂的液体等。
[0064]在本发明的蛋白酶抑制方法中，可以在从生物体采集后被保存等的含有胰液成分的生物试样中添加本发明的蛋白酶抑制剂，但是优选从生物体采集含有胰液成分的体液时到添加本发明的蛋白酶抑制剂时的间隔短，特别优选在刚从生物体采集后的胰液或十二指肠液中添加本发明的蛋白酶抑制剂。
[0065]作为胰液中含有的蛋白酶，有丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、羧肽酶等各种物质。因此，在此前被用于胰液等的蛋白酶抑制剂中，仅仅添加I种的场合得到的蛋白酶抑制效果非常有限，即使将多种蛋白酶抑制剂进行组合的场合也没有得到充分的蛋白酶抑制效果的报告。与此相反，作为本发明的蛋白酶抑制剂，即使仅使用I种的场合，通过适当地调整添加量也能得到充分的蛋白酶抑制效果。
[0066]在本发明的蛋白酶抑制方法中使用的本发明的蛋白酶抑制剂，即使只有I种也能充分发挥蛋白酶抑制活性，但是优选将2种以上进行组合使用。此外，也可以与本发明的蛋白酶抑制剂组合使用I种或2种以上的其他蛋白酶抑制剂。作为本发明的蛋白酶抑制方法中使用的本发明的蛋白酶抑制剂，优选至少含有选自由PMSF、AEBSF及p-APMSF组成的组中的一种以上物质，更优选组合含有选自由PMSF、AEBSF及p-APMSF组成的组中的2种以上。由于胰液中含有活性不同的各种蛋白酶，因此通过混合使用多种蛋白酶抑制剂，可以期待更有效地抑制生物试样中的蛋白酶活性。进而，可以期待与单独使用的场合相比，以低浓度组合来抑制蛋白酶活性。
[0067]被添加到含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶抑制剂的量，只要是通过该蛋白酶抑制剂能够发挥蛋白酶抑制效果的量就没有特别的限制，可以考虑含有胰液成分的生物试样的种类、使用的蛋白酶抑制剂的种类等，进行适当地调整。例如，在含有胰液成分的生物试样中，作为蛋白酶抑制剂仅添加PMSF的场合，可以按照最终浓度为ImM以上，优选为5mM以上，更优选为IOmM以上的方式进行添加。此外，作为蛋白酶抑制剂仅使用AEBSF的场合，可以按照最终浓度为4mM以上，优选为IOmM以上，更优选为20mM以上的方式在含有胰液成分的生物试样中添加AEBSF。作为蛋白酶抑制剂仅使用p-APMSF的场合，可以按照最终浓度为2mM以上，优选为5mM以上，更优选为IOmM以上的方式在含有胰液成分的生物试样中添加 p-APMSF。
[0068]此外，作为与至少一种以上的具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂(本发明的蛋白酶抑制剂)组合使用的其 他蛋白酶抑制剂仅添加TLCK的场合，可以按照最终浓度为0.1mM以上、优选为ImM以上、更优选为5mM以上、进而优选为IOmM以上的方式进行添加。此外，作为该其他蛋白酶抑制剂仅添加TPCK的场合，可以按照最终浓度为0.1mM以上，优选为ImM以上，更优选为5mM以上，进而优选为IOmM以上的方式进行添加。
[0069]在本发明的蛋白酶抑制方法中，被添加到含有胰液成分的生物试样中的本发明的蛋白酶抑制剂及其他蛋白酶抑制剂，可以是粉末状、颗粒状等的固体状，也可以是使其溶解到合适的缓冲液等中的蛋白酶抑制剂溶液。此外，本发明的蛋白酶抑制剂和其他蛋白酶抑制剂，可以同时添加到含有胰液成分的生物试样中，也可以先添加其中之一，然后再添加其他的。从能够对生物试样中的蛋白酶充分发挥抑制效果的观点出发，优选将具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂和前述其他蛋白酶抑制剂同时进行添加。
[0070]通过在含有胰液成分的生物试样中添加本发明的蛋白酶抑制剂，由于该生物试样中含有的蛋白酶的活性被有效地抑制，因此可以显著抑制该生物试样中含有的胰液成分的分解/变性等。因此，作为蛋白酶被本发明的蛋白酶抑制方法抑制的含有胰液成分的生物试样，对来自胰液成分的生物体成分可以更稳定地保存。此外，通过对蛋白酶被本发明的蛋白酶抑制方法抑制的含有胰液成分的生物试样进行胰液成分解析，可以提高解析精度，得到可靠性高的结果。
[0071 ] 作为蛋白酶被本发明的蛋白酶抑制方法抑制的含有胰液成分的生物试样，可以与其他生物试样一样，作为用于各种检查的测定试样。作为检查对象的物质，只要是预期胰液或十二指肠液中含有的生物体成分就没有特别的限制，可以是蛋白质，也可以是DNA、RNA等核酸，还可以是细胞。例如，该生物试样可以在应用ELISA、免疫层析、双向电泳、免疫印迹法、质谱分析法等的各种蛋白质分析中和在应用PCR、RT-PCR、用探针的杂交等的各种核酸解析中，在细胞计数、细胞诊断这样的细胞解析等中使用。
[0072]<含有胰液成分的生物试样的保存用试剂盒>
[0073]本发明的第四方式的含有胰液成分的生物试样的保存用试剂盒(以下，有时称作“本发明的保存用试剂盒”)，含有至少一种以上的具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂(即、本发明的蛋白酶抑制剂)，被用于保存含有胰液成分的生物试样。通过使用该试剂盒，可以更简便地抑制含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶。本发明的保存用试剂盒中含有的本发明的蛋白酶抑制剂，可以只是一种，也可以是2种以上的组合。此外，作为该试剂盒，进而优选含有至少I种以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制剂，更优选含有至少一种以上的具有蛋白酶抑制活性的氨基酸氯甲基酮类。
[0074]此外，作为本发明的保存用试剂盒中含有的本发明的蛋白酶抑制剂，可以是冷冻干燥粉末，也可以是将冷冻干燥粉末与合适的赋形剂等一起成型的片剂或颗粒剂等，也可以是使其溶解到适当的缓冲液中的蛋白酶抑制剂溶液。
[0075]本发明的保存用试剂盒，进而，也可以含有用于将采集到的体液进行稀释的缓冲液、其他蛋白酶抑制剂、表面活性剂、PH调整剂、pH指示剂等。作为表面活性剂、pH调整剂、PH指示剂等各种添加剂，可以使其预先溶解到稀释用的缓冲液中。
[0076]另外，作为本发明的保存用试剂盒，也可以含有能够与该容器的开口部结合的盖子，所述盖子能够从填充 有该含有胰液成分的试样的容器中滴加一定量的所调制的含有胰液成分的试样(在含有胰液成分的生物试样中添加本发明的保存用试剂盒中所含有的各种蛋白酶抑制剂，并根据需要添加其他成分而成的试样)。
[0077]作为本发明的保存用试剂盒，进而，也可以含有具备用于储存采集自生物体的胰液或十二指肠液等的体液的储存部的保存用容器。这种场合，本发明的蛋白酶抑制剂及其他蛋白酶抑制剂优选预先包含在该储存部。在该保存用容器上刻有刻度的场合，可以对被添加到该保存容器的生物试样的量(在该保存容器内预先填充蛋白酶抑制剂的场合，生物试样和蛋白酶抑制剂的总量)进行目视确认，甚至可以一眼了解蛋白酶抑制剂的最终浓度。
[0078]此外，含有胰液成分的生物试样，一般经内窥镜进行采集。因此，作为本发明的保存用试剂盒的组成品，也包含经内窥镜采集含有胰液成分的生物试样的采集器具。作为该采集器具，例如包括:在可以插入到内窥镜装置的导管上组装了注射器的器具、前端配置有可以插入到内窥镜装置的吸收体的探针等。作为可以插入到内窥镜装置的导管，可以列举例如:日本特开2011-5009号公报记载的标本采集管等。作为这些采集器具，优选具有预先分注了前述蛋白酶抑制剂的储存部。
[0079][实施例]
[0080]接下来示出实施例等对本发明进行更详细的说明，但是本发明不限于以下的实施例。
[0081][实施例1]
[0082]为了调查对胰液而言效果最好的蛋白酶抑制剂，从市售的8种蛋白酶抑制剂混合物中搜索对胰液的抑制效果最好的蛋白酶抑制剂混合物。使用的蛋白酶抑制剂混合物为:complete (Roche 公司产品)(抑制剂混合物 I)、Halt Pr otease Inhibitor Cocktail(Thermo 公司产品)(抑制剂混合物 2)、Protease In hibitor Cocktail (SIGMA 公司产品)(抑制剂混合物3)、Protease Inhibitor Mix (GE公司产品)(抑制剂混合物4)、ProteaseInhibitor Cocktail set I (M ERCK 公司产品)(抑制剂混合物 5)、Protease InhibitorCocktail set IKME RCK公司产品)(抑制剂混合物6)、Protease Inhibitor Cocktail setIII (ME RCK 公司产品)(抑制剂混合物 7)、及 Protease Inhibitor Cocktail (BioVision公司产品)(抑制剂混合物8)。
[0083]使用胰酶以活化状态存在的、由猪胰腺制得的作为消化酶剂的“胰酶”作为模拟人工胰液，按照最终浓度为制造方的推荐浓度(IX)或推荐浓度的5倍浓度(5X)的方式添加各种蛋白酶抑制剂混合物后，测定了蛋白酶的活性。关于蛋白酶活性，使用EnzCheckProtease Assay Kits (Molecular Probes公司产品)进行测定。具体而言，在添加了各种蛋白酶抑制剂混合物的胰液溶液中添加试剂盒中附带的荧光标识过的酪蛋白，在37°C下孵育2小时后，以Ex/Em = 485/535nm的荧光波长测定荧光量。此外，作为对照，对在胰酶中直接添加进行过荧光标识的酪蛋白的试样溶液(无抑制剂、无DMS0)、在胰酶中按照达到与使各种蛋白酶抑制剂混合物为制造方推荐浓度(IX)而添加的场合同样的DMSO添加量的方式添加DMSO的试样溶液(无抑制剂、DMS01X)，及在胰酶中按照达到与使各种蛋白酶抑制剂混合物为制造方推荐浓度(5X )而添加的场合同样的DMSO添加量的方式添加DMSO的试样溶液(无抑制剂、DMS05X)，同样地测定了蛋白酶活性。
[0084]各种胰酶溶液的荧光量的测定结果如图2所示。纵轴的荧光量表示分解的酪蛋白的量，将该值粗略算作蛋白酶活性的值。根据这些结果，发现抑制剂混合物4 (GE公司的Protease Inhibitor Mix)的抑制效果最好。
[0085][实施例2]
[0086]关于通过抑制蛋白酶活性对胰液中的蛋白质的保存稳定性产生怎样的影响进行了研究。调查了在混合有通常存在于胰液中的SlOOP(钙结合蛋白)和胰酶(模拟胰液)的溶液中，SlOOP在添加蛋白酶抑制剂的场合和无添加的场合能够以怎样的程度被保存。
[0087]具体而言，首先调制25ng/mL的SlOOP (标准品)溶液(试样溶液I)、含有25ng/mL的SlOOP (标准品)及lmg/mL的胰酶的溶液(试样溶液2)、含有25ng/mL的SlOOP (标准品)及lmg/mL的胰酶并且含有推荐浓度的2倍浓度(2X )的Protease Inhibitor Mix (GE公司产品)的溶液(试样溶液3)、含有25ng/mL的SlOOP (标准品)及lmg/mL的胰酶并且含有推荐浓度的5倍浓度(5X )的complete (Roche公司产品)的溶液(试样溶液4)。各种试样溶液应用Circu Lex SlOOP ELISA Kit (Cyclex公司产品、目录编号:CY_8060)附带的缓冲液进行调制。通过将这些试样溶液在25°C下进行16小时的孵育使其反应。然后，对使用Circu Lex SlOOP ELISA Kit (Cyclex公司产品、目录编号:CY_8060)附带的缓冲液将各试样溶液进行10倍稀释而成的稀释液，使用CircuLex SlOOP ELISA Kit检测S100P。
[0088]各试样溶液中的SlOOP的测定结果如图3所示。结果，与未添加蛋白酶抑制剂混合物的试样溶液2相比，添加了蛋白酶抑制剂混合物的试样溶液3及4残留的S100P的量多。此外，添加了比试样溶液3中添加的蛋白酶抑制剂混合物具有更高蛋白酶抑制活性的蛋白酶抑制剂混合物(参照实施例1。)的试样溶液4，其残留的S100P的量比试样溶液3更多。根据这些结果可知，通过在胰液中添加蛋白酶抑制剂，可以抑制胰液中的蛋白质的分解，更稳定地进行保存。此外，这也暗示蛋白酶活性与SlOOP的检测浓度存在相关性。
[0089][实施例3]
[0090]研究了实施例1中的蛋白酶抑制活性最高的抑制剂混合物中含有的各种蛋白酶抑制剂中，对于胰液的蛋白酶而言哪种蛋白酶抑制剂具有最高的抑制活性。
[0091]Protease Inhibitor Mix(GE公司产品)中含有的丝氨酸蛋白酶抑制剂有抑肽酶、亮抑酶肽、PMSF, AEBSF4种(浓度非公开)。因此，按照使最终浓度为各蛋白酶抑制剂单剂的推荐最大浓度的方式进行调制，对4种抑制剂的组合共15种，与实施例1同样地使用胰酶及2种胰液被检体对蛋白酶活性进行测定。各试样溶液中添加的蛋白酶抑制剂如表1所示。另外，推荐最大浓度如下:抑肽酶(Roche公司产品)为0.3 μ M、亮抑酶肽(Roche公司产品)为50yM、PMSF (Roche公司产品)为lmM、AEBSF (Roche公司产品)为4mM。此外，同样地对未添加蛋白酶抑制剂的试样溶液(对照试样溶液I)、含有推荐浓度的抑制剂混合物I(Roche公司的complete)的试样溶液(对照试样溶液2)、含有推荐浓度的5倍浓度(5X )的抑制剂混合物I的试样溶液(对照试样溶液3)、含有推荐浓度的抑制剂混合物4 (GE公司产品Protease Inhibitor Mix)的试样溶液(对照试样溶液4)及含有推荐浓度的5倍浓度(5X )的抑制剂混合物4的试样溶液(对照试样溶液5)的蛋白酶活性进行测定。
[0092]表1
[0093]
【权利要求】
1.一种含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，其通过在含有胰液成分的生物试样中添加至少I种以上的具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂，从而对该生物试样中的蛋白酶的酶活性进行抑制。
2.根据权利要求1所述的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，所述具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂为选自由PMSF、AEBSF, p_APMSF、4_(氟磺酰)苯甲酸、3-(氟磺酰)苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟及4-硝基苯磺酰氟组成的组中的I种以上。
3.根据权利要求1所述的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，所述具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂为选自由PMSF、AEBSF及p-APMSF组成的组中的I种以上。
4.根据权利要求1所述的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，所述具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂为选自由PMSF、AEBSF及p-APMSF组成的组中的2种以上。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，按照PMSF的最终浓度为ImM以上、AEBSF的最终浓度为4mM以上、或p-APMSF的最终浓度为2mM以上的方式，在所述生物试样中添加PMSF、AEBSF或p-APMSF。
6.根据权利要求1~5的任一项所述的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，在所述生物试样中进而添加至少I种以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制剂。
7.根据权利要求6所述的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，所述具有磺酰基的蛋白酶抑制剂为氨基酸氯甲基酮类。
8.根据权利要求6所述的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，所述具有磺酰基的蛋白酶抑制剂为选自由TLCK及TPCK组成的组中的I种以上。
9.根据权利要求6所述的含有胰液`成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，所述具有磺酰基的蛋白酶抑制剂为TLCK。
10.根据权利要求1~9的任一项所述的含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法，所述生物试样为胰液或十二指肠液。
11.一种含有胰液成分的生物试样用蛋白酶抑制剂，其是具有氟磺酰基的化合物，具有蛋白酶抑制活性且为了抑制该生物试样中的蛋白酶而被添加在含有胰液成分的生物试样中。
12.根据权利要求11所述的含有胰液成分的生物试样用蛋白酶抑制剂，其是选自由PMSF、AEBSF、p-APMSF、4-(氟磺酰)苯甲酸、3-(氟磺酰)苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟及4-硝基苯磺酰氟组成的组中的化合物。
13.根据权利要求11所述的含有胰液成分的生物试样用蛋白酶抑制剂，其是选自由PMSF, AEBSF及p-APMSF组成的组中的化合物。
14.一种蛋白酶抑制剂混合物，其含有至少I种以上的权利要求11~13中任一项所述生物试样用蛋白酶抑制剂。
15.根据权利要求14所述的蛋白酶抑制剂混合物，其进而含有至少I种以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制剂。
16.一种含有胰液成分的生物试样的保存用试剂盒，其含有至少I种以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制剂，被用于保存含有胰液成分的生物试样。
17.根据权利要求16所述的含有胰液成分的生物试样的保存用试剂盒，其进而含有至少I种以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制剂。
18.根据权利要求16或17所述的含有胰液成分的生物试样的保存用试剂盒，其进而含有具备用于储存所采集的 体液的储存部的保存用容器， 在所述储存部预先包含所述具有氟磺酰基的蛋白酶抑制剂。
【文档编号】C07C309/88GK103781904SQ201280043967
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年6月22日 优先权日:2011年9月13日
【发明者】片冈理惠, 中田真理, 守屋奈绪 申请人:奥林巴斯株式会社