Ag15多肽的完全抗原及其制备方法和抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种AG15多肽的完全抗原，所述AG15多肽的完全抗原由AG15多肽和交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联形成；其中，所述AG15多肽的序列为SEQ?ID?No.1所示的序列。这种AG15多肽的完全抗原具有较强的免疫原性，可以作为完全抗原投入使用。本发明还公开了一种上述AG15多肽的完全抗原的制备方法，以及与该AG15多肽的完全抗原特异性结合的AG15多肽的完全抗原的抗体。这种AG15多肽的完全抗原的抗体可以用于血清或组织中小鼠骨钙素蛋白质的检测。
【专利说明】AG15多肽的完全抗原及其制备方法和抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学领域，特别是涉及一种AG15多肽的完全抗原及其制备方法和抗体。
【背景技术】
[0002]骨钙素蛋白质是由成骨细胞分泌的，其含量随着年龄的变化而变化，通过血清骨钙素的含量可以了解成骨细胞的状态，对于骨质疏松的判定等具有重要的意义。
[0003]AG15多肽是小鼠骨钙素蛋白质分子中的一段保守序列，经过序列分析此段多肽具有抗原性的多肽。然而，AG15多肽自身的免疫原性较低，无法作为完全抗原投入使用。
【发明内容】
[0004]基于此，有必要提供一种AG15多肽的完全抗原。
[0005]此外，还有必要提供该AG15多肽的完全抗原的制备方法，以及与该AG15多肽的完全抗原特异性结合的抗体。
[0006]—种AG15多肽的完全抗原,所述AG15多肽的完全抗原由AG15多肽和交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联形成；
[0007]其中，所述AG15多肽的序列为SEQ ID N0.1所示的序列，所述AG15多肽通过半胱氨酸与所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联。
[0008]在一个实施例中，所述AG 15多肽与所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白的摩尔比为800 ~1000:1。
[0009]在一个实施例中，所述交联剂为马来酰亚胺。
[0010]一种AG15多肽的完全抗原的制备方法，包括如下步骤:
[0011]提供交联剂活化的匙孔血蓝蛋白，并用磷酸钠缓冲液对所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白进行重构，得到重构后的交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液；
[0012]提供AG15多肽，并将所述AG15多肽用偶联缓冲液或双蒸水溶解，得到AG15多肽溶液；
[0013]将所述重构后的交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液和所述AG15多肽溶液混匀后充分反应，分离纯化后得到由所述AG15多肽和所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联形成AG15多肽的完全抗原，其中，所述AG15多肽的序列为SEQ ID N0.1所示的序列，所述AG15多肽通过半胱氨酸与所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联。
[0014]在一个实施例中，所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液的浓度为5mg/mL ；
[0015]所述AG15多肽溶液的浓度为8mg/mL。
[0016]在一个实施例中，将所述重构后的交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液和所述AG15多肽溶液混匀的操作中，所述AG15多肽与所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白的摩尔比为800 ~1000:1。
[0017]在一个实施例中，所述交联剂为马来酰亚胺。[0018]在一个实施例中，分离纯化后得到由所述AG15多肽和所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联形成AG15多肽的完全抗原的操作为:
[0019]用30mL含有质量百分数为0.01%的叠氮钠PBS缓冲液平衡S印hadex G-25M凝胶柱，接着向所述Sephadex G-25M凝胶柱加入反应液,用总体积IOmL的所述PBS缓冲液洗涤，收集洗出液，每次收集0.5mL~1.0mL，在280nm下测量吸光度值，根据吸光度值收集含蛋白洗脱液。
[0020]一种AG15多肽的完全抗原的抗体，所述AG15多肽的完全抗原的抗体与上述的AG15多肽的完全抗原特异性结合。
[0021]一种AG15多肽的完全抗原的抗体，所述AG15多肽的完全抗原的抗体为上述的AG15多肽的完全抗原作为抗原被免疫系统识别后表达得到的抗体，所述AG15多肽的完全抗原的抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
[0022]在一个实施例中，所述AG15多肽的完全抗原的抗体为兔源的多克隆抗体。
[0023]这种AG15多肽的完全抗原具有较强的免疫原性，可以作为完全抗原投入使用。这种AG15多肽的完全抗原的抗体可以用于血清或组织中小鼠骨钙素蛋白质的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为一实施方式的AG15多肽的完全抗原的制备方法的流程图；
[0025]图2为交联剂活化的匙孔血蓝蛋白的结构示意图；
[0026]图3为半胱氨酸盐酸盐一水物的结构示意图；
[0027]图4为5，5’ - 二硫`双(2-硝基苯甲酸)的结构示意图；
[0028]图5为ELISA法测定AG15多肽的完全抗原的多克隆抗体的效价得到的结果图。
【具体实施方式】
[0029]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0030]一实施方式的AG15多肽的完全抗原，该AG15多肽的完全抗原由AG15多肽和交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联形成。
[0031]AG15多肽是小鼠骨钙素蛋白质分子中的一段保守序列，经过序列分析此段多肽具有抗原性的多肽。
[0032]AG15多肽的序列为SEQ ID N0.1所示的序列，AG15多肽通过半胱氨酸与交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联。
[0033]匙孔血蓝蛋白(KLH)分子表面有大量的活性基团，最常用于偶联的是伯胺基团。小的多肽通常也带有不同基团可以用于偶联，常用的有伯胺基团，羧基和巯基。
[0034]多肽与KLH的偶联就是利用这些基团，再通过交联剂(crosslinker)，将多肽上的巯基/羧基/伯胺与KLH上的伯胺相连，从而形成共价偶联，制备成完全抗原，用于免疫动物获得抗体。
[0035]所以偶联的伯胺应该是来自于赖氨酸侧链和N端，而偶联的羧基则来自于天冬氨酸，谷氨酸和C端，巯基则来自于半胱氨酸。
[0036]至于偶联上去的数量，和加入的肽段，交联剂，KLH的摩尔比例有关。通常一分子KLH上可能会偶联上百个肽段。
[0037]本实施方式中，AG15多肽与匙孔血蓝蛋白的摩尔比为800~1000:1。
[0038]本实施方式中，交联剂为马来酰亚胺。
[0039]如图1所示的上述的AG15多肽的完全抗原的制备方法，包括如下步骤:
[0040]S10、提供交联剂活化的匙孔血蓝蛋白，并用磷酸钠缓冲液对交联剂活化的匙孔血蓝蛋白进行重构，得到重构后的交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液。
[0041]交联剂活化的匙孔血蓝蛋白的结构示意如图2所示。
[0042]本实施方式中采用的磷酸钠缓冲液pH为6.6，ImL磷酸钠缓冲液中含有20mM磷酸钠、230mM NaCl、2mM EDTA 和 80mM 蔗糖。
[0043]本实施方式中，交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液的浓度为5mg/mL。
[0044]本实施方式中，交联剂为马来酰亚胺。
[0045]S20、提供AG15多肽，并将AG15多肽用偶联缓冲液或双蒸水溶解，得到AG15多肽溶液。
[0046]本实施方式中，AG15多肽溶液的浓度为8mg/mL。
[0047]本实施方式中，偶联缓冲液可以为含有IOOmM的EDTA、80mM的蔗糖和230mM的NaCl的20mM的pH为6.6的磷酸钠缓冲液。
[0048]S30、将SlO得到的重构后的交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液和S20得带的AG15多肽溶液混匀后充分反应，分离纯化后得到由AG15多肽和交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联形成AG15多肽的完全抗原。
[0049]其中，所述AG15多肽的序列为SEQ ID N0.1所示的序列，AG15多肽通过半胱氨酸与匙孔血蓝蛋白偶联。
[0050]将重构后的交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液和AG15多肽溶液混匀的操作中，AG15多肽与交联剂活化的匙孔血蓝蛋白的摩尔比为800~1000:1。
[0051]分离纯化后得到由AG15多肽和交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联形成AG15多肽的完全抗原的操作为:
[0052]用30mL含有质量百分数为0.01%的叠氮钠PBS缓冲液平衡S印hadex G-25M凝胶柱，接着向所述Sephadex G-25M凝胶柱加入反应液,用总体积IOmL的所述PBS缓冲液洗涤，收集洗出液，每次收集0.5mL~1.0mL，在280nm下测量吸光度值，根据吸光度值收集含蛋白洗脱液。
[0053]这种AG15多肽的完全抗原具有较强的免疫原性，可以作为完全抗原投入使用。
[0054]一实施方式的AG15多肽的完全抗原的抗体，该AG15多肽的完全抗原的抗体与上述的AG15多肽的完全抗原特异性结合。
[0055]一实施方式的AG15多肽的完全抗原的抗体，该AG15多肽的完全抗原的抗体为上述的AG15多肽的完全抗原 作为抗原被免疫系统识别后表达得到的抗体。该AG15多肽的完全抗原的抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
[0056]具体而言，该AG15多肽的完全抗原的抗体为兔源的多克隆抗体。
[0057]这种AG15多肽的完全抗原的抗体可以用于血清或组织中小鼠骨钙素蛋白质的检测。
[0058]下通过具体实施例，对上述AG15多肽的完全抗原，AG15多肽的完全抗原的制备方法，以及与该AG15多肽的完全抗原特异性结合的抗体，进行进一步的解释和实验证明。
[0059]如无特殊说明，实施例中采用的方法均为常规方法，实施案例中所用试剂材料均为常规生化试剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0060]实施例中所用的磷酸盐缓冲液均为pH7.4,0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为PH9.6、0.05M的碳酸钠缓冲液。
[0061]实施例中使用到的药品和材料包括:牛血清白蛋白简称BSA ;匙孔血监蛋白简称为KLH ;半胱氨酸盐酸盐一水物，分子量175.6344，结构式如图3所示；5，5’ - 二硫双(2-硝基苯甲酸)简称DTNB，分子量396.35，结构式如图4所示；新西兰大白兔(4月龄购于广东省实验动物中心)。
[0062]实施例1
[0063]AG15多肽的完全抗原的制备。
[0064]1.打开一管马来酰亚胺活化的KLH加入lmL20mM磷酸钠缓冲液(230mM NaCl，2mMEDTA, 80mM蔗糖，pH6.6)，将 马来酰亚胺活化的KLH进行重构，制备成5mg/mL的溶液，尽快使用；
[0065]2.用IOmL双蒸水将偶联缓冲液进行重构，制备磷酸钠缓冲液(IOOmM EDTA, 80mM鹿糖，pH6.6)；
[0066]3.将4mg含有半胱氨酸的AG15多肽溶解在0.5mL偶联缓冲液或者双蒸水中，同时留取50 μ L多肽溶液用于确定偶联效率(总cys)，保存至2-8°C ；
[0067]4.立即将AG15多肽溶液与马来酰亚胺活化的KLH在反应管内混合，搅拌；
[0068]5.搅拌反应持续室温2小时或者2_8°C过夜；
[0069]6.保留100 μ L偶联反应液用于确定偶联效率(游离cys)。
[0070]实施例2
[0071]AG15多肽的完全抗原的分离纯化。
[0072]1.将一包PBS溶解在IL双蒸水中，加入0.01%叠氮钠，长期保存；
[0073]2.将S印hadex G-25M凝胶柱固定在适宜的烧杯上；
[0074]3.取下凝胶柱的盖子，剪开凝胶柱的底端，让过量的液体流出，禁止柱内液体流干;
[0075]4.用30mL PBS平衡凝胶柱，如果不立即使用凝胶柱请盖好上下的盖子后，保存至2-8 0C ；
[0076]5.向凝胶柱加入反应后的液体，收集下端流出液体；
[0077]6.用总体积IOmL PBS洗涤，收集洗出液，每一次收集0.5mL_l.0mL,在280nm下测
量吸光度值；
[0078]7.收集含蛋白洗脱液，_20°C冻存。
[0079]实施例3
[0080]C半胱氨酸标准曲线的绘制。
[0081]1.将一管DTNB缓冲液溶解于IOmL双蒸水中；
[0082]2.将5mgDTNB试剂溶解在5mLDTNB缓冲液中；[0083]3.将32mg L-半胱氨酸盐酸盐一水物溶解于ImL双蒸水中，梯度稀释范围0.4-0.04mg/mL;
[0084]4.在测试管中加入预稀释的半胱氨酸标准液50 μ L，空白管加入50 μ L双蒸水；
[0085]5.所有管内加入0.1mL双蒸水，0.75mL pH8.0DTNB缓冲液，立即加入0.1mLDTNB试剂溶液，使总体积为ImL,混匀；
[0086]6.在412nm处测定吸光度值，制作标准曲线，重复三次。
[0087]实施例4
[0088]AG15多肽的完全抗原的测定。
[0089]1.将50 μ L的AG15多肽溶液(总cys)加入0.1mL双蒸水中；
[0090]2.将下列50 μ L溶液加入测试管中:DTNB缓冲液(空白)、稀释的多肽样品(总cys，KLH结合)、多肽-KLH (游离cys，KLH结合)、稀释的多肽样品(总cys，BSA结合)、多肽-BSA(?子尚cys, BSA结合)；
[0091 ] 3.向所有试管内加入0.1mL双蒸水，0.75mLpH8.0的DTNB缓冲液，立即加入
0.1mLDTNB试剂溶液，终体积为lmL，混匀；
[0092]4.在412nm处测量吸光度值，如果吸光度值大于1.4，稀释样品重复测试；
[0093]5.计算公式
`[0094]% f禹合效率=(总 cys-游离 cys) / 总 cys*100。
[0095]计算得到AG15多肽的完全抗原的偶联效价为53%。
[0096]实施例5
[0097]动物免疫以及AG15多肽的完全抗原的多克隆抗体的效价的测定。
[0098]将实施例2中分离纯化得到的AG15多肽的完全抗原由新西兰大白兔的免疫，共免疫四次，首次免疫600 μ g/只，用完全弗氏佐剂进行乳化，皮下多点注射，之后用300 μ g/只用弗式不完全佐剂进行乳化，每隔两周进行一次免疫，最后一次免疫后采血进行AG15多肽的完全抗原的多克隆抗体效价的测定。
[0099]抗体效价测定——ELISA法
[0100]1.抗原包被:将AG15多肽的完全抗原稀释至浓度2 μ g/mL,加入96孔板，每孔100yL，4°C湿盒内包被过夜；
[0101]2.洗涤:用含有0.05%吐温-20的PBS缓冲液洗涤包被的酶标板，200 μ L/孔，洗漆3次,5min/次；
[0102]3.封闭:用1%BSA溶液对96孔板进行封闭，250 μ L/孔，37 °C湿盒内封闭2h;
[0103]4.洗涤:同上洗涤方法；
[0104]5.—抗孵育:将兔血清多克隆抗体按照1:1000、1:2000、1:4000，1:8000，1:16000，1:32000、1:64000用PBS缓冲液进行稀释，同时设置空白对照和阴性血清对照，100 μ L/孔，37°C湿盒内孵育Ih ；
[0105]6.洗涤:同上洗涤方法；
[0106]7.二抗孵育:将HRP标记的羊抗兔IgG抗体用PBS缓冲液按照1:5000稀释，100 μ L/孔，37°C湿盒内孵育Ih;
[0107]8.洗涤:同上洗涤方法；
[0108]9.加底物:将TMB按照100 μ L/孔加入96孔板，37°C湿盒内避光反应20min;[0109]10.终止反应:用2M H2SO4按照50 μ L/孔加入96孔板终止反应，用酶标仪在450nm波长时测定吸光度值，气质OD _/(?_> 2.1为血清效价判定标准。
[0110]测量结果如图5所示，由图中可以看出，本实施制备得到的AG15多肽的完全抗原的多克隆抗体的效价为1: 16000。 [0111]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种AG15多肽的完全抗原，其特征在于，所述AG15多肽的完全抗原由AG15多肽和交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联形成； 其中，所述AG15多肽的序列为SEQ ID N0.1所示的序列，所述AG15多肽通过半胱氨酸与所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联。
2.根据权利要求1所述的AG15多肽的完全抗原，其特征在于，所述AG15多肽与所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白的摩尔比为800~1000:1。
3.根据权利要求1所述的AG15多肽的完全抗原，其特征在于，所述交联剂为马来酰亚胺。
4.一种AG15多肽的完全抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 提供交联剂活化的匙孔血蓝蛋白，并用磷酸钠缓冲液对所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白进行重构，得到重构后的交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液； 提供AG15多肽，并将所述AG15多肽用偶联缓冲液或双蒸水溶解，得到AG15多肽溶液； 将所述重构后的交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液和所述AG15多肽溶液混匀后充分反应，分离纯化后得到由所述AG15多肽和所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联形成AG15多肽的完全抗原，其中，所述AG15多肽的序列为SEQ ID N0.1所示的序列，所述AG15多肽通过半胱氨酸与所述交联剂活 化的匙孔血蓝蛋白偶联。
5.根据权利要求4所述的AG15多肽的完全抗原的制备方法，其特征在于，所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液的浓度为5mg/mL ； 所述AG15多肽溶液的浓度为8mg/mL。
6.根据权利要求4所述的AG15多肽的完全抗原的制备方法，其特征在于，将所述重构后的交联剂活化的匙孔血蓝蛋白溶液和所述AG15多肽溶液混匀的操作中，所述AG15多肽与所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白的摩尔比为800~1000:1。
7.根据权利要求4所述的AG15多肽的完全抗原的制备方法，其特征在于，所述交联剂为马来酰亚胺。
8.根据权利要求4所述的AG15多肽的完全抗原的制备方法，其特征在于，分离纯化后得到由所述AG15多肽和所述交联剂活化的匙孔血蓝蛋白偶联形成AG15多肽的完全抗原的操作为: 用30mL含有质量百分数为0.01%的叠氮钠PBS缓冲液平衡S印hadex G-25M凝胶柱，接着向所述Sephadex G-25M凝胶柱加入反应液,用总体积IOmL的所述PBS缓冲液洗漆,收集洗出液，每次收集0.5mL~1.0mL,在280nm下测量吸光度值，根据吸光度值收集含蛋白洗脱液。
9.一种AG15多肽的完全抗原的抗体，其特征在于，所述AG15多肽的完全抗原的抗体与如权利要求1~3中任一项所述的AG15多肽的完全抗原特异性结合。
10.一种AG15多肽的完全抗原的抗体，其特征在于，所述AG15多肽的完全抗原的抗体为如权利要求1~3中任一项所述的AG15多肽的完全抗原作为抗原被免疫系统识别后表达得到的抗体，所述AG15多肽的完全抗原的抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
11.根据权利要求10所述的AG15多肽的完全抗原的抗体，其特征在于，所述AG15多肽的完全抗原的抗体为兔源的多克隆抗体。
【文档编号】C07K16/18GK103554249SQ201310514563
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】任培根, 郭成志, 李健, 郭小勇 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院