大肠杆菌表达的膜联蛋白v或其衍生物的分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法。该方法是对表达膜联蛋白V或其衍生物的大肠杆菌菌体依次进行破菌工艺、粗提工艺以及精制工艺。破菌工艺为先进行反复冻融破碎，再进行渗透压冲击破碎。精制工艺为先进行疏水层析，再进行阴离子交换层析；或者先进行阴离子交换层析，再进行疏水层析。阴离子交换层析采用的填料为结合有DEAE配基或者Q配基的琼脂糖，或者为结合有DEAE配基或者Q配基的聚甲基丙烯酸酯。疏水层析采用的填料为结合有苯基或者丁基或者辛基的琼脂糖，或者为结合有苯基或者丁基或者辛基的聚甲基丙烯酸酯。本发明的分离纯化方法成本较低，得到的目标蛋白纯度≥95%。
【专利说明】大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离纯化方法，具体涉及一种大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]膜联蛋白(Annexins)家族是一类钙离子依赖的磷脂结合蛋白。膜联蛋白V是膜联蛋白家族中分布最广泛、含量最丰富的成员之一。膜联蛋白V具有多种重要的生理功能，如抗凝活性、钙离子通道活性、抑制磷脂酶A2及磷脂酶C的活性等等。同时，膜联蛋白V在细胞分泌调控和信号转导过程中起着重要作用，它还对活化血小板及凋亡细胞有极高的亲和力。
[0003]早期大肠杆菌表达的膜联蛋白V的纯化有以下三种:(1)肝素亲和层析。(2)在钙离子存在的条件下进行阳离子交换层析。(3)在粗提中先后加入钙离子和EDTA，再结合其它方法进行纯化。其中第一种方法采用的肝素亲和层析柱价格昂贵，使用次数有限，导致生产成本较高，不适合工业化生产。第二种和第三种方法的纯化效果不佳，得到的膜联蛋白V的纯度难以满足生物制品的质量要求。
[0004]另外，对于细胞内或者多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。目前，用于细胞破碎的方法包括机械破碎法和非机械破碎法。
[0005]机械破碎法是工业规模细胞破碎的主要手段，具有处理量大、破碎效率高、速度快等特点，但是对于设备要求较高，导致破碎成本较高。机械破碎法主要包括高速珠研磨破碎法、高压匀浆破碎法、超声波破碎法等。
[0006]非机械破碎法的优点是处理条件比较温和，有利于目标生化物质的高活力释放回收。但缺点是破碎效率较低、产物释放速度较慢、处理时间较长。非机械破碎法又分为酶解破碎法、化学破碎法和物理破碎法。其中物理法包括渗透压冲击破碎法、反复冻融破碎法等ο
[0007]酶解破碎法是非机械破碎法中效果相对最好的，但是由于需要采用酶试剂，因而成本仍然较高，而且后续纯化还需要去除所加入的酶试剂，增加后续纯化的压力。
[0008]渗透压冲击破碎法的优点是条件较温和，成本较低；缺点则是破碎效率低，一般运用于不具有细胞壁或者细胞壁较脆弱的菌种。反复冻融破碎法的优点是成本较低，缺点则是破碎效率低，一般运用于细胞壁较脆弱的菌体。
[0009]大肠杆菌的细胞壁是由坚固的肽聚糖组成，因此传统对于大肠杆菌菌体的破碎主要采用机械破碎法中的超声波破碎法或者非机械破碎法中的酶解破碎法，它们的破碎效果虽然较好，但是成本较高。特别是超声波破碎法在破碎菌体、释放目标蛋白的同时，还容易释放大量的杂蛋白，增加后续纯化的压力。
[0010]目前尚未发现采用两种物理破碎法相结合对大肠杆菌菌体进行破碎的文献报道。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于解决上述问题，提供一种成本较低、纯化效果好的大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法。
[0012]实现本发明目的的技术方案是:一种大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法，对表达膜联蛋白V或其衍生物的大肠杆菌菌体依次进行破菌工艺、粗提工艺以及精制工艺；所述精制工艺包括阴离子交换层析和疏水层析。该精制工艺可以先进行疏水层析，再进行阴离子交换层析。也可以先进行阴离子交换层析，再进行疏水层析。
[0013]所述的破菌工艺为:对大肠杆菌菌体先进行反复冻融破碎，再进行渗透压冲击破碎，得到破菌液。所述的反复冻融破碎是将大肠杆菌菌体先在-25V~-15°C的温度下冷冻，然后在0°C~40°C的温度下融化，接着重复前述冷冻和融化I~3次；所述的渗透压冲击破碎是将经过反复冻融破碎后的大肠杆菌菌体与高渗溶液充分混合均匀，在0°C~40°C的温度下静置解冻；然后用水稀释，并搅拌直至充分破碎。
[0014]所述粗提工艺为:向破菌工艺得到的破菌液中加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为30%~50%，并调节溶液pH值为7.0~7.5，在环境温度下静置，离心收集上清液；向该上清液中再加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为60%~80%，并调节溶液pH值为7.0~7.5，在环境温度下静置，离心收集沉淀；将得到的沉淀溶解、超滤得到粗提液。
[0015]所述的疏水层析为:向上一步得到的溶液中加入硫酸铵直至硫酸铵的浓度为
0.7mol/L~1.3mol/L,并调节溶液 的pH值为5.0~9.0，得到疏水层析上样液；将该疏水层析上样液上样至已由缓冲液A平衡过的疏水层析柱中，收集穿透液；所述缓冲液A是pH值为5.0~9.0的氯化铵/硫酸铵混合溶液，其中氯化铵的浓度为30mmol/L~70mmol/L，硫酸铵的浓度为0.7mol/L~1.3mol/L。所述的疏水层析柱中的填料为结合有苯基或者丁基或者辛基的琼脂糖(如:Phenyl Sepharose FF、Phenyl Sepharose High Performance>Capto Phenyl>Butyl Sepharose FF、Butyl Sepharose High Performance> Capto Butyl>Octyl Sepharose FF 或者 Octyl Sepharose High Performance),或者为结合有苯基或者丁基或者辛基的聚甲基丙烯酸酯(Toyopearl Phenyl 650M、Toyopearl Phenyl 650S、Toyopearl Butyl 650M> Toyopearl Butyl 650S> Toyopearl Octyl 650M 或者 ToyopearlOctyl 650S)。
[0016]所述的阴离子交换层析为:将上一步得到的溶液上样至已由缓冲液B平衡过的阴离子交换层析柱中，然后再用缓冲液B进行洗涤，接着用缓冲液C进行洗脱，收集洗脱液；所述缓冲液B是pH值为5.0~8.0的氯化铵溶液，其中氯化铵的浓度为30mmol/L~70mmol/L ;所述缓冲液C是pH值为5.0~8.0的氯化铵/氯化钠混合溶液，其中氯化铵的浓度为30mmol/L~70mmol/L,氯化钠的浓度为0.05mol/L~0.5mol/L。所述的阴离子交换层析柱中的填料为结合有DEAE配基或者Q配基的琼脂糖(如DEAE Sepharose FFXapto DEAE,Q Sepharose FF或者Capto Q)。或者为结合有DEAE配基或者Q配基的聚甲基丙烯酸酯(Toyopearl DEAE 650M 或者 Toyopearl Q 650M)。
[0017]所述的膜联蛋白V衍生物包括对膜联蛋白V中的一个或者一个以上的氨基酸进行突变而得到的化合物，或者在膜联蛋白V的N末端和/或C末端通过基因工程方法或者化学方法连接其它物质而得到的物质。
[0018]本发明具有的积极效果:(I)本发明在分离纯化的精制过程中，对粗提液仅采用阴离子交换层析结合疏水层析，这样不仅降低了生产成本，而且最终得到的目标蛋白纯度^ 95%。(2)本发明的方法发现采用反复冻融破碎法结合渗透压冲击破碎法对大肠杆菌菌体进行破碎，能够取得较好的破碎效果(破壁率可达80%以上)，这样一方面大大降低了破碎成本，另一方面还解决了机械破碎法容易释放大量杂蛋白、酶解破碎法需要去除酶试剂等增加后续纯化压力的问题。
【具体实施方式】
[0019](实施例1)
本实施例为大肠杆菌表达的膜联蛋白V的分离纯化方法，具有以下步骤:
①破菌工艺:将发酵离心收集的100g表达膜联蛋白V的大肠杆菌菌体先在-20°c的温度下冷冻，然后在20°C的温度下融化，接着重复前述冷冻和融化2次。将经过反复冻融破碎后的大肠杆菌菌体与蔗糖高渗溶液(由65g蔗糖、lOmmol/L的乙二胺四乙酸二钠以及IOOmL的水组成)充分混合均匀，在25°C的温度下静置解冻；然后用水稀释至2L，并搅拌Ih直至充分破碎，离心收集上清液(即破菌液)，经光学显微镜检查破壁率为85% (破壁率=破壁的细菌量/破壁前的细菌量X 100%)。
[0020]②粗提工艺:向步骤①的破菌工艺得到的破菌液中加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为40%，并调节溶液pH值为7.0，在环境温度下(251: ±5°C，下同)静置，离心收集上清液；向该上清液中再加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为70%，并调节溶液pH值为7.0，在环境温度下静置，离心收集沉淀。对所得到的沉淀进行溶解、超滤得到粗提液。
[0021]③疏水层析:向粗提工艺得到的粗提液中加入硫酸铵直至硫酸铵的浓度为Imol/L，并调节溶液的pH值为7.5，得到疏水层析上样液；将该疏水层析上样液上样至已由缓冲液A平衡过的疏水层析柱中，收集穿透液；所述缓冲液A是pH值为7.5的氯化铵/硫酸铵混合溶液，其中氯化铵的浓度为50mmol/L，硫酸铵的浓度为lmol/L。疏水层析柱中的填料为 Phenyl Sepharose HP0`
[0022]④阴离子交换层析:将疏水层析收集的穿透液上样至已由缓冲液B平衡过的阴离子交换层析柱中，然后用缓冲液B进行洗涤，接着再用缓冲液C进行洗脱，收集阴离子交换洗脱液；所述缓冲液B是pH值为5.5的氯化铵溶液，其中氯化铵的浓度为50mmol/L ;所述缓冲液C是pH值为5.5的氯化铵/氯化钠混合溶液，其中氯化铵的浓度为50mmol/L，氯化钠的浓度为0.lmol/L。阴离子交换层析柱中的填料为DEAE Sepharose FF。
[0023]上述收集到的阴离子交换洗脱液中，目标蛋白纯度> 95%。
[0024](实施例2)
本实施例的步骤①和步骤②与实施例1相同，不同之处在于:
③阴离子交换层析:将粗提工艺得到的粗提液上样至已由缓冲液B平衡过的阴离子交换层析柱中，然后用缓冲液B进行洗涤，接着再用缓冲液C进行洗脱，收集阴离子交换洗脱液；所述缓冲液B是pH值为6.0的氯化铵溶液，其中氯化铵的浓度为60mmol/L ;所述缓冲液C是pH值为6.0的氯化铵/氯化钠混合溶液，其中氯化铵的浓度为60mmol/L，氯化钠的浓度为0.lmol/L。阴离子交换层析柱中的填料为Q Sepharose FF。
[0025]④疏水层析:向步骤③得到的阴离子交换洗脱液中加入硫酸铵直至硫酸铵的浓度为lmol/L，并调节溶液的pH值为7.0，得到疏水层析上样液；将该疏水层析上样液上样至已由缓冲液A平衡过的疏水层析柱中，收集穿透液；所述缓冲液A是pH值为7.0的氯化铵/硫酸铵混合溶液，其中氯化铵的浓度为60mmol/L，硫酸铵的浓度为lmol/L。疏水层析柱中的填料为 Toyopearl Phenyl 650S。
[0026]上述收集到的穿透液中，目标蛋白纯度≥95%。
[0027](实施例3)
本实施例为大肠杆菌表达的膜联蛋白V衍生物的分离纯化方法，该膜联蛋白V衍生物是通过基因工程方法在膜联蛋白V的N末端连接Gly-Pro-Arg-Pro，同时在膜联蛋白V的C末端连接水蛭素C端结构域而得到的蛋白质。分离纯化方法具有以下步骤:
①破菌工艺:将发酵离心收集的100g表达上述膜联蛋白V衍生物的大肠杆菌菌体先在_25°C的温度下冷冻，然后在25°C的温度下融化，接着重复前述冷冻和融化3次。将经过反复冻融破碎后的大肠杆菌菌体与蔗糖高渗溶液(由65g蔗糖、lOmmol/L的乙二胺四乙酸二钠以及IOOmL的水组成)充分混合均匀，在20°C的温度下静置解冻；然后用水稀释至2L，并搅拌Ih直至充分破碎，离心收集上清液(即破菌液)，经光学显微镜检查破壁率为83%。
[0028] ②粗提工艺:向步骤①的破菌工艺得到的破菌液中加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为50%，并调节溶液pH值为7.5，在环境温度下静置，离心收集上清液；向该上清液中再加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为80%，并调节溶液pH值为7.5，在环境温度下静置，离心收集沉淀。对所得到的沉淀进行溶解、超滤得到粗提液。
[0029]③疏水层析:向粗提工艺得到的粗提液中加入硫酸铵直至硫酸铵的浓度为
1.2mol/L，并调节溶液的pH值为8，得到疏水层析上样液；将该疏水层析上样液上样至已由缓冲液A平衡过的疏水层析柱中，收集穿透液；所述缓冲液A是pH值为8的氯化铵/硫酸铵混合溶液，其中氯化铵的浓度为40mmol/L，硫酸铵的浓度为1.2mol/L。疏水层析柱中的填料为 Phenyl Sepharose HP。
[0030]④阴离子交换层析:将疏水层析收集的穿透液上样至已由缓冲液B平衡过的阴离子交换层析柱中，然后用缓冲液B进行洗涤，接着再用缓冲液C进行洗脱，收集阴离子交换洗脱液；所述缓冲液B是pH值为5.0的氯化铵溶液，其中氯化铵的浓度为40mmol/L ;所述缓冲液C是pH值为5.0的氯化铵/氯化钠混合溶液，其中氯化铵的浓度为40mmol/L，氯化钠的浓度为0.2mol/L。阴离子交换层析柱中的填料为Toyopearl Q 650M。
[0031]上述收集到的阴离子交换洗脱液中，目标蛋白纯度> 95%。
【权利要求】
1.一种大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法，其特征在于:对表达膜联蛋白V或其衍生物的大肠杆菌菌体依次进行破菌工艺、粗提工艺以及精制工艺；所述精制工艺包括疏水层析和阴离子交换层析。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法，其特征在于:所述的破菌工艺为:对大肠杆菌菌体先进行反复冻融破碎，再进行渗透压冲击破碎，得到破菌液。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法，其特征在于:所述的反复冻融破碎是将大肠杆菌菌体先在-25V~_15°C的温度下冷冻，然后在(TC~40°C的温度下融化，接着重复前述冷冻和融化I~3次；所述的渗透压冲击破碎是将经过反复冻融破碎后的大肠杆菌菌体与高渗溶液充分混合均匀，在0°C~40°C的温度下静置解冻；然后用水稀释，并搅拌直至充分破碎。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法，其特征在于:所述粗提工艺为:向破菌工艺得到的破菌液中加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为30%~50%，并调节溶液pH值为7.0~7.5，在环境温度下静置，离心收集上清液；向该上清液中再加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为60%~80%，并调节溶液pH值为7.0~7.5，在环境温度下静置，离心收集沉淀；将得到的沉淀溶解、超滤得到粗提液。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法，其特征在于:所述的疏水层析为:向上一步得到的溶液中加入硫酸铵直至硫酸铵的浓度为0.7mol/L~1.3mol/L,并调节溶液的pH值为5.0~9.0，得到疏水层析上样液；将该疏水层析上样液上样至已由缓冲液A平衡过的疏水层析柱中，收集穿透液；所述缓冲液A是pH值为5.0~9.0的氯化铵/硫酸铵混合溶液，其中氯化铵的浓度为30mmol/L~70mmol/L，硫酸铵的浓度为0.7mol/L~1.3mol/L。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法，其特征在于:所述的疏水层析柱中的填料`为结合有苯基或者丁基或者辛基的琼脂糖，或者为结合有苯基或者丁基或者辛基的聚甲基丙烯酸酯。
7.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法，其特征在于:所述的阴离子交换层析为:将上一步得到的溶液上样至已由缓冲液B平衡过的阴离子交换层析柱中，然后再用缓冲液B进行洗涤，接着用缓冲液C进行洗脱，收集洗脱液；所述缓冲液B是pH值为5.0~8.0的氯化铵溶液，其中氯化铵的浓度为30mmol/L~70mmol/L ;所述缓冲液C是pH值为5.0~8.0的氯化铵/氯化钠混合溶液，其中氯化铵的浓度为30mmol/L~70mmol/L,氯化钠的浓度为0.05mol/L~0.5mol/L。
8.根据权利要求7所述的大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法，其特征在于:所述的阴离子交换层析柱中的填料为结合有DEAE配基或者Q配基的琼脂糖，或者为结合有DEAE配基或者Q配基的聚甲基丙烯酸酯。
9.根据权利要求1至8之一所述的大肠杆菌表达的膜联蛋白V或其衍生物的分离纯化方法，其特征在于:所述的膜联蛋白V衍生物包括对膜联蛋白V中的一个或者一个以上的氨基酸进行突变而得到的化合物，或者在膜联蛋白V的N末端和/或C末端通过基因工程方法或者化学方法连接其它物质而得到的蛋白质。
【文档编号】C07K1/36GK103665140SQ201310708043
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】张笋华, 潘伟忠, 于洋, 刘军, 韦利军 申请人:常州千红生化制药股份有限公司