一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组融合蛋白hIFNγ-MAP30及制备方法和应用，将hIFNγ和MAP30通过连接肽连在在一起，构建了一种可表达hIFNγ-MAP30融合蛋白的基因工程菌，大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)–pET-15b-hIFNγ-MAP30，CCTCCNO:M2013545。本发明利用大肠杆菌系统生产hIFNγ-MAP30，所得到的hIFNγ-MAP30融合蛋白不仅表达量大，操作简单，成本低，也具有加强单独干扰素γ和单独苦瓜蛋白MAP30的抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用。同时大肠杆菌是非致病性微生物，不存在散毒的危险。
【专利说明】—种重组融合蛋白h IFN Y -MAP30及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因生物工程【技术领域】，具体涉及一种重组融合蛋白hIFNY-MAP30，同时还涉及一种重组融合蛋白hIFNy-MAP30的制备方法，还涉及一种能表达重组融合蛋白hIFN Y -MAP30的基因工程菌株，还涉及一种重组融合蛋白hIFN y -MAP30在抗细菌、抗病毒中的应用。
技术背景
[0002]随着生活水平的提高和人类寿命的延长，恶性肿瘤和心血管疾病已经成为威胁人类健康的主要疾病。早在1994年，我国城市恶性肿瘤死亡率居各类死因之首。2007年，全世界死于恶性肿瘤的人口数为750万。病毒感染也是困扰人类，影响人类健康的重大难题之一。如何有效治疗肿瘤，防治病毒感染迫不及待。
[0003]干扰素是组织培养的细胞或动物在没有活性的病毒或其他化学物质的作用下，产生的由细胞自己的基因编码的一种小分子量蛋白，这种蛋白具有对抗该种外源分子的作用。
[0004]人类干扰素Y是含有166个氨基酸的分泌型糖蛋白，其中有23个氨基酸是疏水的信号肽序列，并在N-端具有糖基化位点。干扰素Y在溶液中以二聚体的形式存在，两个二聚体的大小在21-24kD之间。每个亚基含有六个螺旋，这六个螺旋占据整个结构的62%，不含β折叠。干扰素Y的主要生理功能是调节免疫和诱发炎症反应，几乎参与了免疫和炎症反应的所有过程。
[0005]第一:干扰素Y可以刺激机体的防御系统和抗病原菌的功能。其能通过上调Fc-g-RI，一种高亲和性的IgG信号受体的表达来促进骨髓形成细胞中骨髓细胞的分化。它同样能够激活成熟的粒细胞释放抗体依赖性的细胞毒素，同时募集中性粒细胞，使他们上调细胞趋化因子和黏着分子的表达，促进超氧化物歧化酶的产生。第二:干扰素Y是主要的巨噬细胞活化因子，通过使T细胞活化巨噬细胞来杀伤病源微生物。同时提高巨噬细胞对抗肿瘤和抑制寄生虫的能力。第三:干扰素Y可以加强淋巴细胞的抗肿瘤细胞毒性。其与细胞毒性细胞CD4和CD8相互作用，抑制肿瘤生长。第四:干扰素Y可以提高一型MHC的表达，并使很多细胞表达第二型MHC。干扰素Y通过活化第二类⑶4+辅助性T细胞来扩展免疫应答的识别范围。在体内实验中，干扰素Y可以通过细胞免疫和体液免疫来增加免疫识别能力。第五:干扰素Y作用于T淋巴细胞，促进⑶4+T细胞向Thl细胞分化。而Thl参与细胞内的致病菌的清除。第六:干扰素Y可以控制B细胞的分化。它既可以提高，也可以降低B细胞对免疫的应答。在免疫应答的后期，干扰素Y可以促进免疫球蛋白的分泌。在病毒感染的过程中，干扰素Y可以介导IgG2a免疫球蛋白转化成B细胞。第七:干扰素Y在提高一型HLA和二型HLA表达在细胞表面发挥了重要作用。另外，干扰素Y可以使细胞膜表面发生改变，这直接导致了病毒难以吸附和附着在细胞表面。第八:干扰素Y促进细胞内ferment-oligoadenilat合成酶的合成。而oligoadenilat的多聚体能活化单子叶植物的内切酶，从而促进了 mRNA和rRNA的降解，导致被病毒感染的细胞内的物质合成受到抑制。
[0006]目前，将干扰素Y用于治疗各类恶性肿瘤的实验室研究广泛展开，已有的实验证明:干扰素Y具有抑制肿瘤细胞的增殖作用。将干扰素Y连接PET系统中或构建在腺病毒中，并通过大肠杆菌表达干扰素Y已被广泛研究。而干扰素Y也已被用于治疗包括癌症、肺结核、骨硬化病、硬皮病等各种疾病。
[0007]核糖体失活蛋白是一类能够以催化的方式使核糖体不可逆失活的蛋白质，主要分
为三类。
[0008]苦瓜是中国本土生长的一种药用植物，从其种子和果实中分离得到的活性物质在中国被用作抗病毒和抗肿瘤和增强机体免疫力的药物。MAP30是来源于苦瓜的一种属于一型核糖体失活蛋白的生物活性物质。
[0009]MAP30的氨基酸序列表明其共有286个氨基酸组成，含有前导肽，前导肽含有23个氨基酸，含有N端糖基化位点。MAP30的三维空间结构含有8个α螺旋和9个β折叠，大部分都位于蛋白质多肽链的C端和N端。
[0010]已有的科研成果表明:ΜΑΡ30通过能抑制HIV-1整合酶活性，破坏DNA的拓扑结构，切割60S核糖体亚基28S rRNA上的特殊核苷酸位点A4324的腺嘌呤和核糖之间的糖苷键这三种方式行使其抗病毒、抗肿瘤、抗菌的生物学功能。进一步的研究表明:MAP30在抑制HIV-1的繁殖过程中，对人类精子活力没有影响。
[0011]利用各种工程菌，包括大肠杆菌，巴斯德毕赤酵母表达MAP30已见报道，其表达纯化的MAP30具有抑制乙肝病毒、胃癌细胞、金黄色葡萄球菌的功能。然而，目前在国内外还未见有将hIFNY、苦瓜素MAP30蛋白基因进行融合克隆、表达并进行双功能检测的报道。
[0012]本发明将hlFNy、苦瓜蛋白MAP30，两者构建成融合蛋白，并在hIFNy和MAP30之间插入连接肽，连接肽为3Gly6His，这样的设计即保证了干扰素、和苦瓜蛋白MAP30基因融合翻译形成的蛋白质在空间上的重叠与空间位阻尽可能的小，减少两个蛋白因为过于接近而错误折叠，而6个组氨酸标签也便于表达得到的蛋白通过Ni柱进行纯化。hIFN Y、苦瓜蛋白MAP30虽然为来自不同物种，核苷酸和氨基酸序列都不相同的两个不同的蛋白，但他们有相似的功能。本发明所得到的hIFN Y -MAP30融合蛋白使hIFN Y和MAP30具协同作用，加强单独干扰素Y和单独苦瓜蛋白MAP30的抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用，其抗VSV活力单位为 1.5X104IU/mL。
[0013]本发明的目的在于:提供一种大肠杆菌基因工程菌株，该菌株可以表达人类干扰素Y (hlFNY)、苦瓜蛋白MAP30基因工程融合蛋白hIFNY-MAP30。其优点是:即发挥干扰素间接抗病源微生物的作用，有可发挥苦瓜蛋白MAP30的直接抗病源微生物的作用，在功能上起到互补的双重功效。该工程菌表达量大，易于工业化生产，成本低，安全性好。
【发明内容】
[0014]本发明的目的是在于提供了一种hIFNY-MAP30融合蛋白，其序列为SEQ ID N0.2所示，该融合蛋白保持了 hIFNY和MAP30各自的生物学功能，具有直接和间接抗菌，抗病毒，抗肿瘤等多重生物学功效，可广泛用于人和动物抗病原微生物和抗肿瘤的治疗。
[0015]本发明的另一个目的是在于提供了一种hIFN Y -MAP30融合蛋白的制备方法，使用 Escherichia coli BL21 (DE3) pET_15b_hIFN Y-MAP30 工程菌大量表达该融合蛋白，并使用镍柱纯化，方法简单，易行，适于大规模生产。
[0016]本发明还有一个目的是提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，大肠埃希氏菌Escherichia coli BL21 (DE3)pET-15b-hIFN y -MAP30, F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3)(以下简称为大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3) - pET-15b-hIFN y-MAP30), CCTCCN0:M2013545。该菌株可以表达hIFN gamma-MAP30融合蛋白。表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，安全性好。
[0017]本发明还有一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白hIFN Y-ΜΑΡ30在制备抗病毒药物中的应用，通过VSV侵染细胞实验证明融合蛋白hIFNY-MAP30具有抗病毒功能。
[0018]本发明的最后一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白hIFNY_MAP30在制备抑制细菌生长药物中的应用。通过牛津杯实验证明基因工程融合蛋白hIFN Y-MAP30具有抑制金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，溶藻弧菌的繁殖。
[0019]为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施:
[0020]本发明的技术要点之一是表达基因工程重组融合蛋白hIFNY_MAP30的大肠杆菌基因工程菌株的构建 及诱导表达。
[0021]一种大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)-pET-15b-hIFNy-MAP30，其制备步骤如下:
[0022]1.hIFN Y -MAP30融合基因的制备:
[0023]I) hIFN Y基因的制备:
[0024]根据GenBank:NM_000619.2，获得hIFNy基因的序列，委托生物公司合成，其序列为S EQ ID N0.3所示
[0025]干扰素-Y引物设计:
[0026]干扰素-Yup:
[0027]5’ CATGCCATGGGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCA 3’
[0028]干扰素-Ydown 1:
[0029]5’ ATGGTGTCCGCCTCCCTGGGATGCTCTTCGACC 3’
[0030]干扰素-Ydown2:
[0031]5’GTTAACATCGTGATGATGATGATGGTGTCCGCCTCCCTG 3’
[0032]PCR 扩增:其上游引物为干扰素 Y up:5’ CATGCCATGGGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCA 3’ ；干扰素-Y downl:5’ ATGGTGTCCGCCTCCCTGGGATGCTCTTCGA CC 3’，用KOD-pIus-Neo为扩增酶，57.5°C退火，扩增30个循环，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物.得到hIFNy基因，其序列为SEQ ID N0.3所示。
[0033]2) hIFN Y 基因和接头 GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC 序列的制备:
[0034]扩增hIFN Y 基因和接头序列 GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC
[0035]并且形成与苦瓜蛋白MAP30重合的21个碱基。取步骤1)PCR的产物I μ L为模板进行这一轮PCR，引物为干扰素-Y up，干扰素-Y down2, 57.5 °C退火，扩增30个循环，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物。
[0036]3)MAP30基因的制备:
[0037]人工合成MAP30基因，其序列为SEQ ID N0.4所示。
[0038]苦瓜蛋白引物MAP30up:[0039]5’ CATCATCATCACGATGTTAACTTCGATTTGTCGACTGC 3’
[0040]苦瓜蛋白引物MAP30down:
[0041]5'CCGCTCGAGTTAATTCACAACAGATTCCCCAAGG 3’
[0042]PCR扩增:用KOD-pIus-Neo为扩增酶，55.5°C退火，扩增30个循环，PCR产物通过D NA凝胶电泳检测，回收PCR产物.得到MAP30基因，其序列为SEQ ID N0.4所示。
[0043]4) hIFN Y -MAP30融合基因的制备:
[0044]重叠延伸PCR，其PCR体系中不含引物，以回收得到的hIFN Y基因和接头序列GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC,MAP30 序列为模板，用 KOD-plus-Neo 为扩增酶，48°C退火，扩增15个循环，得到全长的中间有GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC接头的hIFN y -MAP30融合基因。
[0045]最后一轮PCR为普通PCR，扩增全长的中间有GGAGGCGGACACCATCATCATCATCAC接头序列的hIFN Y -MAP30融合基因，其上游引物为干扰素Y up:5’ CATGCCATGGGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCA 3’ ；下游引物为:苦瓜蛋白MAP30down:5’ CCG CTCGAGTTMTTCACAACAGATTCCCCAAGG 3’，用 KOD-plus-Neo 为扩增酶，56.5°C退火，扩增 30 个循环，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物，命名为hIFN y -MAP30，其序列为SEQ ID N0.1所示。
[0046]2.pMD18-T-hIFN Y -MAP30 的制备:
[0047]将得到全长PCR产物hIFNY_MAP30，克隆到pMD18_T载体中，将连接体系静置在16°C水浴中，Ih后转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序。得到的阳性克隆子即为包含hIFNY-MAP30基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏，提取质粒为pMD18-T-hIFNy-MAP30。
[0048]3.融合基因表达载体的构建:
[0049]首先双酶切pMD18-T-hIFN y -MAP30 和质粒 pET_15b，胶回收含 hIFN y -MAP30基因的片段和开环pET-15b片段，22°C连接一小时后转化到感受态Escherichia coliBL21(DE3)中，PC R鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达hIFNY-MAP30的大肠杆菌基因工程菌株。 申请人:于2013年11月4日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名:大肠埃希氏菌 Escherichia coli BL21 (DE3) p ET-15b-hIFN y-MAP30, F^ompT hsdSB (rB_mB0 galdcm(DE3)，CCTCC N0:M2013545。
[0050]通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌,大肠埃希氏菌Escherichia coliBL21 (DE3)pET-15b-hIFNy-MAP30, F^ompT hsdSBgal dcm(DE3)，它具有如下特征:最适生长温度为37°C，菌落边缘整齐，表面有光泽、呈灰色。Escherichia coli BL21(DE3)以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区域整合于BL21的染色体上。
[0051]一种基因工程融合蛋白hIFNY_MAP3的制备方法，其步骤是:
[0052]将重组基因工程菌株Escherichiacoli BL21 (DE3)-pET-15b_hIFN Y-MAP30 的单菌落接种到20mL新鲜液 体LB(含终浓度为的10ug/mL氨苄青霉素)培养基中。37°C 300rpm摇床培养过夜。将2mL过夜培养物分别同时接种到200mL2XYT(含终浓度为的10ug/mL氨苄青霉素)培养基。37°C 200rpm摇床培养至0D600为0.6时(约3小时)加入终浓度为0.5mmol/L IPTG，37°C诱导 5h 后，离心 12000g，Imin 收集菌体，用 IOmM PBS (pH8.0)重悬超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。扩大培养，超声波破碎后，离心(8000g，4°C，40min)收集上清。融合蛋白hIFN Y-MAP30通过包涵体变性、复性、透析、浓缩后得到用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。得到纯化的hIFN y -MAP30蛋白。
[0053]一种重组融合蛋白hIFNY_MAP30在制备抗病毒药物中的应用，其应用过程是:通过VS V侵染细胞实验证明融合蛋白hIFNY-MAP30具有抗病毒功能。[0054]一种重组融合蛋白hIFNY_MAP30在制备抑制细菌生长药物中的应用，其应用过程是:通过牛津杯实验证明基因工程融合蛋白hIFNY-MAP30具有抑制金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，溶藻弧菌的繁殖。
[0055]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0056]1.纵观国际人类IFNY的市场，目前已有注射用重组人干扰素Y的药物，但是还没有单独的MAP30药物的生产，以及将这两个蛋白hIFNY和MAP30通过连接肽连在在一起，以融合蛋白的方式进行表达，用 Escherichia coli BL21(DE3) - pET_15b_hIFN Y-MAP30表达出的hIFN Y -MAP30重组蛋白，可以增加单一 MAP30蛋白或单一 hIFN Y蛋白的抗病毒、抗肿瘤、抗菌生物学活性。
[0057]2.本发明在生产和使用中无环境污染危险，属于绿色的生物制品，利于环保。
[0058]3.本发明利用大肠杆菌系统生产hIFN Y -MAP30,大肠杆菌是非致病性微生物，不存在散毒的危险。本发明中的hIFNY-MAP30属于基因工程蛋白质，在环境中很容易降解。
[0059]4.本发明利用大肠杆菌表达hIFN Y-MAP30融合蛋白，得到一种可以大规模生产hIFNY-MAP30 的工艺方法。由 Escherichia coli BL21 (DE3)-pET-15b_hIFN Y-MAP30 所得到的hIFNy-MAP30融合蛋白不仅表达量大，操作简单，成本低，也具有加强单独干扰素Y和单独苦瓜蛋白MAP30的抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0060]图1为一种hIFNY_MAP30融合基因的pMD18_T载体的制备示意图。
[0061]图2为一种重组表达质粒pET-15b_hIFN Y -MAP30的构建过程示意图。
[0062]图3为一种重组表达质粒pET-15b_hIFN Y -MAP30的酶切和PCR鉴定示意图。
[0063]泳道1:Marker D2000。
[0064]泳道2:hIFN Y -MAP30基因重叠PCR产物，碱基数为1269bp。
[0065]泳道3:重组表达质粒pET-15b-hIFN y -MAP30NcoI/XhoI双酶切产物。
[0066]泳道4:重组表达质粒pET-15b_hIFN Y -MAP30NcoI单酶切产物。
[0067]泳道5:重组表达质粒pET-15b-hIFN y -MAP30XhoI单酶切产物。
[0068]泳道6:重组表达质粒pET-15b_hIFN Y -MAP30未切。
[0069]泳道7:Marker IV。
[0070]图 4 为 Escherichia coli BL21 (DE3)-pET-15b-hIFN y -MAP30 表达的hIFN Y -MAP30SDS-PAG E 鉴定示意图。
[0071]泳道1:Marker
[0072]泳道2:为 Escherichia coli BL21 (DE3)-pET-15b_hIFN Y-MAP30 未经诱导上清。
[0073]泳道3:为 Escherichia coli BL21 (DE3)-pET-15b_hIFN Y-MAP30 未诱导沉淀。[0074]泳道4:为 Escherichia coli BL21 (DE3)-pET-15b_hIFN Y-MAP30 诱导上清。
[0075]泳道5:为 Escherichia coli BL21 (DE3)-pET-15b_hIFN Y-MAP30 诱导沉淀。
[0076]图5为纯化后的hIFN Y -MAP30SDS-PAGE鉴定示意图。
[0077]图6为干扰素-Y苦瓜蛋白MAP30对金黄色葡萄球菌的抑制作用示意图。
[0078]图7为干扰素-Y苦瓜蛋白MAP30对BL21 (DE3)的抑制作用示意图。
[0079]图8为干扰素- Y苦瓜蛋白MAP30对Rosetta的抑制作用示意图。
[0080]图9为干扰素-Y苦瓜蛋白MAP30对Origami的抑制作用示意图。
[0081]图10为干扰素-Y和苦瓜蛋白MAP30对溶藻弧菌的抑制作用示意图。【具体实施方式】:
[0082]本发明所用试剂，如无特别说明，均购自武汉意源生物有限公司。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术。
[0083]实施例1:
[0084]hIFN Y -MAP30融合基因的制备
[0085]1.hIFN Y -MAP30融合基因的制备:
[0086]I) hIFN Y基因的制备:
[0087]根据GenBank:NM_000619.2，获得hIFNy基因的序列，委托生物公司合成，其序列为S EQID N0.3所示
[0088]设计引物
[0089]干扰素-Y引物设计:
[0090]干扰素-Yup:
[0091]5’CATGCCATGGGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCA 3’
[0092]干扰素-Ydown 1:
[0093]5’ ATGGTGTCCGCCTCCCTGGGATGCTCTTCGACC 3’
[0094]干扰素-Ydown2:
[0095]5’ GTTAACATCGTGATGATGATGATGGTGTCCGCCTCCCTG 3’
[0096]扩增干扰素-Y并进行部分延伸的PCR产物，按照下表添加PCR体系
[0097]
【权利要求】
1.一种重组的基因，其序列为SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白，其序列为SEQID N0.2所示。
3.—种表达权利要求2所述基因的工程菌株,其特征在于:大肠埃希氏菌coli BL21 (DE3) pET-15b-hIFN y -MAP30, Y— ompT hsdSB(rBmB)gal dcm (DE3), CCTCC NO:M 2013545 。
4.权利要求2所述蛋白的制备方法，其步骤是: (1)将重组基因工程菌株的单菌落接种到20mL含终浓度为的100ug/mL氨苄青霉素的新鲜液体LB培养基中，37 0C 300rpm摇床培养过夜； (2)将2mL过夜培养物分别同时接种到200mL含终浓度为的100ug/mL氨苄青霉素的2XYT培养基，37 °C 200rpm摇床培养至0D600为0.6时加入终浓度为0.5mmol/L IPTG，37°C诱导5h后，离心12 000g，Imin收集菌体； (3)用IOmMpH8.0 PBS重悬超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达； (4)扩大培养，超声波破碎后，离心，8000g，4°C,40min,收集上清；融合蛋白hIFN Y -MAP30通过包涵体变性、复性、透析、浓缩后得到用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果，得到纯化的hIFN Y -MAP30蛋白，其序列为SEQ ID N0.2所示； 所述的基因工程菌为:大肠埃希氏I Escherichia coli BL21 (DE3)pET-15b-hIFN y -MAP30, F- ompT hsdSB(rBmB)gal dcm (DE3), CCTCC NO: M 2013545。
5.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的蛋白在制备抑制溶藻弧菌生长药物中的应用。
6.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的蛋白在制备抑制金黄色葡萄球菌生长药物中的应用。
7.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的蛋白在制备抑制大肠杆菌生长药物中的应用。
8.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的蛋白在制备抗水泡性口炎病毒药物中的应用。
【文档编号】C07K19/00GK103833857SQ201410099350
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】孟小林, 徐进平, 孟明翔, 王健, 潘娟 申请人:湖北肽洋红生物工程有限公司