专利名称：吸附剂及精制方法
技术领域：
本发明涉及一种吸附剂及精制方法，特别涉及一种用于亲合色谱分离的特殊吸附剂，以及使用该特殊吸附剂进行亲合色谱分离精制的方法。
本发明是关于利用亲合色谱有效地和高纯度地精制β-淀粉酶、麦芽低聚糖生成酶等与糖类有关的酶。
在含有生物体物质的各种领域中，亲合色谱被用来对生物体进行分离、精制及定量分析，特别是用其解释生物体之间的特殊的相互作用机能。
亲合色谱的分离精制是利用具有亲合力的二种物质(A及B)间的相互作用，使一种物质(A)以配位体形式与不溶性载体结合、固定，并从含有多种物质的混合液中只选择性地吸收结合另一种物质(B)，然后，通过取出物质B，而达到分离精制B的目的。
对于α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等，可以利用淀粉、多缩葡萄糖及这些物质的各种衍生物(交联葡聚糖类等，以下称“来自淀粉物质”)作为吸附剂，利用亲合色谱进行分离精制。
将亲合色谱应用于工业精制的时候，对于来自淀粉物质的单位重量的吸附剂要求尽量吸附大量的酶;若应用于实验室的精制时，还有必要在提高精制淀粉酶的纯度上下一番功夫。
可是，目前在工业规模上需要纯度高的酶，并还需要高纯度地分离精制大量的目的产物。
使用上述来自淀粉物质作为吸附剂的亲合力色谱是不能满足这些要求的。
鉴于以上的现状，本发明的目的是在利用亲合色谱对有关的糖类酶进行分离精制时，提供了一种特殊的吸附剂以及高纯度地精制大量目的产物的方法。
本发明者们经过锐意的研究，结果发现了使用葡糖基糖苷(Glucosyl Moranolines)类、低聚葡糖基糖苷(Oligo-glucosyl Moranolines)类或者其混合物(以下总称为“葡糖基糖苷类等”)作为亲合色谱的配位体一举解决了上述的课题，完成了本发明。
本发明的要旨就在于以葡糖基糖苷类作为配位体。本发明提供了一种具有配位体的特殊的吸附剂、以及使用这种特殊的吸附剂的亲合色谱精制法。
在本发明中的以葡糖基糖苷类等作为亲合色谱的配位体的特殊吸附剂在此之前没有任何报导，所以本发明方法是一种新方法。另外，关于麦芽三糖生成酶用亲合色谱进行分离在此之前也没有成功例，通过本发明才得的实现。
以下对本发明进行详细描述。
本发明的特殊吸附剂是由配位体及不溶性载体而构成的。本发明的特殊吸附剂，可以含有作为构成要素的间隔基(Spacer)。
本发明的配位体是葡糖基糖苷类。通过它们可以达到本发明的特有效果。
此外，所谓的葡糖基糖苷类是指糖苷(Moranoline)、N-取代糖苷等的糖苷衍生物的葡糖基物质或低聚葡糖基物质。
本发明的葡糖基糖苷类没有特殊的限制，但其代表例如下，即用通式[Ⅰ]表示的化合物。
式中，n表示0～30的整数。R表示氢、烷基、苯基烷基、苯基烯基、苯基炔基、苯氧烷基、苯氧烯基、苯氧炔基等。上述R，作为其构造的一部分含有烷基时，其烷基是直链或支链的，可有不饱和键，也可以有氨基、亚氨基、羟基、烷氧基、羰基或羧基等官能基。或者上述的R，作为其结构的一部分含有苯基时，该苯基也可以用氨基、亚氨基、羟基、烷氧基、羰基或羧基等官能基所取代。
在本发明中，对所谓的间隔基没有特别的限定，它是使不溶性载体和配位体相结合的(或者是夹在两者的中间)构成要素。间隔基具有二官能基时，通过一个官能基与不溶性载体结合，通过另一个官能基与配位体结合理，这二个官能基可以相同，也可以不同。另外也可以是二个以上的间隔基化合物结合后，构成间隔基的一部分。
本发明中，将葡糖基糖苷类等作为配位体制作亲合色谱分离用的特殊吸附剂的方法，可以采用公知的一般制法。这些一般方法已记载在很多的的文献、或各种报告中(例如，千烟一郎亲合色谱分离法、讲座报告。山峙诚等亲合色谱分离法，讲座报告)。
本发明中的所谓与糖类有关的酶可举出，多糖类的分解及生成的酶，例如，α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、支链淀粉酶、麦芽低聚糖生成的淀粉酶(麦芽三糖生成的淀粉酶、麦芽四糖生成的淀粉酶、麦芽五糖生成的淀粉酶等)、环糊精葡糖基转移酶等。
本发明的特征是在于作为亲合色谱中最重要的构成要素-配位体是使用了葡糖基糖苷类等。
本发明的特殊吸附剂中，对于不溶性载体及间隔基没有特别的限制，可以使用已广泛使用的适当物质。
作为这些不溶性载体，可举出有纤维素、琼脂糖、交联多缩葡萄糖、交联聚丙烯酰胺、多孔性硅珠等。
本发明的特殊吸附剂，可按通常的方法制造。可成为间隔基化合物的具有二官能基化合物的例子如下，例如可将1，4-丁二醇二缩水甘油醚等直接与琼脂糖凝胶等的琼脂糖系不溶性载体反应，通过洗涤除去过剩的环氧乙烷后，与本发明的葡糖基糖苷类进行反应而得到。此时，可在0.5N的氢氧化钠溶液中加入琼脂糖凝胶、环氧乙烷，在室温下使不溶性载体反应约10小时，水洗后，同样使其与葡糖基糖苷类反应来制备的。
对于本发明的与糖类有关的酶的精制方法，除了使用本发明的亲合色谱用的特殊的吸附剂之外，不用采用其他特别方法也可以实施。
例如，将本发明的特殊吸附剂充填到柱中，流过适当溶液(通常为缓冲液)后，再流过适当溶液(通常为缓冲液)，洗脱出非吸附物质后，再流过含有可以吸附从吸附剂中游离出的酶的物质(通常为基体或基体类似物质)的溶液，就可以得到所要求的酶。
实施例以下通过本发明的参考例及实施例进一步详细说明本发明。
参考例1 麦芽三糖生成酶的活性测定麦芽三糖生成酶(以下称为“G3酶”)的活性测定使用了DNS(二硝基水杨酸)法。在400μ12%可溶性淀粉中加入100μ1G3酶、在40℃恒温10分钟后，加入1ml DNS，沸腾5分钟。水冷后，加入4.5ml水、测定其在535nm的吸光度。另外将在1分钟内生成1微摩尔的麦芽三糖的酶量作为1U。蛋白质是通过测定在280nm的吸光度或者使用测定生物吸收量(biorad)的仪器测定在595nm的吸光度来完成的。
参考例2 G3酶产生菌的培养培养基的组成 多缩葡萄糖 3%大豆粉 2%酵母浸汁 0.1%多胨 0.1%磷酸钾 0.3%氯化钙 0.5%硫酸铵 0.1%在上述的培养基中接种连霉菌属·griseus NA-468(Streptomyces griseus NA-468)微工研菌寄存第2227号)，在pH为7、27℃振荡培养4天。
参考例3 粗G3酶的制备将上述培养液离心分离(3000rpm、10分钟)，向得到的离心分离上清液中加入硫酸铵使之达到40%饱和程度后，再进行离心分离(10000rpm、10分钟)，向上清液中加入硫酸铵使之达到60%饱和程度。进行离心分离(10000rpm、10分钟)、将沉淀溶解在0.5M醋酸缓冲液(pH5.8)中后，放进透析膜内，使用0.01M醋酸(pH5.8)作为外液进行透析。将其离心分离上清液作为粗G3酶溶液。
参考例4 环氧活性化琼脂糖凝胶6B的制备将抽吸干燥的琼脂糖凝胶6B(PHARMASIA社制)10g悬浮在10ml的0.6N氢氧化钠水溶液中，加入10ml 1，4-丁二醇醚，在25℃下，轻微振荡8小时。在玻璃过滤器上充分进行水洗，这样就得到环氧活性化琼脂糖凝胶6B。
参考例5 4-O-α-D-吡喃葡糖基糖苷的制备按照江连等在(Y，Ezure Agnic，Biol，chem，491 2159(1985))中描述的方法调制。以下把4-O-α-D-吡喃葡糖基糖苷简称为葡糖基糖苷。
参考例6 低聚葡糖基糖苷的β-淀粉酶切断残渣的制备将按照江连等的方法(Y，Ezore Agnic，Biol，Chem 49，2159(1985)制备的低聚葡糖基糖苷配成50mg/ml的溶液，用1N盐酸调节pH为5.0后，向其中加入来自甘薯的β-淀粉酶水溶液(生化学工业社制)，其量相当于反应液量的0.5%，在40℃下反应过夜。将反应液吸附在适当量的强酸性离子交换树脂(道克斯50W×2(H+))上，充分水洗后，用1N的氨水洗脱。减压干燥洗脱液得到低聚葡糖基糖苷的β-淀粉酶切断残渣。用高速液相色谱分析的结果，此物质是由糖苷42%、葡糖基糖苷31.9%、麦芽糖基糖苷23.5%、麦芽三糖基糖苷2.5%而组成的混合物。
参考例7 麦芽五糖生成酶的活性测定麦芽五糖生成酶(以下称“G5酶”)的活性测定可使用DNS法。即在250μl、2%可溶性淀粉(0.1M醋酸缓冲液、pH5.8)中，加入250μlG5酶，在40℃下，恒温20分钟后，加入DNS溶液1ml，在沸水中加热5分钟。水冷后，加入4.5ml水，在535nm测定吸光度。按照参考例1测定酶蛋白量。
参考例8 G5酶产生菌的培养培养基组成 肉浸汁 0.8%
硫酸铵 1.0%麦芽糖 0.8%琼脂 1.9%在以上组成的斜面培养基中将假单胞细菌SP.KO-8940(FERM P-7456)在40℃培养2小时。将1个白金线圈插入到500ml麦耶氏中(マイヤ-に)，加入组成相同的100ml液体培养基，在40℃振荡培养3天。
参考例9 粗G5酶的制备离心分离(9000rpm 20分钟)参考例8得到的培养液，向得到的上清液中加入硫酸铵直到50%饱和为止，离心分离(10000rpm15分钟)，收集沉淀，将沉淀溶在0.5M醋酸缓冲液(pH5.8)中，使用0.01M醋酸缓冲液(pH5.8)作为外液进行透析。其离心上清液为粗G5酶液。
参考例10 低聚葡糖基糖苷的G5酶切断残渣的制备按照基本上与参考例6相同的方法进行调制，即将低聚葡糖基糖苷10g溶解在100ml的水中(pH不调整)、加入在参考例9调制的G5酶液50ml，在30℃反应20小时。将此反应液吸附在适量的强酸性阳离子交换树脂上(道克斯50W×2)，用水充分洗涤。用1N氨水洗脱后、减压浓缩，得到约2.6g低聚葡糖基糖苷的G5切断残渣。
实施例1 使用葡糖基糖苷的G3酶特殊吸附剂的制备使用212g琼脂糖凝胶6B按照参考例4记载的方法得到了处于吸干状态的环氧活性化琼脂糖凝胶6B，再将其悬浮在300ml0.1N的氢氧化钠水溶液中，加入15g葡糖基糖苷，在40℃下轻轻振荡27小时。在玻璃过滤器上水洗，用0.1M醋酸缓冲液(pH4.0)1000ml洗涤、水洗、用0.1M硼酸缓冲液(pH8.0)1000ml洗涤、而后充分水洗。将此凝胶悬浮在400ml的1M乙醇胺中，在室温下，缓慢振荡过夜。在玻璃过滤器上水洗，用含有0.5M氯化钠的0.1M醋酸缓冲液(pH4.0)1000ml洗涤、水洗，得到了使用葡糖基糖苷的G3酶特殊吸附剂。
实施例2 使用低聚葡糖基糖苷的β-淀粉酶切断残渣的G3酶特殊吸附剂的制备使用低聚葡糖基糖苷的β-淀粉酶切断残渣代替葡糖基糖苷，按照实施例1的方法得到使用低聚葡糖基糖苷β的淀粉酶的G3特殊吸附剂。
实施例3 使用葡糖基糖苷的G3酶的特殊吸附剂的亲合色谱分离将实施例1得到的250mlG3酶特殊吸附剂充填到柱中，用0.02M醋酸缓冲液(pH5.8)缓冲后，加入165ml粗G3酶液(25493U、蛋白质523mg、比活性48.7U/mg蛋白质)，用含有0.2M氯化钠的0.62M醋酸缓冲液(pH5.8)2150ml展开后，用1%麦芽三糖水溶液展开。其结果表示在
图1中。得到G3酶活性和蛋白质一致的流分。流分9的G3酶的比活性为286.4U/mg蛋白质，上升到约5.9倍。G3酶的回收率，仅流分9为82.6%。
在图1中，表示了实施例3的结果。纵轴表示G3酶效力(U/ml)和蛋白质量(O.D.595)。横轴表示流分号。图中·表示吸光度、口表示酶效力。流分1～6是300ml、流分7为350ml、流分为250ml、流分9～10为300ml。
实施例4 使用低聚葡糖基糖苷β淀粉酶切断残渣的G3酶特殊吸附剂进行的亲合色谱分离将实施例2得到的G3酶特殊吸附剂5ml充填到柱中，用0.2M醋酸缓冲液(pH5.8)缓冲后，加入粗G3酶溶液5ml(773U、蛋白质18.5mg)，用含有1.0M氯化钠的0.02M醋酸缓冲液(pH5.8)充分展开。接着用3%麦芽糖水溶液展开。结果表示在图2中。
从轴表示G3酶效力(O.D.535)和蛋白质量(O.D.280)。横轴表示流分号。图中·表示在280nm的吸光度、口表示在535的吸光度。每个流分约5ml。
实施例5 使用低聚葡糖基糖苷的G5酶切断残渣的G5酶特殊吸附剂的制备使用低聚葡糖基糖苷的G5酶切断残渣代替葡糖基糖苷按照实施例1的方法，将低聚葡糖基糖苷的G5切断残渣作为配位体，制成G5酶特殊吸附剂。
实施例6 使用低聚葡糖基糖苷的G5酶切断残渣的G5酶特殊吸附剂而进行的亲合色谱分离将在实施例5得到的G5酶特殊吸附剂5ml充填到柱中，用0.2M醋酸缓冲液(pH5.8)缓冲后，加入在参考例9得到的粗G5酶液5ml，用同样的缓冲液充分展开。接着，用低聚糖混合物的Sun低聚物5.6(参松工业社制)的3%溶液进行洗脱时，确认洗脱出了G5酶。结果表示在图3中。
纵轴表示G5酶效力(O.D.535)和蛋白质量(O.D.595)。横轴表示洗脱液量(ml)。图中·表示在595nm的吸光度、口表示在535nm的吸光度。
实施例7[N-(5-羧基戊基)葡糖基糖苷与EAH-琼脂糖凝胶的偶合将N-(5-羧基戊基)葡糖基糖苷100mg和EDC385mg溶解在5ml水中，调节pH为4.5，加入5mlEAH-琼脂糖凝胶4B(PHARMSIA社制)，在室温下，振荡24小时，用400ml水洗涤，得到α-淀粉酶特殊吸附剂。
实施例8 通过将[N-(5-羧基戊基)葡糖基糖苷结合在EAH-琼脂糖凝胶上的α-淀粉酶特殊吸附剂而进行的亲合色谱分离将实施例7得到的α-淀粉酶特殊吸附剂5ml充填到柱中，用0.01M醋酸缓冲液(pH6.0)缓冲后，向其中加入α-淀粉酶(液化型，来自Bacillus subtilis)溶液，用上述缓冲液充分展开。而后，用2%可溶性淀粉溶液(0.01M醋酸缓冲液、pH6.0)展开。在淀粉溶液的初流中，确认α-淀粉酶已洗脱出来。
权利要求
1.一种亲合色谱分离用的特殊吸附剂，其特征在于所述的特殊吸附剂中的配位体是葡糖基糖苷类、低聚葡糖基糖苷类、或其混合物。
2.一种与糖类有关的酶的精制方法，其特征是使用权利要求1记载的特殊吸附剂进行亲合色谱分离。
全文摘要
在本发明涉及一种用于亲合色谱分离的特殊吸附剂，该特殊吸附剂中的配位体为葡糖基糖苷类，低聚葡糖基糖糖苷类或其混合物。本发明还涉及一种用所述的特殊吸附剂进行亲合色谱分离和精制的方法。
文档编号C07K1/22GK1075663SQ9310178
公开日1993年9月1日 申请日期1993年2月22日 优先权日1992年2月21日
发明者丸尾重昭, 小川博嗣, 江连洋治 申请人:日本新药株式会社