用作fpt抑制剂的三环化合物的制作方法

专利名称：用作fpt抑制剂的三环化合物的制作方法
背景在专利合作条约(PCT)下公开的专利申请WO 95/00497(1995年1月5日)描述抑制酶，即法呢基-蛋白转移酶(FPT或FTase)，并因此抑制癌基因蛋白Ras法呢基化的化合物。癌基因频繁编码信号转导途径的蛋白成分，导致细胞生长和有丝分裂发生的刺激。在培养细胞中癌基因的表达导致细胞的转化，其特征为细胞在软琼脂中的生长能力和缺乏非转化细胞表现的接触抑制的细胞密集灶性生长。一些癌基因的突变和/或过度表达往往与人类的癌症有关。
为获得转化能力，Ras癌蛋白质的前体必须经受位于羧基末端四肽中的半胱氨酸残基的法呢化作用。因而，催化这种改变的酶(即法呢基蛋白转移酶)的抑制剂已表明为某些肿瘤(即其中Ras对转化起作用的肿瘤)的抗癌剂。Ras的突变的、癌基因形式常常发现于许多人类癌症中，最引人注目的是在超过50％的结肠癌中和胰腺癌中(Kohl等，Science，第260卷，第1834-1837页，1993)。
鉴于法呢基蛋白转移酶抑制剂的现实意义，对本领域的一个宝贵贡献将是用作法呢基蛋白转移酶抑制剂的另一些化合物。本发明即提供了此种贡献。
本发明概述通过本发明的三环类化合物抑制法呢基蛋白转移酶在此之前尚未有报道。因此，本发明提供使用本发明的三环类化合物抑制法呢基蛋白转移酶的方法，所述化合物(ⅰ)在体外有效抑制法呢基蛋白转移酶，但不抑制香叶基香叶基蛋白转移酶I；(ⅱ)阻断为法呢基受体的转化Ras形式诱导的表型改变，但不阻断改造的为香叶基香叶基受体的转化Ras形式诱导的表型改变；(ⅲ)阻断为法呢基受体的Ras的细胞内加工，但不阻断改造的为香叶基香叶基受体的Ras的细胞内加工；及(ⅳ)阻断由转化Ras诱导的细胞在培养物中的异常生长。已经证明本发明的几种化合物在动物模型中具有抗肿瘤活性。
本发明提供通过给予有效量的本发明化合物抑制细胞(包括转化的细胞)异常生长的方法。细胞的异常生长指不依赖于正常调节机制(如接触抑制的丧失)的细胞生长。这包括下列的异常生长(1)表达激活的Ras癌基因的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)其中Ras蛋白因另一种基因的致癌突变而被激活的肿瘤细胞；及(3)其中出现异常的Ras激活的其它增生性疾病的良性和恶性细胞。
本发明的三环化合物包括下列化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物4-[8-氯代-3,7-二溴代-5,6-二氢-11H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基]-1-(4-硫代吗啉基乙酰基)哌啶4-[8-氯代-3,7-二溴代-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基]-1-(4-硫代吗啉基乙酰基)哌啶S-氧化物(+,-)-1-(3-溴代-8,10-二氯代-5-乙基-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基)-4-(4-吡啶基乙酰基)哌啶N4-氧化物(+,-)-4-(3-溴代-8,10-二氯代-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基)-1-[2-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-1-氧代乙基]哌啶；和(+,-)-4-(3,10-二溴代-8-氯代-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11(R)-基)-1-[(1-氧代丙基-4-哌啶基)乙酰基]哌啶。在另一个实施方案中，本发明涉及抑制细胞异常生长的药用组合物，它包括有效量的三环化合物和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明涉及抑制细胞(包括转化细胞)异常生长的方法，该方法包括给予需要此种治疗的哺乳动物(如人)有效量的三环化合物。细胞的异常生长指不依赖于正常调节机制(如接触抑制的丧失)的细胞生长。这包括下列的异常生长(1)表达激活的Ras癌基因的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)其中Ras蛋白因另一种基因的致癌突变而被激活的肿瘤细胞；(3)其中出现异常的Ras激活的其它增生性疾病的良性和恶性细胞，及(4)由不同于Ras蛋白的机制激活的良性或恶性细胞。不希望受到理论的束缚，相信这些化合物可以通过阻断G-蛋白异戊二烯化而抑制G-蛋白(如ras p21)的功能而起作用，从而使它们用于治疗增生性疾病如肿瘤生长和癌症，或者通过抑制ras法呢基蛋白转移酶而起作用，从而使它们针对ras转化细胞的抗增生活性。
被抑制的细胞可以是表达激活的ras癌基因的肿瘤细胞。例如，可被抑制的细胞类型包括胰肿瘤细胞、肺癌细胞、骨髓性白血病肿瘤细胞、甲状腺滤泡肿瘤细胞、脊髓发育不良肿瘤细胞、表皮癌肿瘤细胞、膀胱癌肿瘤细胞或结肠肿瘤细胞。通过三环化合物处理以ras抑制法呢基蛋白转移酶从而可以抑制细胞的异常生长。对其中所述Ras蛋白因基因(非Ras基因)致癌突变而被激活的肿瘤细胞也有抑制作用。此外，三环化合物还可以抑制由非Ras蛋白的蛋白激活的肿瘤细胞。
本发明也提供通过给予需要此治疗的哺乳动物(如人)有效量的三环化合物抑制肿瘤生长的方法。具体地讲，本发明提供通过给予有效量的上述化合物来抑制表达激活的Ras癌基因的肿瘤生长的方法。可被抑制的肿瘤的例子包括(但不限于)肺癌(如肺腺癌)、胰癌(如胰腺癌像外分泌性的胰腺癌)、结肠癌(如结肠直肠癌像结肠腺癌和结肠癌)、骨髓性白血病(如急性骨髓性白血病(AML)、甲状腺滤泡癌、脊髓发育不良综合征(MDS)、膀胱癌和表皮癌。
相信本发明也提供通过给予需要此治疗的哺乳动物(如人)本文所述的有效量的三环化合物抑制某些良性和恶性增生性疾病的方法，在这些增生性疾病中，Ras蛋白因其它基因的致癌突变而被异常激活，即所述Ras基因本身不被突变所激活为致癌形式。例如，通过本文所述的三环化合物可以抑制良性增生性紊乱神经纤维瘤病或其中Ras因酪氨酸激酶癌基因(如neu、src、abl、lck和fyn)突变或过度表达而被激活的肿瘤。
在另一实施方案中，本发明涉及通过给予哺乳动物，尤其是人有效量的三环化合物抑制ras法呢基蛋白转移酶和癌基因蛋白Ras的法呢基化作用的方法。给予患者本发明化合物以抑制法呢基蛋白转移酶可用于治疗上述癌症。
本发明详述如在此所用，除特别指明外，使用的下列术语定义如下M+-代表质谱中分子的分子离子；MH+-代表质谱中分子的分子离子加氢；Bu-代表丁基；Et-代表乙基；Me-代表甲基；Ph-代表苯基；下列溶剂和试剂用缩写表示四氢呋喃(THF)；乙醇(EtOH)；甲醇(MeOH)；乙酸(HOAc或AcOH)；乙酸乙酯(EtOAc)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；三氟乙酸(TFA)；三氟乙酸酐(TFAA)；1-羟基苯并三唑(HOBT)；间-氯代过苯甲酸(MCPBA)；三乙胺(Et3N)；乙醚(Et2O)；氯代甲酸乙酯(ClCO2Et)以及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(DEC)。
所述取代基R1、R2、R3及R4的位置基于下面的编号环结构进行参照
部分本发明的化合物可以存在不同的异构体(如对映体或非对映异构体)。本发明意欲包括所有此类纯形式和混合物的立体异构体，包括外消旋混合物。例如C-11位的碳原子可以为S或R立体构型。
部分三环化合物具有酸性，例如那些具有羧基或酚羟基的三环化合物。这些化合物可以形成药学上可接受的盐。此类盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、金盐和银盐。也包括与药学上可接受的胺如氨、烷基胺、羟基烷基胺、N-甲基葡糖胺等形成的盐。
部分碱性的三环化合物也可形成药学上可接受的盐，如酸加成盐。例如，吡啶-氮原子可与强酸形成盐，而具有碱性取代基如氨基的化合物也可与弱酸形成盐。适合形成盐的酸的例子为盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、甲磺酸和其它本领域熟知的无机酸和羧酸。常规方便的方法为使游离碱形式与足量的所需酸接触产生盐来制备所述盐。通过用适当的稀碱水溶液，如稀氢氧化钠、碳酸钾、氨和碳酸氢钠水溶液处理所述盐可以再生成所述游离碱形式。这些游离碱的形式在某些物理性质，如在极性溶剂中的溶解度方面与它们各自的盐形式有些不同，但对于本发明的目的而言，所述酸和碱的盐与它们各自的游离碱形式却是等同的。
所有这些酸和碱的盐可用作本发明范围内的药学上可接受的盐，且对于本发明的目的而言，认为所有的酸和碱的盐与相应化合物的游离形式是等同的。
用常规的方法例如像用有机溶剂从水中萃取反应混合物、蒸发有机溶剂、接着经硅胶或其它适当的层析介质层析，可以从反应混合物中分离式1.0的三环化合物。
用下面的实施例来示范说明本发明化合物和其制备的原料，这些实施例不应构成对本公开范围的限制。
实施例14-[8-氯代-3,7-二溴代-5,6-二氢-11H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基]-1-(4-硫代吗啉基乙酰基)哌啶
步骤A
于-5℃，将4-(8-氯代-3-溴代-5,6-二氢-11H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-亚基)-1-哌啶-1-甲酸乙酯(25.86g,55.9mmol)与250ml浓硫酸混合，然后加入4.8g(56.4mmol)硝酸钠，搅拌2小时。将该混合物倾至600g冰中，用浓氢氧化铵水溶液碱化。过滤化合物、用300ml水洗涤，然后用500ml二氯甲烷萃取。用200ml水洗涤萃取物，用硫酸镁干燥，然后过滤并真空浓缩为残留物。层析(硅胶，10％乙酸乙酯/二氯甲烷)残留物得到24.4g(产率86％)产物。m.p.=165-167℃，质谱MH+=506,508(CI)。
元素分析计算值C,52.13；H,4.17；N,8.29实测值C,52.18；H,4.51；N,8.16。
步骤B
于20℃，将步骤A的产物(20g,40.5mmol)与200ml浓硫酸混合，然后将该混合物冷却至0℃。向该混合物加入7.12g(24.89mmol)1,3-二溴代-5,5-二甲基-乙内酰脲，于20℃搅拌3小时。冷却至0℃，再加入二溴代乙内酰脲(1.0g,3.5mmol)，于20℃搅拌2小时。将该混合物倾至400g冰中，于0℃用浓氢氧化铵水溶液碱化，过滤收集产生的固体。用300ml水洗涤固体，在200ml丙酮中制成淤浆，过滤得到19.79g(产率85.6％)产物。m.p.=236-237℃，质谱MH+=586(CI)。
元素分析计算值C,45.11；H,3.44；N,7.17实测值C,44.95；H,3.57；N,7.16。
步骤C
于50℃，将25g(447mmol)铁屑、10g(90mmol)氯化钙和20g(34.19mmol)步骤B的产物的700ml 90∶10乙醇/水的悬浮液混合。于回流下，将该混合物加热过夜，通过Celite过滤，用2×200ml热乙醇洗涤滤饼。合并滤液和洗涤液，真空浓缩为残留物。用600ml二氯甲烷萃取残留物，用300ml水洗涤，经硫酸镁干燥。过滤并真空浓缩为残留物，然后层析(硅胶，30％乙酸乙酯/二氯甲烷)，得到11.4g(产率60％)。m.p.=211-212℃，质谱MH+=556(CI)。
元素分析计算值C,47.55；H,3.99；N,7.56实测值C,47.45；H,4.31；N,7.49。
步骤D
于-10℃，缓慢将步骤C的产物(20g,35.9mmol)加至(分次)8g(116mmol)亚硝酸钠的120ml浓盐酸水溶液中。于0℃,1将产生的化合物搅拌2小时，然后于0℃、用1小时缓慢加至(滴加)150ml(1.44mol)50％次磷酸中。于0℃搅拌3小时，然后倾至600g冰中，用浓氢氧化铵水溶液碱化。用2×300ml二氯甲烷萃取，经硫酸镁干燥，然后浓缩为残留物。将残留物层析(硅胶，25％乙酸乙酯/己烷)得到13.67g(产率70％)。m.p.=163-165℃，质谱MH+=541(CI)。
元素分析计算值C,48.97；H,4.05；N,5.22实测值C,48.86；H,3.91；N,5.18。
步骤E
将步骤D的产物(6.8g,12.59mmol)和100ml浓盐酸水溶液合并，于85℃搅拌过夜。将该混合物冷却，倾至300ml冰中，用浓氢氧化铵水溶液碱化。用2×300ml二氯甲烷萃取，然后用硫酸镁干燥萃取物。过滤并真空浓缩为残留物，然后层析(硅胶，10％甲醇/乙酸乙酯+2％氢氧化铵水溶液)得到5.4g(产率92％)目标化合物。m.p.=172-174℃，质谱MH+=469(FAB)。
元素分析计算值C,48.69；H,3.65；N,5.97实测值C,48.83；H,3.80；N,5.97。
步骤F
于20℃，将实施例1步骤E的化合物(13g,33.3mmol)与300ml甲苯混合，然后加入32.5ml(32.5mmol)1M DIBAL甲苯溶液。于回流下将该混合物加热1小时，冷却至20℃，再加入32.5ml 1M DIBAL溶液，于回流下加热1小时。将该混合物冷却至20℃，将其倾至400g冰、500ml乙酸乙酯和300ml 10％氢氧化钠水溶液的混合物中。用二氯甲烷(3×200ml)萃取水层，用硫酸镁干燥有机层，然后真空浓缩为残留物。层析(硅胶，12％甲醇/乙酸乙酯+4％氢氧化铵水溶液)得到10.4g目标化合物，为外消旋物。质谱MH+=469/471(FAB)。
步骤G4-[8-氯代-3,7-二溴代-5,6-二氢-11H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基]-1-(羟基乙酰基)哌啶
于室温下，向0.235g(0.5mmol)实施例1步骤F的物质的3ml无水二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入0.17ml N-甲基吗啉(NMM)、0.075g1-羟基苯并三唑(HOBT)、0.145g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(DEC)和0.06g 80％的工业级的羟基乙酸(glycolic acid)。将产生的黄色溶液搅拌24小时，然后在高真空下蒸发。使残留物分配于二氯甲烷和饱和的盐水之间，用二氯甲烷(3×25ml)萃取水层。经硫酸镁干燥合并的有机层、过滤并浓缩。残留物经30g硅胶快速层析纯化，用60％乙酸乙酯/己烷和3％甲醇/二氯甲烷(各0.5L)洗脱，得到目标化合物(0.255g，产率96.5％)。
MS:529(M+H)。
步骤H4-[8-氯代-3,7-二溴代-5,6-二氢-11H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基]-1-(氯代乙酰基)哌啶
于室温下，将实施例1步骤G的化合物(0.11g,0.2mmol)和1.5ml亚硫酰氯的混合物搅拌18小时，然后减压浓缩。将残留物溶于二氯甲烷中，加入甲苯得到浑浊的溶液，将其再次浓缩，接着在高真空下干燥，得到目标化合物(0.11g)，为黄色疏松物。
MS:547/549(M/M+2)。
步骤1
向约0.11g 4-[8-氯代-3,7-二溴代-5,6-二氢-11H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基]-1-(氯代乙酰基)哌啶的5ml二氯甲烷溶液中加入0.12ml硫代吗啉，于室温下将该混合物搅拌24小时，用20ml蒸馏水稀释。分离各层，用10ml二氯甲烷回萃取水层。用饱和的盐水将合并的有机层洗涤一次，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发为棕色残留物。经20g硅胶快速层析，用200ml 3％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到0.12g目标化合物，两步产率为93.8％。MS:614.5(M+H)。
FPT IC50=0.0089μM。
实施例24-[8-氯代-3,7-二溴代-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基]-1-(4-硫代吗啉基乙酰基)哌啶S-氧化物
向0.09g(0.15mmol)实施例1步骤1的4-[8-氯代-3,7-二溴代-5,6-二氢-11H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基]-1-(4-硫代吗啉基)哌啶的10ml蒸馏四氢呋喃(THF)溶液中加入123μl三氟乙酸(TFA)和121μl 30％过氧化氢。于室温下，将产生的溶液搅拌20小时，然后浓缩。用2×10ml份的二氯甲烷和10ml蒸馏水萃取残留物。用饱和的盐水将合并的有机层洗涤一次，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发为无色残留物。制备性TLC，用10％甲醇(氨)/二氯甲烷展开，得到0.03g目标化合物，为白色固体。产率32.6％。
MS:630(M)。
FPT IC50=0.0068μM。
实施例3(+,-)-1-(3-溴代-8,10-二氯代-5-乙基-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基)-4-(4-吡啶基乙酰基)哌啶N4-氧化物
步骤A
于-78℃、在干冰-丙酮浴上，将正丁基锂(2.5M己烷溶液，7.3ml,18.25mmol)加至二异丙胺(2.8ml,20.13mmol)的四氢呋喃(THF，蒸馏的，20ml)溶液中。于0℃搅拌30分钟，然后冷却至-78℃。于-78℃加入N-(1,1-二甲基乙基)-3-甲基-5-溴代-2-吡啶甲酰胺(2.0g,7.38mmol)的THF(10ml)溶液，于-78℃将产生的紫色溶液再搅拌半小时。于-78℃滴加3,5-二氯苄基氯(2.8g,14.32mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液。用冰/水浴代替干冰-丙酮浴，于0℃将反应混合物搅拌11/2小时。薄层层析(3％V/V乙酸乙酯∶己烷)测定反应完成。用水(100ml)使反应混合物骤冷，用乙酸乙酯(2×200ml)萃取。分离有机层、用水(100ml)洗涤、经硫酸镁干燥、过滤并蒸发溶剂，得到油状物，将其经硅胶层析(3％V/V乙酸乙酯∶己烷)得到无色油状物，在高真空(0.2mm)下抽滤，固化得到白色固体(2.7g，产率96.7％)。
步骤B
于-78℃，将正丁基锂(2.5M己烷溶液，2.3ml,5.75mmol)加至二异丙胺(0.82ml,5.86mmol)的四氢呋喃(10ml，加钠蒸馏的)溶液中。于-78℃搅拌20分钟。加入在四氢呋喃(5ml)中的实施例3步骤A的产物(1.0g,2.64mmol)，于-78℃将产生的紫色溶液搅拌1/2小时。加入纯的乙基溴(0.7ml,9.37mmol)，用冰/水浴代替干冰浴，于0℃将反应混合物搅拌1小时。用硅胶薄层层析(3％V/V乙酸乙酯∶己烷)测定反应完成。向反应混合物中加入水(50ml)和乙酸乙酯(100ml)。分离有机层、用水(5ml)洗涤、经硫酸钠干燥、过滤并蒸发溶剂，得到淡黄色油状物，将其经硅胶层析(3％V/V乙酸乙酯∶己烷)，在高真空(0.2mm)下抽滤2小时，得到无色油状物(0.95g，产率88.7％)。MS:CIMH 459。
步骤C
将三氯氧化磷(5ml,53.6mmol)加至实施例3步骤B产物(0.9g,1.96mmol)的甲苯(10ml)溶液中，然后于回流下搅拌5小时。将该反应混合物冷却至室温，减压蒸发溶剂。加入甲苯(20ml)，再次蒸发溶剂。顺序向残留油状物中加入水(30ml)、乙酸乙酯(100ml)和10％氢氧化钠(10ml)。分离有机层、用盐水(50ml)洗涤、经硫酸镁干燥、过滤并蒸发溶剂，得到油状物，将其用于下一步反应(0.8g，产率100％)MS:CIMH 383/385。
步骤D
于20℃，将实施例3步骤C的产物(0.8g,2.08mmol)与三氯化铝(2.7g,20.2mmol)混合，然后于175℃在预热的油浴上搅拌10分钟。(1∶1 V/V乙酸乙酯∶己烷)用硅胶薄层层析测定反应完成。将反应物冷却至0℃，加入水(10ml)，接着加入2当量的盐酸(15ml)。在冰浴冷却下加入20％氢氧化钠碱化混合物，然后用二氯甲烷(2×100ml)萃取。分离有机层、经硫酸镁干燥、过滤并蒸发溶剂，得到白色固体(0.6g,产率75％)。MS:CI MH(383/385)。
步骤E
于回流温度下，将实施例3步骤D的产物(0.3g,7.79×10-4m)的6N盐酸(10ml)和甲醇(5ml)溶液搅拌24小时。将反应物冷却至20℃，加至冰(100g)中，于0℃用25％氢氧化钠碱化至pH为14。收集白色固体沉淀，用水(20ml)洗涤，溶于二氯甲烷(100ml)中，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发溶剂。残留固体经硅胶层析(1∶1 V/V乙酸乙酯∶己烷)得到白色固体(200mg，产率66％)。MS:CI MH(384/386)。
步骤F
于0℃，将硼氢化钠(100mg,2.66mmol)加至实施例3步骤E产物(130mg,0.338mmol)的乙醇(5ml)溶液中，将该反应混合物搅拌5分钟。用薄层层析(硅胶，30％V/V乙酸乙酯∶己烷)测定反应完成。加入水(20ml)和二氯甲烷(30ml)，分离有机层、经硫酸镁干燥、过滤并蒸发溶剂，得到油状物，将其经硅胶层析(20％V/V乙酸乙酯(ethylacelate)∶己烷)，为两个非对映体的70∶30的混合物(130mg，产率100％)。MS:CI(MH 388)。
步骤G
于0℃，将亚硫酰氯(0.15ml,2.05mmol)加至实施例3步骤F的产物(60mg,0.155mmol)甲苯(3ml)溶液中。于0℃将该反应混合物搅拌1小时，于20℃再搅拌1小时。将反应物冷却至0℃，顺序加入水(10ml)、乙酸乙酯(20ml)和10％氢氧化钠(5ml)。分离有机层，用盐水(5ml)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并蒸发溶剂，得到油状物(65mg)。
步骤H
于0℃，将哌嗪(100mg,1.16mmol)加至实施例3步骤G产物(60mg,0.155mmol)的乙腈(5ml)溶液中。加入三乙胺(0.2ml,1.43mmol)，于20℃将该反应混合物搅拌2小时。加入水(20ml)和二氯甲烷(50ml)。分离有机层，用盐水(20ml)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并蒸发溶剂，得到粗品产物，为白色固体(60mg)。MS:CI MH(456)。NMR显示为两个非对映体的80/20的混合物。
步骤I
于0℃，向实施例3步骤H的产物(50mg,0.109mmol)的二甲基甲酰胺(5ml)溶液中加入1-羟基苯并三唑(40mg,0.296mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(DEC1,50mg,0.26mmol)和4-吡啶基N-氧化物乙酸(40mg,0.26mmol)，加入N-甲基吗啉(0.5ml,4.03mmol)，于20℃将该反应混合物搅拌24小时。减压蒸发溶剂，用二氯甲烷(40ml)萃取残留油状物，用水(20ml)和盐水(20ml)洗涤，经硫酸镁干燥、过滤并蒸发溶剂，得到油状物，经硅胶层析(10％V/V甲醇∶二氯甲烷)得到为白色固体的产物，在高真空(0.2mm)下干燥3小时(50mg，产率78)。
NMR为非对映体80∶20的混合物。
MS FABS MH 590.8/588.9精确质谱C27H26N4O2BrCl2计算值MH+587.0616；实测值587.0612步骤3J
非对映体的分离用得自Chiral Technologies Inc.,Exton,Pennsylvania的Chiralpack AD柱分离两个非对映体的混合物(200mg,80∶20混合)，用乙醇作为洗脱溶剂。Chiralpack AD为包被于10μm硅胶基质上的直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
1)得到为外消旋物的主要的非对映体(120mg)，白色固体FABS MH 588.9/590.8FABS MS MH+C27H26N4O2BrCl2计算值587.0616；实测值MH+587.0612FPT IC50=0.006μM。
2)得到为外消旋物的次要的非对映体(20mg)，白色固体MS FABS 588.9/590.8实施例4(+)-4-(3-溴代-8,10-二氯代-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-基)-1-[2-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-1-氧代乙基]哌啶
步骤A
将实施例5步骤B的产物(9.90g,18.9mmol)溶于150ml二氯甲烷和200ml乙腈中并加热至60℃。加入2.77g(20.8mmol)N-氯代琥珀酰亚胺，加热至回流3小时，用TLC(30％乙酸乙酯/水)监测反应。再加入2.35g(10.4mmol)N-氯代琥珀酰亚胺，回流45分钟。将该反应混合物冷却至室温，用1N氢氧化钠和二氯甲烷萃取。用硫酸镁干燥二氯甲烷层，过滤并经快速层析(1200ml正相硅胶，用30％乙酸乙酯/水洗脱)，得到6.24g所需产物。M.p.193-195.4℃。
步骤B
于-10℃，向160ml浓盐酸中加入2.07g(30.1mmol)亚硝酸钠，搅拌10分钟。加入实施例4步骤A的产物(5.18g,10.1mmol)，将该反应混合物从-10℃加热至0℃2小时。将反应物冷却至-10℃，加入100ml次磷酸，放置过夜。为萃取反应混合物，将其倾至碎冰中，用50％氢氧化钠/二氯甲烷碱化。用硫酸镁干燥有机层，过滤并浓缩至干。经快速层析(600ml正相硅胶，用20％乙酸乙酯/己烷洗脱)纯化，得到3.98g产物。质谱MH+497.2。
步骤C
将3.9g实施例4步骤B的产物溶于100ml浓盐酸中并回流过夜。冷却该混合物，用50％w/w氢氧化钠碱化，用二氯甲烷萃取产生的混合物。用硫酸镁干燥二氯甲烷层，蒸发溶剂，在真空下干燥得到3.09g所需产物。质谱MH+=424.9。
步骤D
用类似于实施例5步骤F和G的方法，得到1.73g所需产物，m.p.169.6-170.1℃；[α]D25+48.2°(c=1,MeOH)。
步骤E
将实施例5步骤D的产物(0.5g,1.2mmol)溶于10ml DMF中，于约0℃加入0.3g(1.5mmol)邻苯二甲酰基(pthaloyl)甘氨酸、0.29g(1.5mmol)DEC、0.20g(1.5mmol)HOBT和0.15g(1.5mmol)N-甲基吗啉。将该反应混合物搅拌过夜，温热至室温。去除挥发物。使其分配于水和二氯甲烷之间。用二氯甲烷萃取水相。合并二氯甲烷组分，经硫酸镁干燥并浓缩。经快速层析纯化，用50％乙酸乙酯-己烷洗脱，得到目标化合物。质谱MH+=614 mp=144-145℃。
FPT IC50=0.0186μM。
实施例5(+)-4-(3,10-二溴代-8-氯代-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11(R)-基)-1-[(1-氧代丙基-4-哌啶基)乙酰基]哌啶步骤A
于-5℃，将4-(8-氯代-3-溴代-5,6-二氢-11H-苯并[5,6]芳庚并[1,2-b]吡啶-11-亚基)-1-哌啶-1-甲酸乙酯(15g,38.5mmol)与150ml浓硫酸混合，然后加入3.89g(38.5mmol)硝酸钾，搅拌4小时。将该混合物倾至3L冰中，用50％浓氢氧化钠水溶液碱化。用二氯甲烷萃取，经硫酸镁干燥，然后过滤，真空浓缩为残留物。从丙酮中重结晶残留物得到6.69g产物。1H NMR(CDCl3,200MHz):8.5(s,1H)；7.75(s,1H)；7.6(s,1H)；7.35(s,1H)；4.15(q,2H)；3.8(m,2H)；3.5-3.1(m,4H)；3.0-2.8(m,2H)；2.6-2.2(m,4H)；1.25(t,3H)。
步骤B
将步骤A的产物(6.69g,13.1mmol)与100ml 85％乙醇/水合并，然后加入0.66g(5.9mmol)氯化钙和6.56g(117.9mmol)铁，然后于回流下将该混合物加热过夜。通过celite过滤热的反应混合物，用热乙醇洗涤滤饼。真空浓缩滤液得到7.72g产物。质谱MH+=478.0。
步骤C
将7.70g步骤B的产物与35ml乙酸混合，然后加入45ml溴的乙酸溶液，于室温下将该混合物搅拌过夜。加入300ml 1N氢氧化钠水溶液，然后加入75ml 50％氢氧化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取。经硫酸镁干燥萃取物，真空浓缩为残留物。将残留物层析(硅胶，20％-30％乙酸乙酯/己烷)得到3.47g产物(以及1.28g部分纯化的产物)。质谱MH+=555.9。
1H NMR(CDCl3,300MHz):8.5(s,1H)；7.5(s,1H)；7.15(s,1H),4.5(s,2H)；4.15(m,3H)；3.8(br s,2H)；3.4-3.1(m,4H)；9-2.75(m,1H)；2.7-2.5(m,2H)；2.4-2.2(m,2H)；1.25(m,3H)。
步骤D
向300ml HCl(冷却至-10℃)中加入亚硝酸钠(1.86g,27mmol)并搅拌5分钟。用10分钟向该混合物中逐份加入实施例5步骤C的化合物(5g,9mmol)。将该反应物温热至0-3℃，搅拌2小时。向该混合物缓慢加入75ml次磷酸，将该反应混合物于冰箱中保持约16小时。将混合物倾至冰中，用50％(v/v)氢氧化钠将pH调至9-10。用乙酸乙酯萃取。干燥乙酸乙酯层并真空浓缩为残留物。将残留物层析(硅胶，10％-20％乙酸乙酯/己烷)得到3.7g产物。质谱MH+=541.0。
1H NMR(CDCl3,200MHz):8.52(s,1H)；7.5(d,2H)；7.2(s,1H),4.15(q,2H)；3.9-3.7(m,2H)；3.5-3.1(m,4H)；3.0-2.5(m,2H)；2.4-2.2(m,2H)；2.1-1.9(m,2H)；1.26(t,3H)。
步骤E
将步骤D的产物(0.70g,1.4mmol)与8ml浓盐酸水溶液混合，于回流下将该混合物加热过夜。加入30ml 1N氢氧化钠水溶液，然后加入5ml 50％氢氧化钠水溶液，用二氯甲烷萃取。用硫酸镁干燥萃取物，真空浓缩得到0.59g目标化合物。质谱M+=468.7。m.p.=123.9-124.2℃。
步骤F
制备得自实施例5步骤E的化合物(8.1g)的甲苯溶液，加入17.3ml 1M DIBAL的甲苯溶液。于回流下加热该混合物，用40分钟缓慢加入(滴加)21ml 1M DIBAL/甲苯溶液。将该反应混合物冷却至约0℃，加入700ml 1M盐酸水溶液。分离并弃去有机相。用二氯甲烷洗涤水相，弃去萃取物，然后加入50％氢氧化钠水溶液碱化水相。用二氯甲烷萃取，经硫酸镁干燥萃取物，真空浓缩得到7.30g目标化合物，为对映体的外消旋混合物。
步骤G-对映体的分离
用制备性手性层析(Chiralpack AD,5cm×50cm柱，用20％异丙醇/己烷+0.2％二乙胺洗脱)分离实施例5步骤F的外消旋的目标化合物，得到上述化合物的(+)-异构体和(-)-异构体。
(+)-异构体的理化数据m.p.=148.8℃；质谱MH+=472；[α]D25=+65.6°(12.9mg/2ml甲醇)(-)-异构体的理化数据m.p.=112℃；质谱MH+=472；[α]D25=-65.2°(3.65mg/2ml甲醇)步骤H
(+)-异构体将实施例5步骤G的(+)-异构体产物(3.21g,6.80mmol)和150ml无水DMF混合。使1.33g(+)-异构体与1.37g 1-N-叔丁氧基羰基哌啶基-4-乙酸、1.69g(8.8mmol)DEC、1.19g(8.8mmol)HOBT和0.97ml(8.8mmol)4-甲基吗啉反应，于室温下将该混合物搅拌过夜。真空浓缩去除DMF，加入50ml饱和的碳酸氢钠水溶液。用二氯甲烷(2×250ml)萃取，用50ml盐水洗涤萃取物，经硫酸镁干燥。真空浓缩为残留物，层析(硅胶，2％甲醇/二氯甲烷+10％氢氧化铵洗脱)得到2.78g产物。质谱MH+=694.0(FAB)；[α]D25=+34.1°(5.45mg/2ml甲醇)。
步骤I
处理2.78g实施例5步骤H的化合物和60ml二氯甲烷，然后冷却至0℃，加入55ml TFA。于0℃，将该混合物搅拌3小时，加入500ml1N氢氧化钠水溶液，接着加入30ml 50％氢氧化钠水溶液。用二氯甲烷萃取，经硫酸镁干燥，真空浓缩，得到1.72g产物。m.p.=104.1℃。质谱M+=597；[α]D25=+53.4°(11.42mg/2ml甲醇)。
步骤J
向溶于无水二氯甲烷(6ml)中的实施例5步骤I的化合物(0.11g,0.19mmol)和三乙胺(0.08ml,0.57mmol)中加入丙酰氯(0.04ml,2eq)。于室温下搅拌过夜后，加入1M盐酸，振摇该混合物。分离有机相，用1N氢氧化钠洗涤，然后经硫酸镁干燥。过滤并真空浓缩，得到目标化合物(0.10g，产率83％,mp106.4-109.3℃)。
FPT IC50=0.0068μM。
原料的制备通过以下制备性的实施例来示范说明用于制备本发明化合物的原料，这些例子不应构成对本公开范围的限制。此类原料可以用本领域已知的方法制备，如见J.K.Wong等的Bioorganic & MedicinalChemistry Letters(第3卷，第6期，第1073-1078页，(1993)、U.S.专利5089496、5151423、4454143、4355036,PCT/US94/11390(WO95/10514)、PCT/US94/11391(WO95/10515)、PCT/US94/11392(WO95/10516)；Stanley R.Sandler和Wolf Karo的OrganicFunctional Group Preparations(第2版，Academic Press,Inc.,SanDiego,California，第1-3卷，(1983))和J March,Advanced OrganicChemistry,Reactions & Mechanisms,and Structure，第3版，JohnWiley & Sons,New York，第1346页．(1985)等的方法。本发明范围内的其它机理途径和类似结构对本领域技术人员来说是显而易见的。
测定体外酶测定根据WO/10515或WO95/10516公开的方法测定FPTIC50(法呢基蛋白转移酶的抑制，体外酶测定)。实施例中的数据证明本发明的化合物为部分纯化的大鼠脑法呢基蛋白转移酶(FPT)Ras-CVLS法呢基化的抑制剂。数据也表明本发明的化合物为部分纯化的大鼠脑FPT Ras-CVLS法呢基化的有效抑制剂(IC50＜＜10μM)。
在由本发明所述的化合物制备药用组合物时，惰性的、药学上可接受的载体可以为固体或液体。固体制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。粉剂和片剂可含有约5-约70％的活性组分。适当的固体载体是本领域已知的，如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、蔗糖、乳糖。片剂、粉剂、扁囊剂和胶囊剂为适合口服给药的固体剂型。
制备栓剂时，首先将低熔点的蜡如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物融化，搅拌下将活性组分均匀分散其中。然后将融化的均匀混合物倾至方便大小的模中，使其冷却并因此固化。
液体制剂包括溶液、悬浮液和乳液。适合胃肠外注射的实例为水或水-丙二醇溶液。
液体制剂也可以包括供鼻内给药的溶液。
适合吸入的气雾剂制剂可包括溶液和粉末形式的固体，它们可以与药学上可接受的载体例如惰性压缩气体混合。
也包括在临使用前将其转化为供口服或胃肠外给药的液体制剂的固体形式制剂。此类液体制剂包括溶液、悬浮液和乳剂。
也可以将本发明的化合物透皮给药。透皮组合物可以为膏剂、洗剂、气雾剂和/或乳剂，包括为本领域目的的常用的基质型或药库型的透皮贴剂。
优选该化合物口服给药。
优选该药用制剂为单位剂型。为此类剂型时，该制剂可以分为含有适当量(如达到所需目的的有效量)的活性组分的单位剂量。
制剂的单位剂型中活性化合物的量可以根据具体的使用情况在约0.1mg-1000mg、更优选在约1mg-300mg之间变化或调整。
根据病人的需要和待治疗疾病的严重程度可以改变使用的实际剂量。本领域技术人员可以容易地决定特殊情况下的合适剂量。一般而言，治疗以比该化合物的最佳剂量稍低的剂量开始。此后，逐渐增加剂量至在特定情况下达到最佳效果。为方便起见，可以将每日总剂量分开，并根据需要在全天中分次给药。
在考虑了各种因素如病人的年龄、身体状况和体积以及治疗的症状的严重程度后，根据医师的判断调整本发明的化合物及其药学上可接受的盐的给药量和频率。一般口服给药的推荐剂量方案为每天10mg-2000mg、优选每天10-1000mg在全天分2-4次给药以阻断肿瘤生长。当在该剂量范围内给药时，所述化合物是无毒性的。
下列为含有本发明化合物的药用剂型的实施例。本发明的药用组合物方面的范围不受所提供的实施例的限制。
药物剂型实施例实施例A-片剂
制备方法将序号1和2的成分在适合的混合器中混合10-15分钟。将与序号3成分的混合物制粒。如果需要可通过粗筛(如1/4”,0.63cm)磨碎湿颗粒。干燥湿颗粒。如果需要，过筛干燥的颗粒并使其与序号4的成分混合10-15分钟。加入序号5的成分并混合1-3分钟。在合适的压片机上将该混合物压片成适当的大小和重量。
实施例B-胶囊
制造方法使序号1、2和3的成分在适合的混合器中混合10-15分钟。加入序号4的成分并混合1-3分钟。在合适的包囊机上将该混合物填入两节-的硬明胶胶囊中。
尽管结合以上提出的具体的实施方案介绍了本发明，它的许多另外的方案、修改和变化对本领域普通技术人员来说应是显而易见的。所有这些选择、修改和变化都将认为是在本发明的精神和范围内。
权利要求
1．为下式结构的化合物或其药学上可接受的盐
2．抑制细胞异常生长的药用组合物，它包括有效量的权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。
3．抑制细胞异常生长的方法，该方法包括给予有效量的权利要求1的化合物。
4．权利要求3的方法，其中被抑制的细胞为表达激活的ras癌基因的肿瘤细胞。
5．权利要求3的方法，其中被抑制的细胞为胰肿瘤细胞、肺癌细胞、骨髓性白血病肿瘤细胞、甲状腺滤泡肿瘤细胞、脊髓发育不良肿瘤细胞、表皮癌肿瘤细胞、膀胱癌肿瘤细胞和结肠肿瘤细胞。
6．权利要求3的方法，其中细胞异常生长的抑制通过抑制ras法呢基蛋白转移酶产生。
7．权利要求6的方法，其中所述抑制为对肿瘤细胞的抑制，其中Ras蛋白由于非Ras基因的其它基因癌突变被激活。
全文摘要
公开为酶即法呢基蛋白转移酶抑制剂的新的三环化合物和药用组合物。也公开抑制Ras功能并因此抑制细胞异常生长的方法。该方法包括给予生物体系新的三环化合物。具体地讲,该方法抑制哺乳动物如人的细胞的异常生长。
文档编号C07D401/12GK1237176SQ97199601
公开日1999年12月1日 申请日期1997年9月11日 优先权日1996年9月13日
发明者F·G·恩乔罗格, J·M·克莱, 刘怡宗, A·G·塔弗拉斯, A·阿芳索 申请人:先灵公司