专利名称：抑制受磷蛋白活性以治疗心脏病和心力衰竭的方法
本申请申明享有于1998年11月2日登记的美国专利临时申请No.60/106,718和于1999年7月27日登记的美国专利临时申请No.60/145,883的优先权，本文将它们全部纳入作为参考。
背景技术：
发明领域本发明主要涉及治疗心力衰竭的方法，具体的说涉及抑制受磷蛋白(PLB)活性来治疗心肌功能紊乱。
背景信息在美国和其他发达国家中心力衰竭是导致发病率和死亡率的主要原因。充血性心力衰竭的特点是心脏收缩减少和舒张迟缓，然而充血性心力衰竭病理生理学途径的基本分子机制很大程度上还是未知的。当今治疗心脏病的方法主要是姑息性的，并没有针对被认为导致心肌紊乱发作和发展的基本生物途径。
心肌衰竭是一种复杂的、综合的、多因素疾病，其中赋予易感性的遗传学途径与伴随心脏损伤、压力和血量超负荷的生物力学应力的环境刺激以及细胞骨架成分的遗传性缺陷相交织。在对生物力学应力的反应中，一系列平行和汇聚的信号传递途径被激活，导致代偿性肥大的适应性反应。随后，就可能发生心室扩张和泵功能衰竭(与活的心肌细胞损失相关)的转变、收缩成分的减少、肌丝紊乱和间质纤维化。
最近，触发编程性细胞死亡发作的信号转导途径的激活已意味着将促进心力衰竭病理转变以及gp130依赖性心肌细胞存活途径(可阻断细胞凋亡途径的活化并防止心力衰竭和心肌痛的早期发作)。除了这些心肌细胞适应的外来与应力相关的途径外，还必定存在内在的信号传递途径，它导致心脏兴奋收缩(EC)偶联的损伤和相关的心脏收缩性能的严重缺陷(这是心力衰竭表型发展的临床标志)。
肌质网(SR)在协调胞质(cytostolic)Ca2+通过心脏组织的移动中起着整合作用。在由Mercadier等人(J.Clin.Invest.，1990；85305-309)、Arai等人(Circ.Res.，1993；72463-469)、de la Bastie等人(Circ.Res.，1990；66554-564)和Feldman等人(Circ.Res.，1993；73184-192)独立的研究中，对人衰竭的心脏和心力衰竭的动物模型研究表明SR减少摄取胞质Ca2+导致心脏舒张延长。SR中储存的Ca2+释放入胞质液激活心肌收缩，随着Ca2+的再累积致使舒张。心脏SR的Ca2+ATP酶(SERCA2a)的活性是Ca2+再摄入SR的速率决定因素，且SERCA2a活性本身受到受磷蛋白(一种52-氨基酸的心肌特异性SR磷蛋白)的调节。
在Tada等人(J.Biol.I Chem.，1974；2496174-6180)的研究中首先鉴定出受磷蛋白(PLB)是SR膜中磷酸化的主要目标，且看来在其未磷酸化的形式时为SERCA2a活性的强抑制剂。细胞内钙的增加或PLB的磷酸化(在对β-肾上腺素能刺激的反应中)将降低PLB对SERCA2a的抑制作用。PLB主要以五聚体形式存在，当处于高温时，会分离成五个相等的单体。
可将单体PLB的氨基酸分成三个物理和功能域。在α-螺旋中富含Ia和II结构域，与结构较简单的Ib结构域相连。Ia结构域由氨基酸1-20构成的，这些氨基酸的大多数呈α-螺旋构型，带有净正电荷。Ib结构域由21-30氨基酸残基构成，并构成该单体的胞浆部分。结构域II由氨基酸31-52构成，代表跨膜部分，只由不带电荷的、负责稳定五聚体形成的残基构成。
PLB是儿茶酚胺通过cAMP级联系统(cascade)调节心肌功能中的一种介质。在Ia结构域中的Ser(16)和Thr(17)分别是cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)和Ca/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶的确认的结合位点，其功能是催化PLB磷酯的磷酸化，进而解除PLB对SERCA2a活性的抑制作用。由于Ser(16)和Thr(17)可以被激酶磷酸化，此二氨基酸的净电荷可从阳性转变成中性，甚至阴性。与带电荷的SERCA2a残基一起，PLB的Ia结构域中电荷的这种转变可导致PLB-SERCA2a系统中蛋白质-蛋白质相互作用的深刻变化。II结构域也含有一些对PLB功能表达起关键作用的氨基酸，因此在II结构域螺旋一面的这些氨基酸与SERCA2a的跨膜区域相结合。
PLB调节Ca2+-ATP酶的活性有两种途径1)迅速起作用的短期机制，包括PLB磷酸化和钙泵活性的抑制，和2)缓慢起作用的但长期过程，包括通过控制基因表达引起PLB与Ca2+-ATP酶分子比例的变化。在生理条件下，PKA在Ser(16)上的磷酸化是导致Ca2+摄入SR的速度成比例增加和加速心室松弛的主要事件。PLB与SERCA2a相对比例的增加在试验性和人心力衰竭中是SR功能紊乱的重要决定因素。另外，PKA对PLB磷酸化的减弱可能导致心衰心脏舒张功能损伤和Ca2+瞬间转移的延长，由此β-肾上腺素能受体-cAMP系统活动受到增强的交感神经紧张性(sympathetic tone)的严重下调。
Toyofuku等人(J.Biol.chem.，1994；2693088-3094)对诱变的详尽研究表明，PLB胞浆区域的几个氨基酸对其抑制功能非常重要。该研究显示当某些氨基酸突变成带不同电荷的氨基酸时，在HEK293细胞中PLB突变体丧失了它们对共转染的SERCA2的抑制作用。然而，携带这些突变的PLB是否能对内源性野生型PLB起支配性负作用并随后刺激心肌细胞中的内源性SERCA2a仍不清楚。另外，不清楚如何将这些PLB点突变转移入心肌细胞缺口胞质膜屏障以影响内源性SERCA2a活性的机制。
Arber等人(Cell，88393-403；1997)的扩张心肌病的基因工程小鼠模型提供了如下证据心室扩张和心力衰竭的发展取决于心肌质网中特异性Ca2+循环缺陷。在小鼠模型中，除去受磷蛋白(PLB)拯救了类似心力衰竭的结构、功能和分子表型谱。另外，通过PLB点突变被动的体内过量表达解放的受磷蛋白-SERCA2a相互作用，主要激活心室肌细胞的收缩能力。所以，干扰PLB-SERCA2a相互作用可能为预防心力衰竭提供一种新型的治疗方法。
因此可理解干扰PLB-SERCA2a相互作用可作为治疗心力衰竭的潜在治疗目标，但活心肌细胞内化外源分子以提高心肌收缩力仍旧是未解决的课题。必须有一种方法将治疗剂直接输送到心肌细胞的细胞质和细胞核中。渗透素(penetratin)是一类具有输送特性的肽，具有携带亲水性化合物透过质膜的能力。Schwarze等人的研究(Science 2851569-1572；1999)证明了一种用渗透素为基础(penetratin-based)的融合蛋白进行蛋白质转导的方法，该融合蛋白具有变性HIV TAT蛋白质的NH2-端11-氨基酸的蛋白质转导区域(Genebank Accession No.AFO33819)。用这种非细胞类型的特异性转移系统能将寡肽和寡核苷酸直接靶向细胞质和细胞核。一种最具有优良转运特征的肽是相应于果蝇转录因子蛋白(antennapedia)43到58残基(一种果蝇转录因子)的肽。据信此转运肽与细胞膜外侧带电荷磷脂相互反应。该双层的不稳定导致形成了含有此肽的反向微胶粒，其穿过细胞膜并最终到细胞质一侧展开。虽然用转运肽将“货物”分子移入细胞并非新发现的，但至今未证实转运肽能否在心肌细胞中很好运作。
所以依旧需要一种方法通过利用PLB的突变体或小分子抑制剂抑制PLB，以操纵心肌细胞中PLB/SERCA2a的相互作用，以及将这些PLB突变体或小分子抑制剂转运穿过肌质网膜屏障进入心肌细胞的细胞质的方法，来治疗心脏病和心力衰竭。本发明满足了这种需要并且还提供了相关的优点。
发明概述本发明的优点是提供了一种通过抑制受磷蛋白对心脏组织摄入Ca2+的作用，治疗心力衰竭的方法。
本发明的另一优点是提供短肽复合物和重组蛋白，它们的作用是抑制心肌细胞中受磷蛋白和肌质网Ca2+ATP酶(SERCA2a)之间的相互作用，而提高受损心脏的收缩能力和降低高血压个体的血压。
本发明的另一优点是提供由共价连接于野生型、突变型或截短的PLB的转运肽组成的一类化合物。
在本发明的第一个示范性实施例中，将重组腺病毒工程改造成强制表达野生型或突变型PLB，其具有选择性阻断PLB和SERCA2a之间正常抑制性相互作用的能力，从而大大激活了心脏收缩能力。
在本发明的第二个示范性实施例中，收缩蛋白(contractilin)，即一种PLB的重组腺病毒突变体(K3E/R14E)，结合于受磷蛋白并模仿受磷蛋白的磷酸化。这导致肌质网钙泵的激活，从而增加了心脏的收缩能力。
在本发明的第三个示范性实施例中，以受体依赖性方式，将由融合的1)16-残基的转运肽和2)截短的受磷蛋白或类似的肽构成的化合物运输过细胞膜。一旦进入心肌细胞的细胞质内侧，截短的受磷蛋白或类似的肽将作为内源性受磷蛋白的竞争性抑制剂与SERCA2a相互作用。
附图简述
图1是心力衰竭发展中PLB-SERCA2a相互作用工作模式的说明图。
图2显示了对DKO小鼠(a-d)体内心脏紊乱拯救的血液动力学分析和β-肾上腺素能对进行性输入多巴酚丁胺(e-h)反应的血液动力学评估，其中图2a显示了LV压力的最大一阶导数(LV dP/dtmax)图。图2b显示了LV压力的最小一阶导数(LV dP/dtmax)图。图2c显示了LV末期舒张压图。图2e显示了LV压力最大一阶导数(LV dP/dtmax)图。图2f显示了LV压力最小一阶导数(LV dP/dtmin)图。图2g显示了LV末期舒张压图。图2h显示了心率图。
图3显示了分析DKO肌细胞中生理性钙信号传递缺陷得到拯救的数据绘图，其中图3a是一系列WT、MLPKO和DKO心肌细胞中代表性胞内Ca2+瞬间变化图。图3b是Ca2+瞬间变化幅度的柱状图。图3c是心舒张期胞内Ca2+浓度的柱状图。图3d是SR Ca2+含量的柱状图。图3e是MLP缺陷的免疫印迹。
图4a显示了在DKO小鼠中拯救心力衰竭表型胚胎基因标记的斑点印迹分析。图4b是比较野生型、MLPKO和DKO心肌细胞中mRNA相对诱生的柱状图。
图5显示了对PLB和SERCA2a相互作用的抑制，其中图5a是显示心肌细胞长度变化的一系列图。图5b是细胞长度变化数据的概括。
图6a是用Western印迹分析了含表达有义PLB(sPLB)、反义PLB(asPLB)、E2A、R14E、S16N、和K3E/R14E抗单克隆PLB的腺病毒转基因的心肌细胞。图6b是Western印迹所显示的PLB、sPLB和K3E/R14E感染细胞的结果。图6c显示了PLB感染Sole8细胞的Western印迹分析。
图7显示了受表达所指示基因的腺病毒感染的新生大鼠心肌细胞匀浆中摄入的SR Ca2+图。
图8显示了自indo1荧光-心肌细胞的Ca2+瞬间变化得到的数据图。
优选实施例详述为了直接评估Ca2+循环缺陷在心力衰竭转变中的作用，通过除去编码PLB的基因来逆转肌肉特异性LIM蛋白质(MLP)-缺陷型小鼠的心肌病。在分子、细胞和生理水平上，去除MLP的小鼠表现出许多人类扩张心肌病的表型特征。扩张心肌病晚期的一致特征为心壁应力明显增加，伴随有心室壁变薄和心脏收缩能力和舒张降低。由于钙循环对心脏舒张和收缩都是非常重要的，控制肌质网摄入和释放钙途径中的缺陷是造成心力衰竭发展的主要原因。
产生具有PLB缺陷和MLP缺陷的小鼠，其表现出人类心力衰竭特征的所有表型(通常见于MLP单敲除(MLPKO)小鼠)。为了确定这种功能获益是否与MLPKO小鼠中PLB切除(特异性反映了PLB和SERCA2a之间直接相互作用的丧失)相关联，本发明的申请人在PLB基因中加入点突变，其阻断了PLB和SERCA2a之间功能性抑制作用。通过产生编码PLB中点突变的重组腺病毒，证明心力衰竭激动一收缩偶联中的进行性缺陷是与PLB对SERCA2a的抑制增强相关的，且将受磷蛋白缺陷导入心脏肥大转基因模式中结果挽救了心脏功能。这些结果得到以下事实分别支持具有导致心脏特异性过量表达SERCA2a转基因的MLP-缺陷型小鼠，也表现出心肌病表型的拯救。综上所述，这些结果提供了明确的证据肌质网钙循环对心力衰竭的发展至关重要，且指出在心力衰竭发展中PLB对SERCA2a活性的抑制起着关键性调节作用。所以将PLB准确定为治疗的关键靶标。
对MLP-PLB敲除(DKO)小鼠的进一步研究表明在心肌病突变的基础上诱导PLB缺陷，可最大程度刺激心脏收缩。在最大程度β-肾上腺素能刺激后，将基线水平的DKO心脏收缩能力与野生型心脏的收缩能力相比较。结果表明除去了PLB对SR钙泵功能的强烈抑制后，必然会“超常挽救”心肌病心脏的心脏收缩功能。由于PLB是环状AMP-依赖性蛋白激酶A和钙/钙调蛋白依赖性激酶磷酸化的直接底物，可通过磷酸化PLB，以cAMP-依赖性刺激调节心脏收缩能力，从而防止发生与SERCA2a的抑制性相互作用。
基于PLB磷酸化的此种理论，在PLB-缺陷基础上“超常挽救”心肌病MLP-缺陷型小鼠至超过正常的水平，可能仅反映去除了心脏收缩功能张力性抑制中的限速步骤(rate limiting step)。Rockman等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA957000-7005；1998)的研究与此理论相一致证明在MLP-缺陷型小鼠中免除β-肾上腺素能脱敏作用，也可能导致显著拯救扩张的心肌病表型。由于PLB是一种与至少三种调节成分(cAMP-依赖性蛋白激酶、钙/钙调蛋白-依赖性激酶和蛋白质磷酸酶)反应的SR蛋白质，故应确定去除PLB对改进心脏收缩性能的主要作用是否反映PLB与SERCA2a的慢性相互作用，或这种挽救作用是否与PLB和其他已知的或新发现的心脏蛋白质间的相互作用有关。
采用强制表达野生型和突变型PLB的重组腺病毒，本发明在PLB中提供了点突变，从而可选择性阻断PLB和SERCA2a之间的正常抑制性相互作用，且能够在无儿茶酚胺时优势激活心室肌细胞的心脏收缩功能。图1显示了在DKO小鼠中观察到的挽救作用的机制。PLB和MLP都是肌肉特异性蛋白质，因此必然有一条肌细胞自主途径(发展和挽救表型所需要的)，以对抗促进或抑制心肌细胞存活途径的外应力信号。由于在蛋白质水平上PLB和MLP不直接反应(这排除了PLB和MLP之间的直接相互作用作为挽救的基础)，与生化调节途径(将PLB调节途径与扩张的心肌病发病相连)相反，这必然是生理性的途径。如图1所示，在正常的心脏中，通过SERCA2a活性(将钙摄入SR，从而维持正常的心脏舒张和降低心壁应力)维持SR-钙储备。由此，通过钙释放通道，SR释放钙导致正常的量子钙释放，随后激活心脏肌丝，引起心肌收缩。因此，SR中Ca2+含量的增加，导致Ca2+释放的增加和心脏收缩力相应的增加。
SERCA2a的活性受到PLB与SERCA2a直接相互作用的抑制作用的调节，这种抑制作用可通过输送β-肾上腺素能刺激后PLB的cAMP-依赖性磷酸化而减轻。在心力衰竭基础上，由于PLB的抑制作用(由迟钝的β-肾上腺素能反应性所引起)SERCA2a的功能相对降低。结果PLB较少磷酸化，且通过SERCA2a与PLB的缓慢性相互作用，组成性抑制了SERCA2a，从而与正常水平相比导致SR钙含量相对减少。钙储备的这种减少转化为通过钙释放通道钙量子释放的减少，从而导致单个细胞中钙瞬间变化和体内心脏收缩力的降低。在DKO小鼠中，如图1所示除去了PLB的抑制作用，从而减轻了该系统中PLB对SR钙泵的下游抑制作用，从而维持了SR的钙摄入并降低心壁压力(至正常水平)。同时这增加了SR钙含量，从而维持了正常的钙量子释放，因而能够维持心脏的正常收缩和舒张。
敲除肌肉特异性LIM蛋白质和双敲除小鼠采用含纯合的去除两个独立肌肉特异性基因的双敲除(DKO)小鼠模型进行了本发明的测试。为此目的，将敲除PLB(PLBKO)的小鼠与具有敲除MLP(MLPKO)背景的小鼠(后者具有扩张心肌病体内心力衰竭复合表型的分子、结构和生理特征)交配。将这些小鼠的F3代用于实际试验，从而在观察DKO系心脏表型时，消除任何潜在的来自PLBKO或MLPKO系的背景作用。
与年龄和性别相匹配的野生型小鼠(4.60±0.21mg/g，n＝7；p＜0.001)相比，MLPKO小鼠表现出心脏/体重比率明显增加(6.34±0.22mg/g，n＝8)。DKO小鼠的心脏/体重比率(5.13±0.19mg/g，n＝9)显著小于MLPKO小鼠的(p＜0.01)，而与野生型的无统计学差异。为了评价DKO小鼠心脏重量的减少是否与MLPKO小鼠中所见的细胞骨架表型遭破坏的改善有关，对MLPKO和DKO同窝出生的仔鼠(littermate)心脏进行了电子显微镜分析。在MLP-/-背景中去除PLB能挽救最初见于MLP缺陷型心脏中的超微结构缺陷的宽频谱(包括肌原纤维紊乱和块状纤维化)。这些数据表明去除PLB不仅防止了心脏总重的增加，还防止了MLPKO心肌病小鼠中心肌细胞结构的破坏和纤维化。
为了评估在DKO小鼠中是否挽救了体内所见全心脏功能的显著减少，用年龄匹配的同窝出生的仔鼠进行超声波心动描计。如表1所示，在DKO小鼠中证明防止了心室扩张。左心室舒张末期尺寸(LVEDD)和收缩末期尺寸(LVESD)增加显示MLPKO小鼠具有增大的心室，而DKO小鼠心室的LVEDD在正常范围。围绕纤维缩短的平均速度(平均Vcf)和组分缩短的百分比(％FS)(收缩期心脏功能的标志)在年龄匹配的DKO同窝出生的仔鼠中有所改善(如表1所示)。与非同窝出生的野生型小鼠(作为对照)相比，DKO小鼠中大部分超声波心动描计数据与野生型小鼠的那些类似，虽然DKO小鼠中％FS略有减少。另外，6月龄后，DKO小鼠的心脏功能保持在正常范围内(n＝2)。除了心室扩张减少外，DKO心脏看起来有些肥大。在DKO小鼠中LVEDD与LV后壁厚度的比值明显降低，表明与MLPKO或野生型小鼠相比DKO小鼠的心壁应力减少。这些结果表明DKO小鼠的全心脏功能保持在与对照心脏的参数相当的范围内。应指出与MLPKO和DKO小鼠相比，PLB缺陷的杂合小鼠表现出功能恢复至中间水平，提示部分去除PLB可明显改善MLPKO小鼠心力衰竭表型的功能。
表1超声波心动描计评估
MLPKO对MLPKO/PLBhet或DKO或野生型；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001野生型对MLPKO/PLBhet或DKO；p＜0.05，p＜0.01，§p＜0.001MLPKO/PLBhet对DKO#p＜0.05已证明MLPKO小鼠的β-肾上腺素能反应性显著迟钝且腺苷酸环化酶活性降低。在小鼠中通过同源重组而去除PLB能增强心脏收缩性能达到与正常心脏用最大β-肾上腺素刺激时相当的水平。为了证明去除PLB能逆转血液动力学缺陷和标记的β-肾上腺素能受体脱敏作用(与扩张心肌病相关的)，心导管检查和评估了麻醉的小鼠。
几个独立的血液动力学参数证明在DKO小鼠中用循环性充血将严重心脏紊乱恢复到正常水平。在基线水平上LV收缩力(由LV dP/dtmax评估)和舒张(由LVdP/dtmin评估)看来比野生型小鼠的高，比得上PLBKO小鼠(如图2a和2b所示)。在MLPKO心肌病小鼠中观察到去除PLB逆转了LV舒张末期压的明显提高(如图2c所示)。
图2d的分析表明在DKO小鼠中Tau(LV松弛和舒张功能的标志)也正常化，其与心壁应力的改善相一致。这些数据提示在心肌病MLPKO小鼠中去除PLB可挽救收缩和舒张紊乱。在MLPKO小鼠中所见的LV dP/dtmax和LV dP/dtmin对β-肾上腺素能刺激的迟钝反应(如图2e和2f所示)表明在MLPKO小鼠中存在着严重的β-肾上腺素能脱敏作用。在DKO小鼠中多巴酚丁胺对心脏收缩(LV dP/dtmax)和驰张(LV dP/dtmin)没有刺激作用(如图2e和2f所示)。在基础条件下DKO心脏中这些参数已被激发达到它们的最高水平。
用多巴酚丁胺最大刺激野生型心脏后，在无任何儿茶酚胺刺激时，LV dP/dtmax和LV dP/dtmin与DKO小鼠中的这些参数没有差异。这一证据证实PLB和SERCA2a的相互作用抑制了正常和心肌病性心脏的心脏收缩力，且抑制这种相互作用在无儿茶酚胺刺激时可能对心脏发挥最大功能起显著作用。图2h显示在DKO小鼠和MLPKO小鼠中保持了对多巴酚丁胺的变时性反应性，从而证明β-肾上腺素能反应对心室肌细胞而不是对起博类型细胞的特异性。
为了确定在DKO小鼠中恢复体内心脏功能的机制，评估了几种Ca2+信号传递的独立参数。显然在DKO小鼠中改变Ca2+体内平衡将导致血液动力学变化、胞内Ca2+的瞬间变化和SR中与Ca2+循环相关的蛋白质的表达。如图3a-c所示，MLPKO肌细胞表现出Ca2+瞬间变化的幅度与舒张期Ca2+浓度的正常水平相比有所减弱。MLPKO小鼠中衰减速度的略微加速提示在MLPKO小鼠Ca2+摄入末期有代偿性机制运作。PLB的去除与Ca2+瞬间变化持续时间的变短、衰减加速和幅度的保留相关连。图3d显示与野生型小鼠相比，MLPKO小鼠中SR Ca2+的含量明显减少，而在DKO小鼠中却增加。定量免疫印迹(如图3e所示)表明MLP缺失与SERCA2a、PLB和集钙蛋白的蛋白质水平明显变化不相关，提示与SERCA2a或受磷蛋白蛋白质水平简单地反射性降低相反，在MLPKO小鼠中Ca2+循环的缺陷是基于EC偶联的功能性损伤而致。
心力衰竭的一个特征是胚胎基因程序的重新活化，其对增加血液动力学负荷的代偿性反应可能有贡献。为了证明DKO小鼠血液动力学改善伴随有转录水平、ANF、α-骨骼肌动蛋白和β-MHC mRNAs表达的改善性变化，检测了为心力衰竭已建立的胚胎标记。如图4a和4b所示，MLPKO小鼠的心室表现出ANF增加了26倍，α-骨骼肌动蛋白增加了13倍，β-MHC mRNAs增加了8倍。而DKO小鼠的ANF仅增加了1.9倍，α-骨骼肌动蛋白或β-MHC mRNAs没有明显增加。所以，去除PLB大大地抑制了MLPKO小鼠中胚胎基因程序的诱导。
上述研究表明去除PLB能挽救心力衰竭的各个参数和相关心肌收缩力的缺陷。为了确定这种挽救作用的机制，必须评估PLB和SERCA2a的缓慢性相互作用是否确是正常和肌病心脏心肌收缩力的限制性因素。在最大儿茶酚胺刺激后，将DKO小鼠基础心脏功能“超-挽救”到与野生型小鼠相当的水平，提示抑制这种相互作用可在无儿茶酚胺刺激时，对心脏发挥最大功能起显著作用。
PLB的重组腺病毒转基因突变体在维持对SERCA2a抑制作用时需要PLB的某些氨基酸残基，运用该知识可基因工程制造几种PLB、V49A(Seq.ID.No.2)、E2A(Seq.ID.No.3)、R14E(Seq.ID.No.6)的单个点突变，PLB、K3E/R14E(Seq.ID.No.6)的双点突变以及有义和反义性PLB(Seq.ID.No.1)转基因，以破坏PLB对SERCA2a的抑制作用。采用能使小鼠心脏基因体内转移的重组腺病毒，与未感染的肌细胞相比，过量表达V49A(一种PLB中的单点突变)的心肌细胞表现出收缩力增加，而过量表达野生型PLB的心肌细胞表现出收缩力降低(如图5所示)。可以得出以下结论干扰SERCA2a和PLB之间相互作用的可行性和实用性得到了清楚的证明。PLB-SERCA2a的相互作用看来是建立体内基础心肌收缩力和舒张设置点的限速步骤，破坏这种相互作用能缩短β-肾上腺素能通路的流程。
图6a显示了对含有表达有义PLB(sPLB)、反义PLB(asPLB)、E2A、R14E、S16N和K3E/R14E(抗单克隆PLB抗体)(Affinity BioReagents)的腺病毒转基因的肌细胞作的其他Western印迹分析。对PLB蛋白质含量作定量测定、归一化成α-肌动蛋白以确定变化量、并与腺病毒/SR对照(无转基因)相比较，显示sPLB、E2A和R14E突变体的PLB蛋白质水平分别增加了150％(PLB5+PLB1)、72％和57％。相反肌细胞中asPLB和S16N的PLB蛋白质水平分别减少了54％和33％。引入K3E/R14E转基因感染肌细胞，导致形成五聚体PLB的不同的带型。除PLB5(该五聚体)还出现多个PLB条带。这还伴随有PLB5丰度的降低(与对照相比)。
通过用PLB-缺陷型So18细胞替代心肌细胞来进一步评估Western印迹带型的特性。用仅表达转基因sPLB或K3E/R14E或表达这两者的重组腺病毒感染So18细胞。如图6b所示，Western印迹显示单克隆PLB抗体检出了受sPLB感染细胞中的PLB但不能检出K3E/R14E。So18细胞与腺病毒转基因重组感染导致形成了多个PLB条带。另外，PLB五聚体丰度减少且同时出现上带。可以确定PLB与SERCA2a反应并且主要抑制SERCA2a，作为与非抑制性五聚体相平恒存在的单体。根据这种知识，K3E/R14E和野生型PLB的异源五聚体比野生型PLB的同源五聚体更稳定。因此，将异源五聚体分解成抑制SERCA2a的单体是不利的。K3E/R14E与内源性PLB相互反应并形成复合物，并伴随有同源五聚体形成量的减少。如此，通过封阻SERCA2a反应位点，单体K3E/R14E可作为内源性野生型PLB的非抑制性竞争物。
测定SR的钙摄取活性，以进一步评估突变型和反义PLB对SERCA2a的影响。测定不同Ca2+浓度时SR摄取Ca2+的初速度可反映SERCA2a的活性。如图7所示，受重组腺病毒转基因K3E/R14E和asPLB感染的新生大鼠肌细胞显示与无转基因的对照相比，达到相同活性SERCA2a所需的Ca2+浓度降低，表明刺激了SERCA2a的活性。摄取活性为最大值一半时，Ca2+浓度的EC50(单位为μmol/L)无转基因对照(SR-)为0.20±0.02、K3E/R14E为0.11±0.01、asPLB为0.13±0.01。在成年大鼠心肌细胞中也检测了K2E/R14E和asPLB对SERCA2a的作用。腺病毒转基因K3E/R14E明显降低了EC50(36％)，而asPLB感染所引起的变化却无统计学显著性。新生和成年心肌细胞之间作用的明显差异可能与不同发育阶段心肌细胞中PLB丰度不同有关。PLB在成年心肌中的丰度几乎是新生心肌的2倍。
为了进一步检验K3E/R14E和asPLB对SERCA2a的作用，用indo1荧光指示剂测定新生心肌细胞中胞内Ca2+的瞬间变化。将从各实验条件得到的indo1辐射测量数据分别换算成各收缩期Ca2+瞬间变化的最大值和最小值，然后对比和求平均值。如图8所示，K3E/R14E和asPLB的衰变曲线移位到LacZ对照的左侧。另外，在大部分舒张时间点上，K3E/R14E明显不同于LacZ，而在几个舒张时间点asPLB明显不同于LacZ。测得的LacZ、K3E/R14E和asPLB衰减的半衰期分别为0.28秒(100％)、0.20秒(73％)和0.22秒(79％)。K3E/R14E(73％)和asPLB(79％)的值明显不同于从LacZ表达病毒得到的值(p＜0.05)。
除采用PLB的各种点突变或PLB的有义或反义序列产生腺病毒转基因外，也可制备抗PLB肽的抗体然后将其表达为RNA插入腺病毒载体中。为了产生多克隆PLB抗体(“收缩蛋白”，或具有超活性结构域的鸡抗体肽)，用代表细胞质结构域的3-19氨基酸的PLB肽反复接种鸡。3轮加强接种后(在第15、42和54天接种)，用购得的纯化系统(EGGstract IgY Purification System-Promega)从蛋黄纯化得到总IgY。证明有阳性免疫应答后，可从脾和骨髓收获淋巴细胞。从这些细胞可获得以抗体轻链和重链超变区形式的RNA，然后用RT-PCR扩增(该方法是本领域熟知的)。
然后将扩增和纯化的超变区RNA融合入单一cDNA(Seq.ID.No.9)中，随后克隆入质粒载体读框中(编码噬菌体表面蛋白质)。用标准噬菌体展示技术，选择鸡免疫文库中表达对PLB肽有阳性应答的噬菌体。在一系列富集能特异性结合PLB的噬菌体后，选出20个克隆作ELISA。然后用放射活性Ca2+转运试验分析所得的最好的5个结合物。进一步分析2个最好的SR Ca2+转运激活剂。发现这两个克隆都能明显刺激Ca2+转运入SR的速率。
为了证明由收缩蛋白(PLB抗体)产生的重组蛋白质在活细胞中也有功能，构建了一表达收缩蛋白的腺病毒载体。Western印迹分析受腺病毒转基因感染的新生和成年大鼠心肌细胞显示心脏细胞中能表达该收缩蛋白。用突变型和反义PLB作放射活性Ca2+转运分析表明收缩蛋白能加速细胞质中Ca2+的移动。
在其他方法中，用质粒转染而非腺病毒转染来进行基因送递。如用共转染的绿色蛋白监测，发现相对于腺病毒载体转染的细胞，K3E/R14E-和asPLB-转染的肌细胞表现出RT50分别减少了43(p＜0.05)和9％(p＜0.1)。因此，用腺病毒或共-转染方法，将K3E/R14E和asPLB引入心肌细胞以降低舒张期Ca2+瞬间变化的持续时间。这些结果似乎反映了MLPKO的发现与DKO小鼠间的差异，其中Ca2+瞬间值的变化证实去除PLB与Ca2+瞬间变化持续时间的缩短、衰减加速和保持幅度相关。综上所述，这些数据证明K3E/R14E和asPLB刺激SERCA2a的活性，从而导致加速心肌细胞中Ca2+的瞬间变化。
为了确定由于PLB突变所提高的SERCA2a活性和加速Ca2+瞬变是否导致收缩行为的变化，用边缘检测分析了心肌细胞的收缩力。用LacZ、K3E/R14E或asPLB的腺病毒转基因感染成年兔心肌细胞。培养3天后，不同组间自发性收缩细胞的数量有明显差异(LacZ＜＜asPLB＜K3E/R14E)。表2提供了K3E/R14E和asPLB对心肌细胞收缩能力的作用。如该表所示，与LacZ对照相比，K3E/R14E增加了74％组分性缩短，伴随RT50减少25％，+dL/dt增加了115％。当asPLB感染后检验肌细胞收缩能力时发现肌细胞组分性缩短增加是显著的，增加了57％，而RT50和+dL/dt的变化却不明显。
表2
*p＜0.05**p＜0.1得到的数据表明SERCA2a活性的增加转化成心肌细胞舒张的加速。K3E/R14E感染的心肌细胞表现出组分性缩短的增加，这提示由于SERCA2a活性的增加使SR负荷Ca2+的量增加。另外，K3E/R14E感染增加了自发性收缩肌细胞的数量(一种很可能与SR增加的Ca2+负荷引起的Ca2+振荡量增加相关的现象)。综合起来，这些数据表明K3E/R14E以显著减少其对SERCA2a的抑制方式作用于内源性野生型PLB，从而对野生型PLB具有优势抑制作用。
用肽治疗来抑制PLB活性另外，本发明还提供用肽治疗来抑制受磷蛋白的活性和送递这种治疗的模式，所根据的发现是可用突变体PLB分子来控制内源性PLB，以显性负方式抑制PLB功能，这种抑制可改善心力衰竭心脏的功能。
对于作用于靶细胞系统的治疗剂(如PLB-SERCA2a相互作用的抑制剂)而言，必须有一种装置通过细胞膜将它们内化入细胞质。转运抑制剂的方式既可通过以转运或渗透为基础的PLB肽的方式，也可包括腺病毒或脂小泡转移。为了该目的，构建了由转运肽和PLB蛋白质分子融合组成的一种化合物。该转运肽包括antennapedia(即果蝇转录因子蛋白质)序列的16个残基。该复合物的第二个肽可以是截短的PLB蛋白质的序列。可用相应于天然PLB蛋白质以及PLB蛋白质突变体或截短形式的肽来实现其他治疗作用。
转运肽-PLB复合物的一个有益的功能是抑制心肌细胞中PLB与SERCA2a间的相互作用，从而提高患病心脏的收缩能力。本发明还抑制循环系统动脉/小动脉周围平滑肌层中PLB与SERCA2a之间的相互作用这将导致血管舒张和血压降低。所以，在治疗心脏病时有双重有益作用，首先提高心力衰竭心脏的心脏收缩能力，另外可降低高血压个体的血压。同样可以预见还可抑制PLB与其他细胞类型SERCA蛋白质的相互作用，如神经组织中SERCA1-PLB的相互作用。
可用位于冠状动脉中的导管极佳地实现将这种分子引入注入心脏的血流中。当这种分子存在于心肌细胞周围的细胞外环境中时，其迅速进入心肌细胞，并抑制PLB与SERCA2a的结合。转运肽起转运功能，它表现出迅速将其自身和附着的“货物”肽以受体非依赖性方式转运通过细胞膜的能力。一旦处于心肌细胞的细胞质中，PLB片段将作为内源性PLB与SERCA2a相互作用的竞争性抑制剂。
当无PLB结合而发挥抑制作用时，SERCA2a能更有效地将Ca2+泵送入SR，从而提高心肌细胞更强和更迅速收缩的能力。心肌细胞更强的收缩能力转化成心脏更有力的收缩能力。在体内，本发明可作为心力衰竭的治疗方法，极易施用，且在心脏需要植入左心室辅助装置(LVAD)或已植的患者中最有效。
虽然果蝇转录因子蛋白的43-58残基已明确为转运肽，且在本发明中作用良好，但本发明并不限制于这种方法的转运。其他潜在的转运方法包括采用8个分支的聚赖氨酸主链来连接转运和货物肽(cargo peptide)，但也不限于这种多分支结构。还探索了附着于一PLB肽的一种靶肽作为长肽组成的化合物。另外，还制作了大量能在细菌中产生带六个组氨酸(H6)尾的渗透素和渗透素-PLB重组蛋白质的DNA构建物。将渗透素肽工程改造加工入此蛋白质的氨基酸端或羧基端。
已显示PLB的胞质片段对SERCA2a的胞质部分具有如同整个PLB分子的强结合亲和力。所以，一旦转运的PLB分子处于心肌细胞的胞质中，预见PLB片段就可作为内源性PLB与SERCA2a相互作用的竞争性抑制剂。
这种形式的治疗方法适用于患严重心泵功能降低、难用药物进行治疗和需要机械性辅助装置(等待心脏移植时)的患者。另外，可将PLB突变体的优势负抑制功能的分子机制用于设计和实施抑制性小分子高产率筛选的策略中。
以下实施例用于说明本发明，但对本发明无任何限制作用。
实施例1产生用于超声波心动描计术的敲除小鼠系为了分析在扩张心肌病体内心力衰竭表型复合物的结构和生理特征，产生了以下敲除小鼠品系，用具有纯合性缺失两种非依赖性肌肉特异性基因的双敲除(DKO)小鼠模型进行。用于该策略，将PLB-/-(受磷蛋白缺陷型)纯合小鼠与MLP-/-(肌肉-特异性LIM蛋白质)纯合小鼠交配。将MLP-/-×PLB-/-纯合杂交产生的F1代交配以产生PLB+/-、PLB+/-双杂合表型。由PLB+/-/PLB+/-双杂合交配产生F2代，从而产生了突变体MLP等位基因的纯合小鼠和突变体PLB等位基因的杂合小鼠，或是MLP野生型和突变体PLB等位基因的杂合小鼠。从PLB+/+/PLB+/-交配产生的F3代，产生PLB-/-/PLB-/-(DKO)、MLP-/-/PLB+/+(MLPKO)、和MLP+/+/PLB-/-(MLPKO/PLBhet)同窝出生的仔鼠，或从MLP+/+/PLB+/-交配产生MLp+/+/PLB+/-(PLBKO)、MLP+/+/PLB+/+(野生型)和MLP+/+/PLB+/+(PLBhet)同窝出生的仔鼠。用PCR或从尾部活检样品分离出的基因组DNA测定了这些靶向基因杂交产生的基因型。
为了评估各种敲除小鼠品系的血液动力学特性，在用阿佛啶(2.5％，20μl/kg体重)或甲苯噻嗪(0.005mg/g)和氯胺酮(0.1mg/g)麻醉的小鼠上进行心导管插入和超声波心动描计。经胸腔M-方式超声波心动描计示踪表明MLPKO小鼠有心室扩张伴心壁运动降低，表明抑制了心脏功能增加了心壁应力，而DKO小鼠心室尺寸和心脏功能都正常。图2a-d显示了野生型(WT)的基线参数，n＝7，MLPKO，n＝8，DKO，n＝9，和PLBKO，n＝5。数据以平均值±SEM表示。MLPKO对其他组；*p＜0.5，**p＜0.001，WT对DKO；#p＜0.01。在图2e-h中，进行了β-肾上腺素能对多巴酚丁胺的进行性灌注反应的血液动力学评估，其中WT(□)，n＝7只小鼠，MLPKO(●)，n＝8只小鼠，和DKO(○)，n＝9只小鼠。MLPKO对WT或DKO；#p＜0.05，+p＜0.01，*p＜0.001，WT对DKO；3p＜0.01。
实施例2钙瞬间变化的分析为了评估PLB对SR钙含量和钙瞬间变化的抑制作用，从野生型或敲除小鼠的右心室壁分离出心肌细胞。为了监测细胞内钙的变化，将分离的肌细胞室温与钙敏感性染料(荧光-3-AM)(1μg/ml)培育30分钟。然后将肌细胞转移到倒置显微镜载物台上的组织室内，以1Hz的速率连续刺激以维持SR钙负荷一致程度。为了测定细胞荧光，用480nm激发波长照射心肌细胞。在510nm用显微荧光计(FM-1000；Solamere Technologies)监测荧光的变化，并用Cellsoft(D.BergmanUniversity of Calgary)软件记录数据供后期分析。用下式标-化荧光值[Ca2+]i＝KD(F-Fmin)/(Fmax-F) (1)式中假定KD为864nM，F是由实验得到的荧光值。在各个心肌细胞的超融合(superfusion)溶液中加入10μM离子霉素来测定Fmax，在该超融合溶液中加入4mMMnCl2来测定Fmin。
用标准咖啡因脉冲方法评估了分离心肌细胞中SR的钙含量。在稳定记录钙瞬间变化后，向心肌细胞施加10mM咖啡因20秒脉冲。该方案导致迅速的咖啡因诱导的Ca2+瞬间变化，然后缓慢衰减回基线值。这种咖啡因诱导的钙瞬变的积分面积定义为SR钙含量。图3a显示了WT、MLPKO和DKO心肌细胞中代表性胞内钙瞬变。与舒张期钙浓度的正常水平相比，MLPKO心肌细胞表现出钙瞬变幅度减小。DKO心肌细胞表现出钙瞬变的持续时间缩短、衰减加速和而幅度保持不变。如图3b所示，在MLPKO肌细胞中钙瞬变的幅度明显降低，而DKO心肌细胞中则恢复。如图3c所示，在这三种不同的心肌细胞组中，舒张期胞内钙浓度没有差异。图3d所示，与WT小鼠相比，在MLPKO小鼠中SR钙浓度明显减少，而DKO小鼠中则增加。如图3e所示，代表性定量免疫印迹显示MLP缺陷与SERCA2a、PLB和集钙蛋白的蛋白质水平的任何明显变化无关。
实施例3构建突变型PLB腺病毒和基因转移可从Genome System，Inc.购得编码人PLB的I.M.A.G.E.聚生体cDNA克隆。将具有完整PLB编码序列的DNA片段亚克隆入pBluescriptII KS载体(即已知的大肠杆菌克隆载体)(ATCC登录号No.87047)中。用从Stratagene购得的PCR诱变系统引入有义突变(Val49Ala)。通过质粒pJM17和含RSV启动子和SV40聚A序列的穿梭质粒之间的同源重组产生表达野生型和突变型人PLB的重组腺病毒。用标准方法滴定浓缩的病毒制剂。将腺病毒载体注射入1日龄的新生小鼠心脏中，进行体内心脏基因的有效转移。注射入小鼠心脏后4周，分离心肌细胞，测定细胞的缩短。通过共转染表达GFP(作为标记)的腺病毒载体来鉴定具有突变转基因的心肌细胞。
实施例4构建PLB抑制剂-转运肽复合物将转运肽和PLB蛋白质间接地附着于聚赖氨酸的主链上，制备了PLB抑制剂分子。另外，也可将PLB分子制成串联附着于货物肽序列的转运序列组成的单一长肽。转运肽由果蝇转录因子蛋白的43-58残基(SEQ ID NO7)(果蝇转录因子蛋白质)组成的。用PLB的前16个残基(SEQ ID NO8)衍生出货物肽。需要指出此货物序列可以从野生型PLB或突变型PLB的片段衍生得到。
将4个转运肽与4个和PLB前16个残基匹配的肽连接，构建了PLB抑制剂分子。主链接头是8个分支的赖氨酸，通常用于多抗原肽(MAP)的合成。MAP树脂的前4个支链用于合成果蝇转录因子蛋白肽。除去另4个支链的保护，用作合成PLB货物肽的起点。所以，这种用于最初特性分析的PLB抑制剂具有4个果蝇转录因子蛋白肽支链，和4个PLB货物肽支链。另外，可将PLB抑制剂构建成通过一肽键将货物肽和转运肽彼此连接的一个肽，或通过二硫键将货物肽和转运肽彼此连接。可有效地将PLB抑制剂分子转运入分离的新生大鼠心肌细胞中，且显示细胞的收缩能力提高，可从图5a和b看出这些结果。与未感染的心肌细胞相比，过量表达V49A PLB点突变的心肌细胞显示出收缩能力提高，而过量表达野生型PLB的心肌细胞表现出收缩能力降低。
实施例5渗透素肽TAT和ANT进行了细胞水平的研究来评估两种渗透素肽、两种突变型PLB-渗透素肽、和两种多抗原肽(MAP)增强分离的小鼠心肌细胞收缩周期的能力。两种渗透素肽包括PLB-ANT(SEQ ID NO10)和TAT-PLB(SEQ ID NO11)，各具有PLB序列的20个残基部分，附着于ANT的5’端(SEQ ID NO14)或TAT的3’端(SEQ ID NO15)。两种突变型PLB肽，即突变型PLB-ANT(SEQ ID NO12)和TAT-突变型PLB(SEQ IDNO13)，表现出PLB序列的20残基中S16E突变。多抗原肽包括具有8个渗透素(ANT)结构域和的MAP和具有4个渗透素结构域和4个PLB结构域的MAP。
评估各渗透素-PLB肽以测定它们增强分离的小鼠心肌细胞收缩周期的能力，思路是渗透素-PLB肽可作为PLB-SERCA2a相互作用的优势负抑制剂。表3显示了TAT-PLB肽对分离的心肌细胞的结果。对于这些数据，在几组心肌细胞上反复测试以确定有TAT-PLB肽(样品1-7)和无此肽(对照1-8)时，通过收缩周期的长度相对变化。各样品加入10μMTAT-PLB肽浓缩液，对照则不加。
表3
每20毫秒进行一次测定，长速单位是任意的，但通常相当于一个完整细胞的长度。以最大长度与最小长度的差除以最大长度来计算收缩百分比。时间对长度作图得到U形曲线，选出该曲线最线性的节段，“U”的左侧代表收缩，右侧代表舒张。r2柱显示数据与曲线拟合多么良好，其中1.0表示完全拟合。
虽然看来肌细胞趋于更大、更迅速的收缩，但由于数据的高度变异性T-检验分析没有鉴定出统计学差异。
实施例6六组氨酸标记的渗透素产生了大量DNA构建物以在细菌中生产六组氨酸(H6)标记的渗透素和渗透素-PLB重组蛋白质。用可购得的表达载体pRSET(Invitrogen)产生了重组蛋白质H6-ANT(SEQ ID NO16)。虽然这种重组蛋白质没有附着PLB，但它被基因工程改造而具有表位标记，当进入心脏后可用于检测该蛋白质。H6-ANT的变异体也可表达含PLB序列、H6-wtPLB-ANT(SEQ ID NO17)，以及H6-PLB(S16E突变体)-ANT蛋白质和H6-PLB(V49A突变体)-ANT蛋白质(分别为SEQ ID N018和19)。还以较低水平表达了H6-β-半乳糖苷酶-ANT，H6-ANT和H6-β-半乳糖苷酶-TAT(没有列出序列)。制备了残基68和67含有两个突变的无功能ANT-渗透素(其中Trp突变成Phe)作为其他三种渗透素-PLB蛋白质的阴性对照。
为了测定这些重组渗透素蛋白质对心脏收缩能力的作用，对一只小鼠腹腔内注射2mg H6-ANT肽。第二只小鼠腹腔内注射2mg H6-ANT突变型蛋白质。培养3小时后，处死小鼠，取出心脏作分析。通过迫使血流回到主动脉弓来取出心脏中的血液。将各心脏解剖成心房组织、右心室组织和左心室组织。用生理平衡的PBS溶液充分冲洗所有这些组织，在液氮中迅速冷冻。然后将组织在8M尿素、2％氚(triton)-X100中裂解10分钟，取等量上清液在15％PAGE上进行电泳。将条带转移到PVDF膜上。用抗His抗体标记膜，以鉴定裂解液是否含有表位标记的蛋白质。
本文所公开的本发明提供了几种通过抑制或改变心肌细胞中受磷蛋白和肌质网Ca2+-ATP酶之间的相互作用治疗心力衰竭的方法。虽然本发明已参考上述实施例进行描述，但可以理解在不脱离本发明精神时还可有许多改进。另外，本发明仅受限于附带的权利要求书。
序列表<110>Kenneth Chien，Wolfgang Dillman，Susumu Minasmiswa，Huaping He，Masahiko Hoshi jima，Markus Meyer，ChristopherScott，Yibin Wang，Gregg Silverman<120>抑制受磷蛋白活性以治疗心脏病和心力衰竭的方法<130>6627-9025<140>未知<141>1999年11月2日<150>US60/106，718<151>1998年11月2日<160>9<170>Word Perfect版本8.1<210>1<211>52<212>PRT<213>人受磷蛋白<220>野生型<221>氨基酸序列<222>1...52<400>1Met Glu Lys Val Gln Tyr Leu Thr Arg Ser Ala Ile Arg Arg Ala Ser Thr Ile1 5 10 15Glu Met Pro Gln Gln Ala Arg Gln Lys Leu Gln Asn Leu Phe Ile Ash Phe20 25 30 35Cys Leu Ile Leu Ile Cys Leu Leu Leu Ile Cys Ile Ile Val Met Leu Leu 5240 45 50<210>2<211>52<212>PRT<213>人受磷蛋白<220>Val49Ala突变体<221>氨基酸序列<222>1...52<400>2Met Glu Lys Val Gln Tyr Leu Thr Arg Ser Ala Ile Arg Arg Ala Ser Thr Ile1 5 10 15Glu Met Pro Gln Gln Ala Arg Gln Lys Leu Gln Asn Leu Phe Ile Asn Phe Cys20 25 30 35Leu Ile Leu Ile Cys Leu Leu Leu Ile Cys Ile Ile Ala Met Leu Leu 5240 45 50<210>3<211>52<212>PRT<213>人受磷蛋白<220>Glu2Ala突变体<221>氨基酸序列<222>1...52<400>3Met Ala Lys Val Gln Tyr Leu Thr Arg Ser Ala Ile 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Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser Ser Arg Ser110 115 120 125Ser Thr Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Ala130 135 140Leu Ser Leu Val Cys Arg Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe His Met145 150 155 160Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Asp165 170 175Asp Gly Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Gly Ala Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile180 185 190 195Leu Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asp Asn Leu Arg200 205 210Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Lys Thr Lys Cys Gly Gly Asn215 220 225 230Gly Trp Cys Gly Ala Asp Arg Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile235 240 245Val Ser Ser Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr250 255 260 265Ala Ser269<210>10<211>36<212>PRT<213>人受磷蛋白<220>PLB-ANT<221>氨基酸序列<222>1...36<400>10Met Glu Lys Val Gln Tyr Leu Thr Arg Ser Ala Ile Arg Arg Ala Ser Thr Ile1 5 10 15Glu Met Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys20 25 30 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Phe Ile Asn Phe Cys Leu Ile Leu Ile Cys Leu Leu Leu Ile35 40 45Cys Ile Ile Val Met Leu Leu His His His His His His Lys Gly50 55 60Glu Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Ar9 Met Lys65 70 75Trp Lys Lys Ala79<210>19<211>79<212>PRT<213>大肠杆菌<220>H6-PLB(Val49Ala突变型)-ANT<221>氨基酸序列<222>1...79<400>19Met Glu Lys Val Gln Tyr Leu Thr Arg Ser Ala Ile Arg Arg Ala1 5 10 15Ser Thr Ile Glu Met Pro Gln Gln Ala Arg Gln Lys Leu Gln Asn20 25 30Leu Phe Ile Asn Phe Cys Leu Ile Leu Ile Cys Leu Leu Leu Ile35 40 45Cys Ile Ile Ala Met Leu Leu His His His His His His Lys Gly50 55 60Glu Phe Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys65 70 75Trp Lys Lys Ala79
权利要求
1.一种治疗心力衰竭的方法，其特征在于，所述的方法包括诱导受磷蛋白缺陷。
2.如权利要求1所述的治疗心力衰竭的方法，其特征在于，所述的方法中用外源性受磷蛋白诱导了受磷蛋白缺陷。
3.如权利要求2所述的治疗心力衰竭的方法，其特征在于，所述的外源性受磷蛋白选自突变型PLB、有义PLB、反义PLB、截短的PLB、天然PLB和抗PLB抗体。
4.如权利要求3所述的治疗心力衰竭的方法，其特征在于，所述的突变型PLB包括PLB的点突变。
5.如权利要求3所述的治疗心力衰竭的方法，其特征在于，所述的抗PLB抗体包含收缩蛋白。
6.一种用于抑制受磷蛋白活性的肽治疗剂，其特征在于，所述的治疗剂由第一种肽和第二种肽组成的复合物，其中第一种肽含有转运肽，第二种肽含有货物肽。
7.如权利要求6所述的肽治疗剂，其特征在于，所述的转运肽选自基于渗透素、腺病毒、细菌和脂小泡的转运肽。
8.如权利要求6所述的肽治疗剂，其特征在于，所述的货物肽选自突变型PLB、有义PLB、反义PLB、截短的PLB和天然PLB蛋白质。
9.如权利要求6所述的肽治疗剂，其特征在于，所述的第一种肽能将第二种肽转运通过细胞膜。
10.如权利要求6所述的肽治疗剂，其特征在于，所述的第一种肽和第二种肽通过一共价键连接。
11.如权利要求10所述的肽治疗剂，其特征在于，该共价键由分支聚赖氨酸主链、单一肽键或二硫键构成。
12.一种治疗心力衰竭的方法，其特征在于，所述的方法包括通过抑制PLB-SERCA2a之间的相互作用而增强心脏的收缩能力。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，通过抑制PLB对肌质网Ca2+ATP酶的作用，增强心脏的收缩能力。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的方法用外源性受磷蛋白抑制受磷蛋白缺陷。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的外源性受磷蛋白选自突变型PLB、有义PLB、反义PLB、截短的PLB、天然PLB和抗PLB抗体。
16.如权利要求15所述的治疗心力衰竭的方法，其特征在于，所述的突变型PLB包括PLB的点突变。
17.如权利要求15所述的治疗心力衰竭的方法，其特征在于，所述的抗PLB抗体包含收缩蛋白。
全文摘要
本发明提供一种治疗心力衰竭的方法,通过采用短肽复合物和重组蛋白质,它们通过抑制心肌细胞中受磷蛋白和肌质网Ca
文档编号C07K14/47GK1354671SQ99815335
公开日2002年6月19日 申请日期1999年11月2日 优先权日1998年11月2日
发明者K·基耶, W·迪尔曼, 南沢享, 何华平, 星岛正彦, M·迈耶, C·斯科特, 王义斌, G·J·西尔弗曼 申请人:加利福尼亚大学董事会