非抗凝血剂的多糖组合物的制作方法

专利名称：非抗凝血剂的多糖组合物的制作方法
非抗凝血剂的多糖组合物背景肝素(由肥大细胞产生并从自然的来源中分离的一种高度硫酸化的肝素样葡糖 胺多糖(HLGAG))是一种被广泛使用的临床抗凝血剂。然而，天然的或未分级肝素的作用是 很难预测的，并且必须密切监护患者以防止过度抗凝作用或抗凝不足。与未分级肝素(UFH) 相比，通过不同的聚合性肝素的分级或解聚的方法而获得的低分子量肝素(LMWH)作为抗 凝血剂具有更可预测性的药理作用，减少的副作用、持续的抗凝血活性、以及更好的生物利 用率。数个LMWH已被批准用于血栓性病况的门诊治疗。在治疗癌症患者中，对抗血栓剂的潜在作用存在着越来越多的兴趣。来自几个最 近的临床试验的结果提示了对于用LMWH治疗的某些类形的癌症患者的一种生存优势(综 述于 Lemoine，2005，Journal ofClinical Oncology，23 :2119_20)。发明_既述本发明部分地基于多糖制剂的发展(例如，衍生自肝素的多糖制剂，这些制剂缺 少实质性抗凝血剂活性(例如，基本上不具有抗凝血剂活性的多糖制剂)但在其他非凝结 介导的生物学过程中仍保持着活性)以及产生它们的方法。这些化合物可以具有以下特 点中的一种或多种1)抗Xa活性以及抗IIa活性，各自小于50IU/mg，以及2)抗转移的、 抗血管新生的、抗纤维化的和/或抗炎性的活性。在本文中披露的多糖也可以具有将它们 与其他多糖(例如，可商购的肝素)相区别的结构特征。例如，在本文中提供的一种多糖制 剂可以具有以下特征中的一个或多个该制剂具有小于50 %的乙二醇裂解的糖醛酸残基； 该制剂具有每条多糖链不超过3个乙二醇裂解的糖醛酸残基(UG)；该制剂具有超过40% 的U2sHns,6S 二糖残基；该制剂的脱硫酸作用的程度小于40%;在该制剂中的一条或多条多糖 链具有一个非还原端糖醛酸残基的一个4，5-不饱和结构；在该制剂中的一条或多条多糖 链在该还原端具有一个2，5-脱水甘露醇残基；并且该制剂的重均分子量是在3，500Da与 7，OOODa之间。本披露包括具有这些特性和特征中的一种或多种的制剂连同制备并使用这 些制剂的方法。本披露的特征是使用此类制剂的方法。因此，在第一方面，本发明的特征是具有以下特征的一种多糖制剂(例如，一种肝 素衍生的制剂)(a)在3，500Da与7，OOODa之间的重均链分子量；(b)抗Xa活性以及抗 IIa 活性，各自小于 50IU/mg (例如，抗 Xa 活性小于约 40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、 或 10IU/mg，并且抗 IIa 活性小于约 40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、 或3IU/mg)；以及(c)在该制剂中小于50%的乙二醇裂解的糖醛酸残基(例如，小于40%、 30 %、25 %、或20 %的乙二醇裂解的糖醛酸残基)。在一些实施方案中，该制剂含有在5 %与 50%之间的乙二醇裂解的糖醛酸残基(例如，在5%与40%、5%与30%、10%与50%、10% 与40%、或10%与30%之间的乙二醇裂解的糖醛酸残基)。在第二方面，本发明的特征是具有以下特征的一种多糖制剂(例如，一种肝素衍 生的制剂)(a)在3，500Da与7，OOODa之间的重均链分子量；(b)抗Xa活性以及抗IIa 活性，各自 小于50IU/mg(例如，抗Xa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、或 10IU/mg，并且抗 IIa 活性小于约 40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、或3IU/mg)；以及(c)该制剂的多糖链具有每条多糖链不超过3个乙二醇裂解的糖醛酸残基 (Ug)(例如，每条多糖链含有每条多糖链不超过2个或不超过1个乙二醇裂解的糖醛酸残基 (Ug)) ο在第三方面，本发明的特征是具有以下特征的一种多糖制剂(例如，一种肝素衍 生的制剂)(a)在3，500Da与7，OOODa之间的重均链分子量；(b)抗Xa活性以及抗IIa 活性，各自小于50IU/mg(例如，抗Xa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、或 10IU/mg，并且抗 IIa 活性小于约 40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、或 3IU/mg)；以及(c)该制剂的多糖链具有每条多糖链不超过3个乙二醇裂解的糖醛酸残基 (Ug)(例如，每条多糖链平均不超过2. 5个、不超过2个、不超过1. 5个、或不超过1个乙二 醇裂解的糖醛酸残基(Ue)。在第四方面，本发明的特征是具有以下特征的一种多糖制剂(例如，一种肝素衍 生的制剂)(a)在3，500Da与7，OOODa之间的重均链分子量；(b)抗Xa活性以及抗IIa 活性，各自小于50IU/mg(例如，抗Xa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、或 10IU/mg，并且抗 IIa 活性小于约 40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、或 3IU/mg)；以及(c)该制剂具有超过40%的U2sHns,63二糖残基(例如，超过50%、60%、70%、 或80%的U2SHNS,6S:糖残基)。在一些实施方案中，该制剂具有一种小于40% (例如，小于 30%、20%、或10% )的脱硫酸作用的程度。在第五方面，本发明的特征是一种缺少实质性抗凝血剂活性(例如，基本上不具 有抗凝血剂活性)的多糖制剂(例如，一种肝素衍生的制剂)，其中该制剂包括多个多糖，这 些多糖包括式I [Uw-Hx, y,丄 [Ug-Hx, y,丄其中U表示一个糖醛酸残基，而H表示一个己糖胺残基；其中m和η是整数，以使m = 4 至 16(例如，4 至 8、4 至 9、4 至 10、4 至 11、4 至 12、4 至 13、4 至 14、或 4 至 15)，并且n= 1至4(例如，1至2或1至3)；w = _20S 或-20Η;χ = -NS 或-NAc ；y = -30S 或-30H;2 = -605或-60H;并且 其中符号 表示m和η标记的单元是沿着该多糖链分布的并且并非必须按照顺 序，其中W、χ、y、以及ζ在每个m标记的单元上各自是相同或不同的，并且其中χ、y、以及z.在每个η标记的单元上各自是相同的或不同的。在第六方面，本发明的特征是缺少实质性抗凝血剂活性(例如，基本上不具有抗 凝血剂活性)并且具有抗转移活性的一种多糖制剂(例如，一种肝素衍生的制剂)，其中该 制剂包括多个多糖，这些多糖包括式II [Uw-Hx, y, Jffl- [Ug-Hx, y,Jn- [Uw-Hx, y, J。- [Ug-Hx, y, J p- [Uw-Hx, y, J q 其中 U 表示一个糖醛 酸残基，而H表示一个己糖胺残基；其中m至r是整数，以使m = 0 至 10 ；η = 0 至 3 ；ο = 0 至 10 ；ρ = 0 至 3 ；q = 0 至 10 ；w = -20S 或-20H ；χ =-NS 或-NAc;y = -30S 或-30H ；ζ = -60S 或-60H ； 并且 其中w、x、y和ζ在每个m、n、0、p、或q标记的单元上各自是相同的或不同的。在 一些实施方案中，n+P之和小于或等于4(例如，小于或等于3、2、1、或0)。在一些实施方案 中，该制剂具有在3，500至7，OOODa之间的重均链分子量。本发明还包括在本文中所说明的制剂(如上述)中任何一种的药学上可接受的盐 类以及包括在本文中所说明的制剂和/或它们的药学上可接受盐的组合物(例如，药物组 合物)。在本文中说明的(例如，以上说明的)制剂中的任何一种可以具有其他特性。例 如，以上说明的制剂或药物合物之一可以进一步具有以下列出的功能特性或结构特性中的 一种或多种。在一个实施方案中，在该制剂中的这些多糖链中至少有一个在该非还原端具有以 下结构之一 其中X是H或Me，而R是H或SO3。例如，该制剂或药物组合物的大约10%、20%、30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,或基本上所有的非还原端具有该结构。
在一个实施方案中，在该制剂或药物组合物中的这些多糖链中至少有一个在该还原端包括一个2，5-脱水甘露醇残基。例如，在该制剂或药物组合物中的大约10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或基本上所有的多糖链在该还原端包括一个2， 5_脱水甘露醇残基。在一个实施方案中，该制剂或药物组合物具有一种分子量分布，这样使得该制剂 的10%至50% (例如，10%至40%、10%至30%、15%至30%或15%至25% )的寡聚糖具 有小于3000Da的分子量；40%至65% (例如，45%至65%、50%至65%、或55%至65% ) 的寡聚糖具有在3000Da与8000Da之间的分子量，并且5 %至30 % (例如，10 %至30 %、15 % 至30%、10%至25%、或15%至25% )的寡聚糖具有大于8000Da的分子量。在一个实施方案中，该制剂具有大约1.2至1.7的多分散性(例如，大约1.3至 1. 7,1. 2 至 1. 6、或 1. 3 至 1. 6)。在一个实施方案中，该制剂或组合物具有抗转移活性。在一个实施方案中，该制剂或组合物特异性地连接到VEGF、FGF、SDF-I- α、或 P-选择素中的一种或多种上或抑制它或它们的活性。在一个实施方案中，该制剂或组合物具有小于30 %、25 %、20 %、15 %、10 %的钠含 量。在一个实施方案中，该制剂或组合物包括小于20ppm、15ppm、10ppm、5ppm的碘；小于 30%、25%、20%、15%、10%的硫；小于 50、40、30、20、15ppm 的硼。在另一方面，本发明的特征是制备一种制剂的方法。这些方法包括将UHl与亚硝 酸(HONO)相组合来产生一种多糖制剂；并且，在亚硝酸处理之后，进行反应以便在该制剂 中产生一种乙二醇裂解的糖醛酸残基的至少一部分。在另一方面，制备一种制剂的方法包括将UHl解聚(例如，通过化学水解或酶促 解聚作用)；并且，在解聚作用之后，进行反应以便在该制剂中产生一种乙二醇裂解的糖醛 酸残基的至少一部分。在一个实施方案中，在制剂中产生一种乙二醇裂解的糖醛酸残基的至少一部分的 反应包括用高碘酸盐氧化该多糖制剂；并且用硼氢化钠还原该氧化的多糖制剂。例如，这些 方法包括在大约0°c至10°c的温度下用高碘酸盐氧化该多糖制剂大约10至20小时；并且 在氧化作用之后，在大约5. 0至8. 0的pH下在大约0°C至10°C的温度下用四氢硼酸钠将该 样品还原大约1小时。在另一方面，本发明的特征是制造一种制剂的方法。这些方法包括(1)将未分级 肝素(UFH)解聚(例如，通过亚硝酸解聚作用、水解解聚作用、或酶促解聚作用)来得到一 种多糖制剂；(2)用高碘酸盐氧化该多糖制剂；(3)用硼氢化钠还原该氧化的多糖制剂；并 且⑷将该多糖制剂分离(例如，通过用一种盐以及一种极性的有机溶剂进行沉淀、或通过 经受一种色谱法分离或纯化)，以便由此制备一种制剂。在一个实施方案中，该解聚步骤包括用大约0. 01至0. 05M(例如，大约0. 02至 0. 04M)的亚硝酸在大约2至4的pH下在大约10°C至30°C的温度下处理该UFH大约1至5 小时。在一个实施方案中，该氧化步骤包括用大约0. 05至0. 2M的高碘酸盐在大约0°C至 10°C的温度下处理该多糖制剂大约10至20小时。
在一个实施方案中，该还原步骤包括用大约0. 5%至2. 0% (重量/体积)的硼氢化钠在大约6. 0至7. 0的pH下并且在大约0°C至10°C的温度下处理该氧化的多糖制剂大 约0. 5至3小时。在一个实施方案中，制备或制造一种多糖制剂的方法包括降低该制剂中硼的量。在一个实施方案中，对该制剂评价了一种生物学活性，例如抗转移活性；对VEGF、 FGF, SDF-I α、以及P-选择素中的任何一种的结合；或VEGF、FGF, SDF-I α、以及P-选择素 中任何一种的活性的抑制。如在本文中所使用的，缺少实质性抗凝血剂活性的一种多糖制剂是以下制剂，该 制剂具有各自小于100IU/mg的抗Xa以及抗IIa活性(例如，小于80IU/mg、70IU/mg、或 60IU/mg)。在一些实施方案中，该多糖制剂基本上不具有抗凝血剂活性，即各自小于50IU/ mg的抗Xa以及抗IIa活性。在一些实施方案中，该多糖制剂具有各自小于40、30、20、25、 20、15、10或5IU/mg的抗Xa以及抗IIa活性。如在本文中所使用的，这种脱硫酸作用的程度被定义为当与未分级肝素相比时每 摩尔二糖单元中硫酸根的摩尔降低百分数。如在本文中所使用的，这种硫酸化作用的程度被定义为每摩尔二糖单元中硫酸根 的摩尔平均数。在另一方面，本发明的特征是通过在本文中所说明的一种方法而制备的一种多糖 制剂。在另一方面，本发明包括来自用于制备或分析在本文中所说明的一种多糖制剂的 方法中任何一种的中间体或反应混合物。在另一方面，本发明的特征是一种药物组合物，该组合物包括在本文中所说明的 一种多糖制剂。在一个实施方案中，该药物组合物进一步包括一种药学上可接受的载体。在另一个方面，本发明的特征是治疗一位受试者的方法，该方法包括将一个治疗 有效量的在本文中披露的一种多糖制剂给予该受试者。术语“进行治疗”、“治疗”、以及类似 术语是指将该制剂给予受试者或受试者的一个细胞或组织以便获得一种所希望的药理的、 生理的或临床的效应。用在本文中所说明的一种多糖制剂进行的治疗可以减少、降低、缓 解、改善、延缓、或防止一种现存的不想要的病况或它的发作或一种症状。一个“治疗有效 量”是指在必需的剂量以及时间长度方面对于在受试者体内实现所希望的药理的、生理的 或临床的效应有效的一种量。本发明包括用于治疗一位受试者的方法，该受试者患有、或由危险患有一种转移 性紊乱(例如，一种癌症，例如一种癌或其他实体以及血液学的癌症)。在这些受试者中，治 疗可以包括但不限于抑制肿瘤生长、肿瘤质量的降低、转移病灶的大小或数目的降低、抑 制新的转移病灶的发展、延长生存期、延长无病情进展的生存期、延长病情进展的时间、和/ 或改善生活质量。在另一个实施方案中，该受试者可患有选自下组的一种疾病或病况，该组 的构成为一种炎性紊乱、一种自身免疫性疾病、一种纤维化的或纤维增殖性紊乱或一种特 应性紊乱。炎性紊乱的实例包括但不限于慢性阻塞性肺病、哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠 病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、多发性硬化症、牛皮癣、局部缺血再灌注损伤、败血症 性休克、老年性黄斑变性、动脉硬化、阿尔茨海默病、心血管疾病、血管炎、I型和II型糖尿病、代谢综合征、糖尿病性视网膜病、再狭窄。自身免疫性疾病的实例包括但不限于哮喘、 类风湿性关节炎、炎性肠病、多发性硬化症、牛皮癣、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、斯 耶格伦综合症、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、自身免疫性肝炎、重症 肌无力。纤维化疾病的实例包括但不限于硬皮病、慢性阻塞性肺病、糖尿病性肾病变、肉样 瘤病、特发性肺纤维化、肝硬化、囊性纤维病、神经纤维瘤、子宫内膜组织异位、术后纤维瘤、 再狭窄。特应性疾病的实例包括但不限于特应性皮炎、特应性哮喘、以及过敏性鼻炎。将 本发明的组合物以对于治疗该紊乱或病况而言的一个有效量给予一位受试者，该受试者患 有、或有危险患有这些疾病中的一种或多种。 在一个优选的实施方案中，该受试者患有、或有危险患有一种癌症或转移性紊乱 (例如，一种癌)。例如，该受试者患有一种原发性肿瘤并且具有、或有危险具有该原发性肿 瘤的转移。在一个实施方案中，静脉内或皮下给予或吸入该多糖制剂。在一个实施方案中，将该多糖制剂与另一种治疗(例如，另一种治疗性试剂，例 如，一种细胞毒性或细胞抑制剂，以及它们的组合)进行联合给药。在一个实施方案中，长期给予该多糖制剂，例如在一个特定的时间段内至少2次， 例如在6个月的时间段内至少2次。在一个实施方案中，将一种多糖制剂在1周、2周、3周、 1个月、2个月、3个月、6个月、1年、或甚至更长的时间段内给予2次。可以每天(例如，每 天1次、2次、或3次或4次)、每隔1天1次、每周(例如，一周1次、2次、或3次)、每隔1 周1次、每月、或任何其他长期的给药日程来给予该多糖制剂。对于在本文中所说明的范围中的任何范围(例如，对于一种给定的结构或活性)， 这些范围可以是所披露的那些范围连同其他范围。例如，从一个范围的一个较低末端所 构建的一个范围(例如，对于一个给定的结构单元或活性)可以与另一个范围的较高末端 (例如，该给定的结构单元或活性)相结合以给出一个范围。一种“分离的”或“纯化的”多糖制剂是基本上不含来自衍生出这种多糖的的细胞 或组织来源的细胞物质或其他污染性蛋白、或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他 化学物。“基本上不含”是指一种制剂是至少50%纯的(重量/重量)。在一个优选的实施 方案中，该制剂具有小于约30%、20%、10%并且更优选地5% (按干重计算)的非肝素衍 生的多糖、蛋白质、或化学前体或其他化学物，例如来于制造。这些在本文中也被称作“污 染物”。可以在本文中所提供的一种多糖制剂中存在的污染物的实例包括但不限于钠、硫、 硼、酶(例如，一种肝素酶)、甲醇、乙醇、碘、以及氯化物。本发明的其他特征和优点从以下详细的说明、并且从权利要求中应当是清楚的。附图的简要说明

图1是一个条形图，该图示出了在本文中所说明的一种多糖制剂在鼠黑色素瘤实 验性转移(静脉注射B16F10)模型中的作用。对雌性C57BL/6小鼠(9至10周龄)确定 了肺肿瘤负荷(肺重量-正常肺重量)，对这些小鼠通过静脉注射2x IO5个B16F10细胞 进行攻击，而直接在注射之前用一个单剂量(10mg/kg)的M0NC402(批次R-1-5)、达肝素 (Fragmin )、或MONC 202(阴性对照物，N-脱硫酸多糖)进行预处理。“正常的”表示 未经受攻击的并且未经处理的小鼠。图2是一个条形图，该图示出了在本文中所说明的一种多糖制剂在乳癌转移到肺的一个4T1治疗模型中的作用。针对用乳房内脂肪垫注射SxlO4个4T1细胞进行攻击并且从第4天起如所指示进行治疗的雌性BALB/c小鼠(8周龄)，在第32天确定肺肿瘤负荷(肺 重量_正常肺重量)。详细说明优化的多糖在很多临床环境中，与作为抗凝血剂的UFH制剂相比，可商购的LMWH制剂是更为 优选的，这是因为LMWH具有更可预测的药物代谢动力学并且可以皮下给药。然而，因为用 于出血并发症的潜在性(由于它们的抗凝血剂作用)，目前可供使用的LMWH制剂更不适合 于非凝结介导的紊乱的治疗、和/或用于可能要求更高剂量或长期给药方案的紊乱。本发 明的特征是被设计成缺少实质性抗凝血剂活性同时保留着临床上有利特性的多糖制剂。这 些多糖制剂的特性包括例如缺少实质性抗凝血剂活性，例如基本上没有抗凝血剂活性(例 如，抗IIa活性小于50IU/mg，抗Xa活性小于50IU/mg)，并且具有抗转移的、抗血管新生的、 和/或抗炎症的活性。此类多糖制剂的实例包括多种链，这些链包括以下[Uw-Hx,y, Jm [Ug-Hx,y, Jn其中，U表示一个糖醛酸残基，而H表示一个己糖胺残基，其中m和η是整数，以 使 m = 6 至 18，并且 η = 1 至 4，w = -20S 或-20Η、χ = -NS 或-NAc, y = -30S 或-30H、ζ =-60S 或-60Η、并且 其中符号 表示m和η的单元是沿着该多糖链分布的且并非必须按照顺序，其中 W、χ、y、以及ζ在每个m标记的单元上各自是相同或不同的，并且其中χ、y、以及ζ在每个η 标记的单元上各自是相同的或不同的；以及[Uw-Hx, y, J m_ [Ug-Hx, y, J n- [Uw-Hx, y, J。- [Ug-Hx, y, J p- [Uw-Hx, y, J q 其中，U 表示一个糖醛 酸残基，而H表示一个己糖胺残基，其中m至r是整数，以使m = O至10、η = O至3、ο = O 至 10、P = 至 3、q = 至 10、W = -20S 或-20H、χ = -NS 或-NAc, y = -30S 或-30H、ζ =-60S 或-60Η，并且 其中W、χ、y和ζ在每个m、η、ο、ρ、或q标记的单元上各自是相同的或不同的。
抗IIa活性在本文中披露了多糖制剂，这些多糖制剂提供基本上降低的抗IIa活性，例如大 约0至50IU/mg、大约0至40IU/mg、大约0至30IU/mg、大约0至25IU/mg、大约0至20IU/ mg、大约0至10IU/mg、大约O至5IU/mg、大约O至10IU/mg、大约5至15IU/mg、大约5至 20IU/mg的抗IIa活性。使用针对平行线测定的统计方法以每毫克的抗IIa活性的国际单 位来计算抗IIa活性。使用以下原理来测量在本文中说明的抗IIa活性水平。多糖(PS)+ATIII— [PS · ATIII] IIaPS · ATIII — [PS · ATIII · IIa]+IIa(过量)IIa(过量)+底物一肽+pNA(通过分光光度计测量)在抑制凝血酶中通过在抗凝血酶(ATIII)上样品增强效果来测定抗因子IIa的活 性。凝血酶过量可以间接地通过分光光度计进行测量。可以例如在Diagnostics Stago分 析仪上或在ACL Futura3 Coagulation系统上使用来自Chromogenix的试剂(S-2238底物， 凝血酶(53nkat/Vial)，以及抗凝血酶)、或在任何等效的系统上测量抗因子IIa活性。使 用针对低分子量肝素的第二国际标准来校正分析仪的应答。抗Xa活性优选地，在本文中提供的一种多糖制剂具有大约O至50IU/mg的一种抗Xa活性， 例如大约O至40IU/mg、大约O至30IU/mg、大约O至25IU/mg、大约O至20IU/mg、大约O至 10IU/mg、大约 O 至 5IU/mg、大约 5 至 10IU/mg、大约 5 至 15IU/mg、大约 5 至 20IU/mg。使用 针对平行线测定的统计方法以每毫克抗因子Xa活性的国际单位来计算一种制剂的抗Xa活 性。使用以下原理来测量在本文中所说明的制剂的抗因子Xa活性。PS+ATIII — [PS · ATIII]FXaPS · ATIII — [PS ‘ ATIII ‘ FXa] +FXa(过量)FXa (过量)+底物一肽+pNA (通过分光光度计测量)在抑制活化的因子Xa(FXa)上通过样品对抗凝血酶(ATIII)的增强作用来测定抗 因子Xa活性。因子Xa过量可以间接地通过分光光度计进行测量。可以例如在Diagnostics StagO分析仪上用Stachrom 肝素检测试剂盒、在ACL Futura3 Coagulation系统上用来 自Chromogenix的Coatest 肝素试剂盒、或在任何等效的系统上测量抗因子Xa活性。可 以使用针对低分子量肝素的NIBSC国际标准来校正分析仪的应答。分子量和链长度当确定一种制剂的重均分子量时，大约3500至7000Da、大约3500至6300Da、优选 地大约4000至6000Da、大约4200至5900、或大约4300至5800Da的重均分子量，表明在该
多糖制剂中显著数目的链是具有足够的链长度的。如本文中所使用的，“重均分子量”是指糖醛酸/己糖胺二糖重复体的链的以道尔 顿计的重量平均值。非糖醛酸和/或非己糖胺结构单元的存在不包括在测定该重均分子 量之中。因此，在该制剂中的一条链或多条链中非糖醛酸以及非己糖胺结构单元的分子量 不应该包括在测定该重均分子量之中。从以下等式ΜΨ=Σ (CiHii)/Σ Ci计算重均分子量 (Mw)。变量Ci是在片层i中聚合物的浓度，并且Hli是在片层i中聚合物的分子量。在一个色谱峰上得到了这些总和，该色谱峰含有多个片层的数据。一个片层的数据可以在色谱峰对比时间的图上被绘成一条垂直的线。因此，该洗脱峰可被分成多个片层。重均分子量的计 算是依赖于所有片层的浓度和分子量的总和的平均值。例如使用Wyatt Astra软件或任何 合适的软件可以测量重均分子量。通过具有两个串联的柱(例如，一个TSK G3000SWXL以 及一个G2000 SffXL)的高效液相色谱法，与串联的一个多角度光散射(MALS)检测器以及一 个折射率检测器相偶联来测定在本文中所说明的重均分子量。所使用的洗脱液是0. 2M硫 酸钠，pH 5.0,并且流速是0. 5mL/min。可以例如通过确定在该制剂中这些链的平均链长度和/或通过测定在该制剂内 多条链的重均分子量来进行一种多糖制剂是否包括多条足够链长度的链的一个确定。当确 定平均链长度时，大约5至22个(例如，大约7至18个，典型地大约7至14个、或8至13 个)二糖重复体的一种平均链长度表明在该制剂中显著数目的链是具有足够的链长度的。如在本文中所使用的，“平均链长度”是指在一条链中发生的糖醛酸/己糖胺二糖 重复物的平均链长度。非糖醛酸和/或非己糖胺结构单元(例如，附连的PEG部分)的存 在不包括在测定该平均链长度之中。通过将数均分子量(Mn)除以对于一种二糖(500Da) 而言的数均分子量测定了平均链长度。以下说明了使用SEC MALS来测定数均分子量的方 法。乙二醇裂解的糖醛酸在本文中说明的多糖制剂可以包括一个开口的糖苷环，常规地被称为还原-氧化 作用(RO)衍生物。在这些制剂中，具有邻二醇(vicinyl diol)的一个或多个糖苷环例如 在C2-C3之间的键通过一个氧化作用、随后通过一个还原作用而被打开。这些化合物在本 文中也被称为“乙二醇裂解”的衍生物。在本文中所说明的本发明的另一个实施方案中，这些乙二醇裂解的残基使它们自 己进行随后的官能化作用。因此，这些化合物在衍生自乙二醇裂解的伯羟基基团处还可以 带有相等或不同的基团，例如，醛基团、甲氧基基团、或寡聚糖或肽基团，其范围是从一个单 一的糖或氨基酸到超过一个单元的长度，例如2个或3个单元。在一些实施方案中，小于50%的糖醛酸残基是乙二醇裂解的糖醛酸残基(例如， 小于40 %、30 %、25 %、或20 %的糖醛酸残基是乙二醇裂解的糖醛酸残基)。还原端的结构在一些例子中，在本文中所说明的一种多糖试剂中至少有大约50%的链具有一个 经修饰的还原端结构，如一个2，5-脱水甘露糖残基或被还原生成一种醇的一个2，5-脱水 甘露糖。在一些实施方案中，在该制剂中至少约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、或95%的链具有一个经修饰的还原端结构，这样使得该还原端包括一个2，5-脱水甘 露糖残基或被还原生成一种醇的一个2，5-脱水甘露糖。多分散性在本文中所提供的多糖制剂的多分散性是大约2或更小，例如1. 7或更小，例如大 约1. 7或1. 6至1. 2、大约1. 4至1. 5、以及它们之间的数目。术语“多分散的”或“多分散性”是指一种组合物的重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)。从以下等式Μη =Σ ci/( Σ ci/mi)计算数均分子量(Mn)。变量ci是在片层 i中多糖的浓度，而Mi是在片层i中多糖的分子量。在一个色谱峰上得到了总和，该色谱峰含有多个片层的数据。一个片层的数据可以在色谱峰对比时间的图上被绘成一条垂直的 线。因此，该洗脱峰可以被分成多个片层。数均分子量是依赖于在每个片层数据的分子量 和浓度的一种计算。以上说明了测定重均分子量的方法，并且还将这些方法用于测定多分 散性。制备多糖制剂的方法还考虑了制备多糖制剂(例如，在本文中所说明的制剂)的不同方法。一种方法 包括提供一种前体肝素制剂，该制剂具有大于7000Da的重均分子量或超过7至18个二糖 的一个链长度，并且处理该前体肝素制剂(例如，通过酶促或化学解聚作用，例如通过亚硝 酸解聚作用)来获得具有一种多糖制剂，该制剂具有大约3000至7000Da的重均分子量或 大约7至18个二糖的一个平均链长度。例如，该前体肝素制剂可以是未分级肝素。可以通过一种方法来处理前体肝素制剂，该方法包括解聚作用(例如，通过亚硝 酸处理、水解、或酶促解聚作用)之后跟随一个乙二醇裂解的反应。可以例如通过在大约2 至4的pH下在大约10°C至30°C的温度下用亚硝酸(例如，大约0. 02至0. 04M的亚硝酸) 将该前体肝素制剂(例如，UFH)处理一个特定的时间段(例如，大约1至5小时)来完成亚 硝酸解聚作用。这种乙二醇裂解反应涉及使用高碘酸盐(例如，大约0.05M至0.2M的高碘 酸钠)在大约0°C至10°C的温度下的高碘酸盐氧化作用，持续大约10至20小时。在一些 实施方案中，剩余的杂质(如盐类或二甘醇(DEG))可以通过一种色谱方法(例如，凝胶过 滤色谱法)随后被除去。可任选地，该氧化的制剂然后通过用一种还原剂(例如，大约0.5 至2.0% (重量/体积)硼氢化钠)在大约6.0至7.0的pH下并且在大约0°C至10°C的温 度下处理大约0. 5至3小时而被还原。可以使用酶促消化、化学消化或它们的组合来处理一种前体肝素制剂。化学消化 的实例包括氧化解聚作用(例如，使用H202或Cu+以及H202)、脱氨基切割(例如使用硝酸异 戊酯或亚硝酸、0 “消除性切割，例如用苄基酯、和/或通过碱性处理)。酶促消化可以包括 使用一种或多种降解肝素的酶类。例如，这种或这些降解肝素的酶可以是例如一种或多种 肝素酶，肝素裂解酶，硫酸肝素甘油葡糖胺多糖(glycoaminoglycan) (HSGAG)裂解酶(被说 明成一种葡糖胺多糖(GAG)裂解酶的一种裂解酶，它也可以降解肝素)。优选地，该酶在未 硫酸化的糖醛酸的一个或多个糖苷连接上进行切割。生物学活性在本文中所说明的制剂具有抗转移活性，如在一个转移的动物模型中所测定，其 中注射到C57/BL小鼠尾静脉中的B16F10黑素瘤细胞在肺中俘获并且作为离散的肺部病灶 而增殖。该测定大体上说明于 Gabri etal.，2006，Clin. Cancer Res.，12 :7092_98 中。一种 制剂可以在其他的试验性转移模型中额外地具有活性，这些模型包括C170HM2测定，在该 测定中将C170HM2人直肠癌系细胞注射到腹膜腔中，其中转移的主要位置是到肝脏。在本 文中所说明的制剂还可以在自发性的转移模型中显示出抗转移活性，这些模型例如AP5LV 模型(其中AP5LV人直肠癌细胞被植入到腹膜壁并且显示自发转移到肺部)、或4T1模型 (其中植入到乳房脂肪垫中的4T1鼠乳房癌细胞显示出自发性转移到肺以及其他器官)。在本文中所说明的制剂可以连接到VEGF、FGF、SDF-1 a、以及P_选择素中的一 种或多种上和/或调整(例如，抑制)它或它们的活性。在一些实施方案中，可以测定该 制剂与(例如，连接到)一种靶蛋白(例如，VEGF、FGF、SDF-1 a、或P-选择素)的相互作用，例如在体外例如使用本领域已知的方法。检测连接或调整(例如，抑制)活性的多 种方法和技术是已知的，例如标准的受体竞争测定、荧光能量转移(FET)、荧光共振能量 转移(FRET)(参见，例如美国专利No. 5，631，169 ；美国专利No. 4，868，103)、以及荧光偏 振(FP)。在一些实施方案中，评价一种多糖试剂与一种靶蛋白的连接可以包括这种连接 相互作用的实时监测，例如使用生物分子相互作用分析(BIA)(参见，例如Sjolanderand Urbaniczky(1991)Anal. Chem. ,63 :2338_2345 禾口 Szabo et al. (1995)Curr. Opin. Struct. Biol.，5 699-705) 0表面等离子体共振或“BIA”实时地检测了生物特异性相互作用，没有 标记这些相互作用物的任何一个(例如，BIAcore)。VEGF、FGF、以及P_选择素在体外和体内的细胞上的活性在本领域是熟知的。可 以在体外或在一个基于细胞的测定中或在体内在一个有机体中测定一种多糖制剂对VEGF、 FGF、或P-选择素的一种活性进行调整(例如，抑制)的能力。例如，可以测定一种多糖制 剂对VEGF、FGF、或P-选择素的活性进行调整(例如，抑制)以便调整(例如，刺激)内皮 细胞(例如，人脐静脉上皮细胞)增殖的能力。确定调整FGF活性的示例性方法可以在美 国专利No. 5，733，893中见到。使用一种单细胞、或至少两个或多个细胞的一个集合可以进 行一个基于细胞的测定。该细胞可以是一种酵母细胞(例如，酿酒酵母)或一种哺乳动物 细胞，例如一个细胞系。药物组合物提供了与一种药学上可接受的载体一起配制的组合物(例如，药学上可接受的组 合物)，这些组合物包括在本文中说明的一种制剂。如在本文中所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何以及所有的与胃肠外给药 生理学上相容的溶剂、分散介质、等渗剂以及吸收延缓剂、以及类似物。该载体可以适合于 任何胃肠外给药，例如静脉、肌内、皮下、眼内、直肠、吸入或脊髓给药(例如，通过注射或输 注)。本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型， 如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分散体或悬浮液、以及脂质体。优选的形式取 决于预期的给药和治疗应用的模式。典型的优选的组合物是处于可注射或可输注溶液的形 式。优选的给药方式是肠胃外给药(例如，静脉内、皮下、眼内、腹膜内、肌内)。在一个优选 的实施方案中，通过静脉输注或注射来给予这种制剂。在另一个优选的实施方案中，通过肌 肉内或皮下注射来给予这种制剂。如在本文中所使用的，短语“胃肠外给药”和“胃肠外进行给药”是指除了肠部以 及局部给药之外的给药方式，经常通过注射，并且包括不限于静脉内、肌内、皮下、动脉内、 鞘内、囊内、眼眶内、玻璃体内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、吸入、皮下、表皮下、关节内、 囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。治疗性组合物典型地应该是无菌的并且在制备和储存的条件下是稳定的。可以将 该组合物配制成一种溶液、微乳液、分散体、脂质体、或其他适合于高浓度的有序结构。无菌 的可注射的溶液可以按照要求通过将这种活性化合物(即，多糖制剂)以一个要求的量与 以上列举的一个组分或多个成分的一个组合相结合，之后跟随过滤杀菌作用来进行制备。 大体上，通过将这种活性化合物与一种无菌运载体来制备分散体，这种无菌运载体含有一 种碱性分散介质以及所要求的、来自以上列举的那些的其他成分。在用于制备无菌的、可注射溶液的无菌粉末的情况下，这些优选的制备方法是真空干燥以及冷冻干燥，冷冻干燥产 生了该活性成分的粉末加上来自它的一种之前无菌过滤的溶液的任何额外的所希望成分。 一种溶液的适当流动性可以例如通过使用一种涂层(如卵磷脂)、通过在分散体的情况下 保持所要求的颗粒大小、并且通过使用表面活性剂来维持。通过在该组合物中包括一种延 迟吸收的试剂(例如，不同的聚合物，单硬脂酸盐类以及明胶)可以发生可注射组合物的延 迟吸收。对于多种治疗性应用，这种优选的给药途径/方式是静脉内注射或输注。正如有 经验的业内人士应当理解的，这种给药途径和/或方式将根据所希望的结果而变化。用于注射的配制品可以按照单位剂型来呈现，例如在安瓿、注射器、注射器型笔 (syringe pen)、或者在多个剂量的容器中，例如具有一种添加的防腐剂。这些组合物可以 采用例如处于油性或水性运载体中的悬浮液、溶剂或乳液的形式，并且可以含有配制用试 剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。对于通过吸入进行给药，该制剂可以方便地以一种气溶胶喷雾的给送方式的形式 从加压的包装或一种喷雾器中进行递送，连同使用了一种适合的喷射剂，例如二氯二氟甲 烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。在一种加压的气溶胶的情况 下，通过提供一个阀门递送一个计量的量值可以确定剂量单位。在一个吸入器或吹入器中 使用的(例如，明胶)的胶囊和药筒可以被配置成含有该化合物以及一种适合的粉末基质 (如乳糖或淀粉)的一种粉末混合物。此外，用于吸入治疗的干粉配制品在本发明的范围之 内。此类干粉配制品可以如所披露(例如，在W0 02/32406中)进行制备。除了之前说明的组合物，这些化合物也可以被制成一种贮库制剂。此类长效的配 制品可以与适合的聚合物或疏水性物质(例如，配置成在一种可接受的油中的一种乳液) 或离子交换树脂配置成、或者略微可溶的衍生物，例如配置成一种略微可溶的盐。这些药物组合物还可以包括适合的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些组合物可以与用于给药的说明一起包括在一个容器、包装、或分配器中。该制剂还可以用短期或长期植入设备(例如，一个支架)进行给药。该制剂可以 进行皮下植入，可以被植入到多个组织或器官中(例如，冠状动脉、颈动脉、肾动脉以及其 他的外周动脉、静脉、肾、心、角膜(heartcornea)、玻璃质、大脑、等等)，或者可以在多个组 织和器官(例如，肾囊、心包膜、胸或腹膜间隙)周围的生理空间中植入。该制剂还可以用来涂覆不同的医疗设备。例如，该制剂可以用来涂覆一个支架或 体外回路。这些制剂的此类配制品可以包括使用例如控制释放的珠子、凝胶或微球连同不 同的聚合物，如PLGA、纤维素、藻酸盐或其他多糖。对剂量方案进行调控以提供最适宜的希望的响应(例如，一种治疗性响应)。例 如，可以给予一个快速灌注剂，可以随着时间给予几个分开的剂量、或可以按照由治疗情况 的紧急事件所表明的按比例减少或增加该剂量。尤其有利的是为了给药的方便以及剂量的 均勻性而将胃肠外组合物配置成剂量单位形式。如在本文中所使用的，剂量单位形式是指 物理上离散的、适合作为单一剂量的单位用于有待治疗的受试者；每个单位包含一个预先 确定量的活性化合物，该化合物被计算成以产生与所要求的药学载体相关联的所希望的治 疗效果。本发明的这些剂量单位形式的说明通过以下各项表示并且直接取决于以下各项 (a)这种活性化合物的独特特征以及有待实现的特定的治疗效果，以及(b)在将这种用来
17治疗多个个体中的敏感性的活性化合物进行混合的领域中所固有的限制。应当指出，剂量值可以随着有待缓解的病况的类型和严重性而变化。应当进一步 理解，对于任何特定的受试者，应当根据该个体的需要以及给予或监督这些组合物的给药 的人士的专业判断随时间来调控特定的剂量方案。本发明的药物组合物可以包括一种制剂的一个治疗有效量。该剂量的一个治疗 有效量可以根据以下因素而变化，例如疾病状态、年龄、性别、以及该个体的体重，并且可以 包括超过一个单位剂量。一个治疗有效量还是一个剂量，其中该制剂的任何毒性或有害的 作用被这些治疗上有益的作用超过。一个治疗有效量可以抑制一个可测量的参数，例如 VEGF活性、FGF活性、P-选择素活性、或转移病灶的大小或生长的速率，例如相对于未治疗 的受试者达到至少约20%、更优选地达到至少约25%、30%、40%，甚至更优选地达到至少 约50 %、60 %，并且又更优选地达到至少约70 %、80 %。可以在一个动物模型系统中或在人 体内(例如，在一个临床前模型或一个临床试验中)评价一种化合物对一个可测量的参数 (例如，转移或血管新生)进行抑制的能力。可替代地，可以通过在一个体外测定中检查一 种化合物的活性来评价该组合物的一个特性。对于这种多糖制剂的静脉或皮下给药的示 例性剂量是大约 0. 03mg/kg 至 0. 45mg/kg，例如 0. 03mg/kg、0. 05mg/kg、0. lmg/kg、0. 15mg/ kg、0. 2mg/kg、0. 22mg/kg、0. 25mg/kg、0. 27mg/kg、0. 3mg/kg、0. 35mg/kg、0. 37mg/kg、0. 4mg/ kg、0. 44mg/kg，优选地大约 0. lmg/kg、0. 15mg/kg、0. 2mg/kg、0. 25mg/kg、0. 3mg/kg、0. 35mg/ kg、0. 4mg/kg、0. 44mg/kg、0. 47mg/kg、0. 5mg/kg、0. 55mg/kg、0. 60mg/kg、0. 7mg/kg,优选地 大约 0. 30 至 0. 50mg/kg,例如 0. 30mg/kg、0. 35mg/kg、0. 40mg/kg、0. 42mg/kg、0. 44mg/kg、 0. 47mg/kg或0. 50mg/kg。在一些实施方案中，能够以在1与80mg/kg之间、在1与40mg/kg 之间、在1与30mg/kg之间(例如，在5与50mg/kg/天之间)的剂量来给予这种多糖制剂。还在本发明的范围之内的是包括在本文中提供的一种多糖制剂的套件。该套件 可以包括一种或多种其他要件，这些要件包括使用说明；其他试剂(例如，一种治疗剂)； 用于制备该多糖制剂来进行给药的设备或其他材料；药学上可接受的载体；以及用于给予 一位受试者的设备或其他材料。这些说明可以包括针对治疗性应用的说明，包括建议的剂 量和/或给药方式，例如在患有一种紊乱(例如，在本文中说明的一种紊乱)的患者体内。 该套件可以在一种或多种分开的药物制剂中进一步含有至少一种额外的试剂，例如一种诊 断性或治疗性试剂(例如，如在本文中说明的一种诊断性或治疗性试剂)，适当时进行了配 制。用途这些多糖制剂可以用于治疗一位受试者。如在本文中所使用的，一位受试者是一 种哺乳动物，例如一种非人类的实验性哺乳动物、一种兽医的哺乳动物、或人。非人类的哺 乳动物包括一种灵长动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、或啮齿动物。在本文中提供的制剂可以用来例如治疗或防止一种转移性紊乱(例如，一种癌 症，例如一种癌或其他实体或血液学癌症)。如在本文中所使用的，术语“癌症”是指包括所 有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织、或器官，不考虑组织 病理学类型或侵入的阶段。在本文中披露的方法和组合物对于治疗、或减少与癌症相关联 的转移病灶的大小、数目、或生长速率是特别有用的。癌症的实例包括但不限于实体瘤、软组织瘤、造血肿瘤(hematopoietic tumor)以及转移病灶。实体瘤的实例包括恶性肿瘤(例如，不同器官系统的肉瘤、腺癌、以及癌症， 如影响以下各项的那些头和颈(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞的肺癌)、乳房、 淋巴、胃肠(例如，口、食管、胃、肝、胰、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器以及生殖泌尿道 (例如，肾、尿路上皮、膀胱、卵巢、子宫、子宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)，CNS (例如，神经 细胞或神经胶质细胞，例如成神经细胞瘤(neorublastoma)或神经胶质瘤)、皮肤(例如，黑 素瘤)。可以治疗的造血癌症的实例包括多发性骨髓瘤、淋巴瘤以及白血病以及骨髓发育异 常。在本文中披露的方法和组合物对于治疗(例如，减轻或延迟)与以上提及的癌症相关 联的转移病灶是特别有用的。在一些实施方案中，这位患者将经历一次或多次手术切除一 个组织、化疗、或其他抗癌治疗，并且主要的或唯一的靶点将是转移病灶，例如在骨或淋巴 结或肺或肝或腹膜腔或CNS或其他器官中的转移。本发明的方法(例如，治疗的方法)可以进一步包括监控该受试者的步骤，例如以 下各项中的一个或多个的变化(例如，一种增加或减少)肿瘤大小；对于患有癌症的患者 而言，一种癌症标志物的水平；新病灶的大小或出现的速率，例如在一次扫描中；与疾病相 关的新症状的出现；软组织块的大小，例如一种减小或稳定；生活质量，例如与疼痛相关联 的疾病量，例如骨痛；或与临床结果相关的任何其他参数。可以在以下时期中的一个或多个 中监测该受试者在开始治疗之前；在治疗过程中；或在已经给予了该治疗的一个或多个 要件之后。可以使用监测来评估对于使用这种相同制剂的进一步治疗或使用额外试剂的额 外治疗的需要。大体上，在以上所说明的一个或多个参数的一种减少表示该受试者的改善 的病况。可以将在本文中说明的制剂以单剂量或多剂量给予一位受试者来治疗或防止一 种转移性或癌性紊乱，例如在本文中所说明的一种癌性紊乱。在本文中说明的制剂还可以用于治疗炎性、自身免疫、纤维化、纤维增殖性的、特 应性的、或血管新生性的紊乱。炎性紊乱的实例包括但不限于慢性阻塞性肺病、哮喘、类风 湿性关节炎、炎性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、多发性硬化症、牛皮癣、局部缺血 再灌注损伤、败血症性休克、老年性黄斑变性、动脉硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、心血管 疾病、血管炎、I型和II型糖尿病、代谢综合征、糖尿病性视网膜病、再狭窄。自身免疫性疾 病的实例包括但不限于哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病、多发性硬化症、牛皮癣、I型糖 尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦综合症、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、格-巴二 氏综合征、自身免疫性肝炎、重症肌无力。纤维化疾病的实例包括但不限于硬皮病、慢性阻 塞性肺病、糖尿病性肾病变、肉样瘤病、特发性肺纤维化、肝硬化、囊性纤维病、神经纤维瘤、 子宫内膜组织异位、术后纤维瘤、再狭窄。特应性疾病的实例包括但不限于特应性皮炎、特 应性哮喘、以及过敏性鼻炎。纤维增殖性紊乱的实例包括全身性和局部的硬皮病、瘢痕瘤和肥大性疤痕、动脉 硬化症、再狭窄、纤维肉瘤、神经纤维瘤、以及类风湿关节炎。与外伤相关联的疤痕化的实例 包括由于手术、化疗诱导的纤维化、放疗诱导的纤维化的疤痕化、与损伤或烧伤相关联的疤痕化。在一个实施方案中，这些多糖制剂用于抑制血管新生，例如治疗血管新生性紊乱。 在本文中使用的血管新生是不适当地形成新血管。血管新生性紊乱包括但不限于肿瘤、眼 部的新生血管性紊乱、子宫内组织异位、黄斑变性、骨质疏松症、牛皮癣、关节炎、癌症以及
19心血管紊乱。应当理解，一些紊乱将落于超过一个种类的在本文中所说明的疾病之中。在本文中所说明的制剂还可以用于治疗或防止传染性紊乱，例如疟疾。联合治疗本发明的方法和组合物可以与其他治疗模式联合使用。如在本文中所使用的，“联 合”给药意味着在该受试者的遭受该紊乱的过程中将两种(或多种)不同的治疗递送至该 受试者，这样使得上这些治疗对该受试者的作用在一个时间点上重叠。在一些实施方案中， 一种治疗的递送在该第二治疗的递送开始时仍然发生，这样就给药而言存在着重叠。在本 文中有时这被称为“同时的”或“同时发生的递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在 另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中，这种治疗由于联合给药 变得更加有效。例如，该第二治疗是更加有效的，例如使用较少的该第二治疗见到了一种等 效作用，或者与在该第一治疗的缺失下给予该第二治疗相比该第二治疗将多种症状降低了 一个更大的程度，或者使用该第一治疗见到了类似的情况。在一些实施方案中，递送是这样 使得一种症状的降低、或者与该紊乱相关的其他参数大于使用在另一个缺失的情况下所递 送的一种治疗将观察到的参数。这两种治疗的作用可以是部分地相加的，全部相加的、或大 于相加的。这种递送可以是这样使得所递送的第一处理的作用在递送该第二治疗时仍然是 可检测的。在一个实施方案中，本发明的方法包括给予该受试者一种在本文中说明的制剂、 联合一种或多种额外的疗法，例如手术、放疗、或给予另一种治疗性制剂。在一个实施方案 中，这种额外的疗法可包括化疗，例如一种细胞毒剂。在一个实施方案中，这种额外的疗法 可以包括一种靶向疗法，例如一种酪氨酸激酶抑制剂、一种蛋白酶体抑制剂、一种蛋白酶抑 制剂。在一个实施方案中，这种额外的疗法可以包括一种抗炎性的、抗血管新生的、抗纤维 化的、或抗增殖的化合物，例如一种类固醇、一种生物免疫调节剂、一种单克隆抗体、一个抗 体片断、一种适体、一种siRNA、一种反义分子、一种融合蛋白、一种细胞因子、一种细胞因子 受体、一种支气管扩张药、一种他汀类药物、一种抗炎剂(例如，甲氨喋呤)、一种NSAID。在 另一个实施方案中，这种额外的疗法可以包括不同种类的联合治疗。可以同时地或顺序地 给予该多糖制剂以及额外的疗法。可以与这种多糖制剂进行联合给药的示例性细胞毒性剂包括抗微管剂、拓扑异 构酶抑制剂、抗代谢药、蛋白合成和降解的抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、钼酸盐化试 剂(platinating agent)、核酸合成抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶和DNA甲基转移酶抑制剂、 氮芥、亚硝基脲、亚乙烯亚胺、烷基磺酸盐、三氮烯、叶酸盐/酯类似物、核苷类似物、核糖核 苷酸(ribnucleotide)还原酶抑制剂、长春蔓生物碱、紫杉烷类、埃博霉素、嵌入剂、能够妨 碍一条信号传导通路的试剂、促进细胞凋亡和辐射的试剂、连接表面蛋白来递送一种毒性 剂的抗体偶联物。在一个实施方案中，可以与在本中所说明的制剂一起给予的细胞毒剂是 钼、环磷酰胺、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、托泊替康、伊立 替康、氮杂胞嘧啶核苷、伏林司他、伊沙匹隆、硼替佐米、紫杉烷类(紫杉醇、多西他赛)、细 胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春 碱、长春瑞滨、秋水仙碱、蒽环类(阿霉素和表柔比星)柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米 托蒽醌、光神霉素、放射菌素D、阿霉素、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多
20卡因、普萘洛尔、嘌罗霉素、蓖麻毒蛋白、以及美登醇衍生物。这种联合治疗也可以包括与以下各项进行共同配制和/或共同给予的本发明的 组合物一种或多种额外的治疗剂，例如一种或多种抗癌剂、细胞毒剂或细胞抑制剂、激素 治疗、受体酪氨酸激酶和其他酪氨酸激酶(包括HER-2、EGFR、VEGFR、BCR-ABL, c_KIT (例 如吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、索拉非尼、舒尼替尼、伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼)或 mT0R(例如坦罗莫司、依维莫司、雷帕霉素)的小分子抑制剂、或细胞因子或趋化因子、疫 苗、抗细胞膜受体通道的抗体(包括EGF-EGFR、VEGF-VEGFR、CD19、CD20、CD3、CTLA-4(例如 曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗))和/或其他免疫治疗法。
其他实施方案本发明通过以下实例进行进一步展示，这些实例不应该被理解为是限制。贯穿本 申请中所引用的所有参考文献，专利以及公开的专利申请的内容通过引用结合在此。实例实例1 一种多糖制剂的制备这个实例说明了在本文中说明的一种多糖制剂的产生。概述通过受控的亚硝酸解聚作用之后跟随氧化的乙二醇裂解以及随后的还原成 一种醇而从未分级肝素(UFH)中产生了乙二醇裂解的低分子量肝素醇(GS-LMWH-CH2-OH)。 在第一步中，将UHl解聚以获得解聚的肝素(DPH-CHO)，这种肝素在该多糖的还原端具有一 个脱水甘露糖部分。这之后跟随步骤II用高碘酸钠对在解聚的肝素中存在的2，3-二醇的 氧化切割以便沿着该肝素链(GS-DPH-CHO)产生开环的乙二醇裂解残基。步骤III涉及一 个还原步骤，其中使用硼氢化钠将这些醛基团转化成醇类以产生乙二醇裂解的低分子量肝 素醇。方法概述以下这些段落说明了在本文中说明的一种多糖制剂的制备和特性1.解聚作用将未分级肝素(IOg)溶解于平衡在室温下的IOOmL去离子水中。最后将这种溶液 的PH降到pH 3. 1，之后加入亚硝酸钠(0.03M)。允许将这种反应溶液搅拌3小时，随后将 PH中和、然后加入氯化钠(IOg)。在盐完全溶解之后，在持续搅拌下将甲醇(200mL)加到该 溶液中。然后，将获得的沉淀在6°C下老化2小时。然后，将这种沉淀过滤并干燥以获得产 量为80 %至85%的DPH，并且该DPH具有以下性质Mw 5300-6100Mw分布⑴小于3000道尔顿23-30%(ii)3000 至 8000 道尔顿50_55%(iii)大于 8000 道尔顿15~22%抗-Xa活性80-120IU/mg抗-IIa活性40-70IU/mg2.高碘酸盐氧化作用将在步骤I中获得的醛(5g)溶解于平衡在5°C下的50mL水中。向该溶液加入冷 却的NaIO4溶液(0. lM，50mL)，并且在没有光的条件下允许将该反应混合物搅拌16小时。一旦完成，通过加入二甘醇(IOmL)将该反应淬灭，在这之后将温度回升到室温。然后，将5 克氯化钠加到该溶液中，之后跟随加入150mL甲醇以便将该肝素沉淀。在过滤之前在6°C下 允许将该沉淀老化2小时并且干燥以得到一种乙二醇裂解的多糖(95-98%产率)，该多糖 具有以下特征Mw 5000-5800
Mw分布⑴小于3000道尔顿25-30%(ii) 3000-8000 道尔顿55_60%(iii)大于 8000 道尔顿15-20%3.还原作用将以上在步骤II中获得的乙二醇裂解的多糖(4g)溶解于保持在5°C下的40mL水 中。向该溶液加入硼氢化钠(0.4g)，并且随后将反应混合物搅拌1小时。1小时之后，将该 反应混合物回到室温，之后跟随氯化钠(4g)的加入。在盐溶解之后，将甲醇(SOmL)加到该 溶液中伴随着连续搅拌。然后，允许由此获得的沉淀在过滤之前在6°C下老化2小时并且干 燥以便得到所希望的产品。由此获得了产量为55%至60%的、具有以下特征的一种多糖制 剂Mw 5500-6200Mw分布⑴小于3000道尔顿17-23%(ii) 3000-8000 道尔顿56_62%(iii)大于 8000 道尔顿17_22%抗-Xa活性5-20IU/mg抗-IIa活性l-10IU/mg实例2 多糖制剂的抗转移特性本实例显示这些多糖制剂在多个转移模型中具有抗癌和抗转移活性。模型A 鼠黑素瘤实验型转移(静脉注射B16F10)模型如在实例1中所说明而产生的一种多糖制剂(在本文中称为“M0NC402”)在鼠 黑素瘤实验性转移模型中显示了抗转移活性用一个单剂量(10mg/kg)的M0NC402、达肝素 /Fragmin (—种据报道可降低转移的lmwh)、或M0NC202(阴性对照物，N-脱硫酸多糖) 之后立即静脉注射2xl05个B16F10细胞来治疗雌性C57BL/6小鼠(9_10周龄)一次。在第 21天将小鼠处死并且将肿瘤负荷计算成肺重量-正常肺重量。如在图1中所示，相对于一 种汇集的(未治疗的)对照物，M0NC402显著性地抑制了肺的B16F10集群现象。模型B:结肠癌转移到肝M0NC402在一种正位的肝转移模型中显示了预防性抗转移的活性。通过将C170HM2人结肠直肠肿瘤细胞腹膜内注射到雄性MFl裸(nu/nu)无胸腺小 鼠中而引发了肝转移。将5FU/亚叶酸用作一种阳性对照物。在体外将C170HM2细胞在37°C在5% CO2和潮湿的条件下维持在含有10% (体积 /体积)热灭活的胎牛血清以及2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基中(Sigma)。用0. 025% EDTA收集来自亚汇合(sub-confluent)单层的细胞，将这些细胞在培养基中清洗并且重新 悬浮于无菌的磷酸缓冲盐水(pH 7. 4(PBS))中用于体内给药。将在Iml体积中的1. 5X IO6 个细胞腹膜内注射到65只小鼠中，并且将这些小鼠分成以下的治疗组。
组l:n=10运载体对照组2 :n = 1025mg/kg 5FU/亚叶酸，循环静脉注射，在第1、3、5、7天组3 :n = 105mg/kg化合物1 (达肝素)，皮下，每天一次组4 :n = 105mg/kg 化合物 2 (M0NC402)，皮下，每天一次组6 :n = 1030mg/kg化合物2，皮下，每天一次组7 :n = 5未治疗在细胞注射之后的第一天开始治疗并且持续直到第35天或直到动物所要求的终 止的临床状况。组5和6在第5天缺少一个剂量。在荷瘤小鼠中没有观察到这些测试的化 合物的不良反应。该研究在第35天终止，并且将肝中的肿瘤切除并称重。还对肺结节的数目进行计 数。在表1中概述了平均肝肿瘤重量和横截面积。表1 :C170HM2模型平均肝肿瘤重量和统计分析的概述 NS =没有显著性的MONC 402对降低肿瘤的发生率具有显著性的影响。15mg/kg以及30mg/kg的 M0NC402显著性地将肝肿瘤大小分别减小90% (ρ = 0. 007)和97% (ρ = 0. 004)，并且也 比5FU/亚叶酸显著性地更有效(分别为ρ = 0. 041和ρ = 0. 011)。当与运载体对照组比 较时，达肝素(组3)将肝肿瘤重量降低大概81% (ρ = 0.017)。类似地，这些肿瘤的横截 面积的显著性的降低也显示在使用达肝素(P = 0. 027)以及15和30mg/kg的M0NC402 (分 别为ρ = 0. 016和ρ = 0. 004)的情况。在本研究过程中监测了小鼠体重。在整个研究中每组的小鼠体重均保持在一个对 于所有组而言可接受的范围之内。模型C:乳癌转移到肺
M0NC402在乳癌转移(4T1)的一个同系基因正位模型中也显示了抗转移活性。将SxlO4个4T1细胞注射到8周龄的雌性BALB/c小鼠(WOA)的乳房脂肪垫中。在 第5天开始每天的治疗，它使用盐水、或使用M0NC402而伴有或不伴有每周的顺钼治疗。在 第9天将原发性肿瘤去除并称重。如在表2中所示，与盐水对照组相比，顺钼与M0NC402(10、20、30mg/kg)联用显示 了在肺转移方面的一种统计学上的显著减少，如通过肺重量以及肿瘤结节计数所确定(P < 0. 05，One way ANOVA)。在本实验终止之前的最后3天中，联合治疗组(顺钼+M0NC402 10/20/30mg/kg)也具有更低的乳房肿瘤再生长、胸腔肿瘤转移的发生率以及体重损失(> 2g)的发生率。联合治疗组在手术之后的那周具有更高的暂时体重损失(> 2g)的发生率， 但在一周内恢复。表2. 4T1模型肉眼可见的肿瘤转移计数 在第二个4Τ1实验中，将8χ104个4Τ1细胞注射到雌性BALB/c小鼠8W0A的乳房 脂肪垫中。在第4天开始连续渗透泵递送，它递送了盐水、或M0NC402而伴有或不伴有每周 的顺钼治疗。在第9天去除原发性肿瘤。在原发性肿瘤重量方面这些组之间不存在显著的 差别。然而，免疫组织学分析显示在来自用顺钼以及M-ONC 402联合治疗的小鼠的肿瘤中 微血管密度方面的显著减少。在第32天终止该实验并且采集了不同的样本。6只小鼠或者 发现死亡或者由于整体状态恶化而很早终止了。
通过肺重量、肺肿瘤结节定量(包括结节数目、大小、以及计算的肿瘤体积、连同 组织学定量)测定了 4T1肺转移。结果显示在图2中。MONC 402(20mg/kg/天)单治疗 组没有显著性地抑制4T1肺转移。顺钼(1.25mg/kg)单治疗显示了显著的抗肿瘤功效(ρ <0.05)。顺钼(1. 25mg/kg)与MONC 402 (20mg/kg/天)的联合展示出在降低的肺转移 (P < 0.0005)以及降低的微血管密度方面的功效。重要的是，当与顺钼单治疗组比较时， 通过肺重量(P < 0. 02)、肿瘤结节数量、肺肿瘤的组织学覆盖、以及肺肿瘤微血管密度(P < 0.05，t-检测)所确定，该联合治疗组也显示了更好的抗肿瘤功效，这证明M-ONC 402增 强了顺钼的抗肿瘤功效。模型D 人前列腺癌PC-3M模型联合治疗将5x10s个PC-3M-荧光素酶前列腺癌细胞注射到雄性SCID/Beige小鼠8W0A的 前列腺中。在第3天开始每天的治疗，它使用盐水、或使用M0NC402而伴有或不伴有每周的 顺钼治疗。每周用Xenogen成像系统监测小鼠。在第32天终止该实验。将不同器官分离 并且通过重量和Xenogen成像来评估肿瘤转移。这种M0NC402 (30mg/kg)单治疗抑制了腹膜中的PC-3M转移。与盐水和MONC 402 单治疗组相比，顺钼与M0NC402 (30mg/kg)联合使用降低了肿瘤生长，如通过体内成像所确 定。在特定的实验条件下，在原发性肿 瘤的重量以及转移方面联合治疗(顺钼+M0NC402 30mg/kg)与顺钼单治疗之间不存在显著性差异。
权利要求
一种多糖制剂，该多糖制剂具有以下特征(a)在3,500Da与7,000Da之间的重均链分子量；(b)抗Xa活性以及抗IIa活性，各自小于50IU/mg；并且(c)超过5％并且小于50％的乙二醇裂解的糖醛酸残基。
2.如权利要求1所述的制剂，其中该制剂具有小于30%的乙二醇裂解的糖醛酸残基。
3.如权利要求1所述的制剂，其中该制剂具有在10%与30%之间的乙二醇裂解的糖醛酸残基。
4.一种多糖制剂，该多糖制剂具有以下特征(a)在3，500Da与7，OOODa之间的重均链分子量；(b)抗Xa活性以及抗Ila活性，各自小于50IU/mg；(c)一条多糖链，该多糖链具有一个乙二醇裂解的糖醛酸残基(队)；并且(d)多条多糖链，这些多糖链各自具有不超过3个乙二醇裂解的糖醛酸残基(Ue)。
5.如权利要求4所述的制剂，其中每条多糖链具有不超过2个乙二醇裂解的糖醛酸残 基(UG)。
6.一种多糖制剂，该多糖制剂具有以下特征(a)在3，500Da与7，OOODa之间的重均链分子量；(b)抗Xa活性以及抗Ila活性，各自小于50IU/mg；并且(c)多条多糖链，这些多糖链具有每条多糖链平均在0.2个与3个之间的乙二醇裂解的 糖醛酸残基(仏)。
7.如权利要求6所述的制剂，该制剂具有每条多糖链平均不超过1个乙二醇裂解的糖醛酸残基(UG)。
8.一种组合物，该组合物包括具有以下特征的一种多糖制剂(a)在3，500Da与7，OOODa之间的重均链分子量；(b)抗Xa活性以及抗Ila活性，各自小于50IU/mg；并且(c)多条多糖链，这些多糖链具有超过40%的U2SHNS,6S二糖残基。
9.如权利要求8所述的组合物，具有超过70%的U2SHNS,6S二糖残基。
10.如权利要求8所述的组合物，具有一种小于40%的脱硫酸作用的程度。
11.如权利要求8所述的组合物，具有一种小于30%的脱硫酸作用的程度。
12.如权利要求8所述的组合物，具有一种小于10%的脱硫酸作用的程度。
13.—种组合物，该组合物包括一种缺少实质性抗凝血剂活性的多糖制剂，其中该制剂 基本上由多个多糖组成，这些多糖包括式I [Uw_Hx， y，z] m [Ug_Hx， y，z] n其中U表示一个糖醛酸残基，而H表示一个己糖胺残基； 其中m和n是整数，以使 m = 4至16，并且 n = 1 至4 ； w = -20S 或-20H ； x = -NS 或-NAc ； y = -30S 或-30H ；60S 或-60H ； 其中符号 表示m和n标记的单元是沿着该多糖链分布的并且并非必须按照顺序，其 中《、x、y、 以及z在每个m标记的单元上各自是相同或不同的，并且其中x、y、以及z在每 个n标记的单元上各自是相同的或不同的。
14. 一种组合物，该组合物包括具有在3，500Da与7，OOODa之间的重均链分子量以及降 低的抗凝血剂活性的一种多糖制剂，其中该制剂包括多个多糖，这些多糖包括式I [Uw_HS7 y，z] m [Ug_Hs y，z] n其中U表示一个糖醛酸残基，而H表示一个己糖胺残基； 其中m和n是整数，以使 m = 4至16，并且 n = 1 至4 ； w = -20S 或-20H ； x = -NS 或-NAc ； y = -30S 或-30H ； z = -60S 或-60H ； 其中符号 表示m和n标记的单元是沿着该多糖链分布的并且并非必须按照顺序，其 中《、x、y、以及z在每个m标记的单元上各自是相同或不同的，并且其中x、y、以及z在每 个n标记的单元上各自是相同的或不同的。
15.具有多个多糖以及它们的药学上可接受的盐的一种制剂，该组合物缺乏实质性抗 凝血剂活性、具有抗转移活性并且基本上由多个多糖组成，这些多糖包括式II [Uw_HS7 y，Z] m_ [UG_Hs y，Z] n_ [UW~HS7 y，^ ^^ ^^ ^ ^其中U表示一个糖醛酸残基，并且H表示一个己糖胺残基； 其中！！！至！"是整数，以使 m = 0 至 10 ； n = 0 至 3 ；o = 0 至 10 ； P = 0至3 ； q = 0 至 10 ； w = -20S 或-20H ； x = -NS 或-NAc ； y = -30S 或-30H ； z = -60S 或-60H ； 其中w、x、y、以及z在每个m、n、0、p、或q标记的单元上各自是相同的或不同的。
16.如权利要求15所述的制剂，其中n+p之和小于或等于3.
17.如权利要求15所述的制剂，其中该制剂具有在3，500Da与7，OOODa之间的重均链分子量。
18.如以上权利要求中任一项所述的组合物或制剂，其中在该组合物中的一条多糖链 的非还原端糖醛酸具有一个4，5-不饱和结构。
19.如权利要求18所述的组合物或制剂，其中在该组合物中大约30%的非还原糖醛酸 具有一个4，5-不饱和结构。
20.如权利要求18所述的组合物或制剂，其中该4，5-不饱和结构是一种肝素酶消化或 苄基酯化作用之后跟随消除的结果。
21.如权利要求1至17中任一项所述的组合物或制剂，其中该还原端进一步包括一个 2，5-脱水甘露醇残基。
22.如权利要求21所述的组合物或制剂，其中大约50%的还原端包括一个2，5-脱水 甘露醇残基。
23.如权利要求1至22中任一项所述的组合物或制剂，其中该组合物是一种药物组合物。
24.如以上权利要求中任一项所述的组合物或制剂，其中该制剂的10%至50%的低聚 糖具有小于3000Da的分子量；40%至65%的低聚糖具有在3000Da与8000Da之间的分子 量，并且5%至30%的低聚糖具有大于8000Da的分子量。
25.如以上权利要求中任一项所述的组合物或制剂，其中通过一种方法来产生该多糖， 该方法包括将UH1解聚以产生一种解聚的肝素；并且 解聚之后，在该解聚的肝素上进行一个乙二醇裂解反应。
26.如权利要求25所述的组合物或制剂，其中乙二醇裂解步骤包括 用高碘酸盐氧化该解聚的肝素；并且用硼氢化钠还原该氧化的解聚的肝素。
27.一种治疗受试者体内的以下疾病的方法转移性疾病、VEGF-、FGF-、SDF-I α -和/或选择素介导的疾病；炎性疾病、一种传染性疾病、一种自身免疫性疾病、纤维化、或与涉及 血管新生的一种疾病，包括给予该受试者如权利要求1至42中任一项所述的一种组合物或 制剂。
28.如权利要求27所述的方法，其中长期给予该组合物或制剂。
29.如权利要求27所述的方法，其中该疾病是一种癌症。
30.如权利要求29所述的方法，其中该癌症是乳癌、结肠癌、或前列腺癌。
31.如权利要求29所述的方法，其中该组合物或制剂与手术、放射疗法、一种化疗剂、 一种抗体或一种酪氨酸激酶抑制剂进行联合给予。
32.如权利要求29所述的方法，其中以5至50mg/kg的剂量将该组合物或制剂给予该 受试者。
33.制备一种制剂的一种方法，该方法包括(1)用亚硝酸(HONO)将未分级肝素(UFH)解聚来得到一种多糖制剂；(2)用高碘酸盐氧化该多糖制剂；(3)用硼氢化钠还原该氧化的多糖制剂；并且(4)分离该多糖制剂，以便由此制备一种LMWH组合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中该解聚步骤包括用大约0.02至0. 04M亚硝酸在大 约2至4的pH下在大约10°C至30°C的温度下处理UFH大约1至5小时。
35.如权利要求33所述的方法，其中该氧化步骤包括用大约0.05M至0. 2M高碘酸盐在 大约0°C至10°C的温度下处理该多糖制剂大约10至20小时。
36.如权利要求33所述的方法，其中该还原步骤包括用大约0.5%至2.0%(重量/体 积)硼氢化钠在大约6.0至7.0的pH下并且在大约0°C至10°C的温度下处理该氧化的多 糖制剂大约0.5至1.5小时。
全文摘要
本文提供缺少实质性抗凝血剂活性的多糖制剂。提供制备和使用这些制剂的方法。
文档编号C08B37/10GK101842392SQ200880113772
公开日2010年9月22日 申请日期2008年11月3日 优先权日2007年11月2日
发明者M·孙达拉姆, S·罗伊, T·K·基施莫托 申请人:动量制药公司