专利名称：一种交联聚合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及高分子聚合物技术领域，尤其涉及一种交联聚合物及其制备方法。
背景技术：
基因治疗是近年来新兴的一种治疗手段，通过将正常基因引入患者细胞内，纠正 致病基因的缺陷从而达到治疗遗传疾病或癌症的目的。在基因治疗中，最关键的问题是将 DNA转入靶细胞，然后进入细胞核，最终实现基因的转录与表达。目前，最常用的介导基因 传递的载体是病毒类载体，如腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体等，但是，病毒类载体制备过 程复杂，成本较高，而且存在引起免疫反应或基因突变的安全隐患，因此，制备方便、价格低 廉、无毒、无免疫反应的非病毒类载体成为研究热点之一。目前，现有技术公开了多种非病毒类载体，如脂质体复合物、阳离子聚合物等，其 中，阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)由于具有电荷集中、对基因药物的复合能力强等优点， 在体内和体外转染实验中得到了广泛的应用。但是，低分子量的PEI基因传递效率低，而高 分子量的PEI虽然基因传递效率高，但细胞毒性较大、不可降解。聚乙二醇(PEG)是无毒无免疫原性的水溶性大分子，具有优良的生物相容性，尤 其是分子量为4000以下的PEG能够被机体迅速排出。研究发现，将PEG引入基因载体体系 中，能够增强载体在体内循环的稳定性，延长循环时间。但是，PEG的反应官能团位于其分 子链段的两端，不易与其他分子发生反应。因此，本发明人考虑将小分子量的聚乙烯亚胺接枝在活化后的PEG上获得分子量 较大且可降解的聚合物，该聚合物作为基因载体时，基因传递效率较高，细胞毒性较低。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种交联聚合物及其制备方法， 本发明提供的交联聚合物用作基因传递载体时，基因传递效率较高，细胞毒性较低。本发明提供了一种交联聚合物，在其分子中至少具有式(I)结构的第一重复单元 和式(II)结构的第二重复单元
Q为烷基或芳香基；
R1为分子量为100 2000的聚乙烯亚胺； 所述交联聚合物的分子量为5000 100000。 优选的，所述Q为式1)-式4)结构中的任意一种 优选的，所述R1为分子量为200 1000的聚乙烯亚胺
与现有技术相比，本发明提供的交联聚合物至少具有式(I)结构的第一重复单元 和式(II)结构的第二重复单元，其中，第一重复单元为交联结构单元，第二重复单元为小 分子量的PEI接枝结构单元，这两个重复单元使得本发明提供的交联聚合物具有较大分子 量，从而提高了其基因传递效率。同时，该交联聚合物主要由低细胞毒性的小分子量PEI和 具有良好生物相容性的聚乙二醇组成，细胞毒性较低。此外，该交联聚合物具有氨酯结构， 易于降解。实验表明，本发明提供的交联聚合物作为基因载体用于体外转染时，其转染效率 比PEI25k高十倍甚至几十倍。本发明还提供了一种交联聚合物的制备方法，包括a)将聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇混合，在无水无氧条件下进行聚合反应，得 到第一中间产物；b)将所述第一中间产物与二异氰酸酯混合，加热至50°C 60°C反应，得到第二中 间产物，所述第一中间产物上的羟基与二异氰酸酯的摩尔比为1 1.1 4;c)将所述第二中间产物加入到聚乙烯亚胺溶液中，进行接枝反应，得到分子量为 5000 100000的交联聚合物，所述聚乙烯亚胺的分子量为100 2000。优选的，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的分子量为150 1000。优选的，所述二异氰酸酯为六次甲基二异氰酸酯、2，4-甲苯二异氰酸酯、2，6-甲 苯二异氰酸酯或4，4- 二苯基二异氰酸酯。优选的，所述步骤a)中，反应的温度为0°C 50°C。优选的，所述步骤a)中，反应的时间为1天 5天。优选的，所述步骤b)中，反应的时间为5h 48h。优选的，所述步骤C)具体为将所述第二中间产物加入聚乙烯亚胺溶液中，冰浴反应6h 15h后，升温至室温 继续反应20h 30h，得到分子量为5000 100000的交联聚合物。本发明首先使聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇发生聚合反应，生成线型聚合物； 再用与所述线型聚合物上的羟基摩尔比为1.1 4 1的二异氰酸酯进行交联和活化，得 到具有活化官能团的交联聚合物；所述具有活化官能团的交联聚合物上的官能团与小分子 量的PEI反应，得到至少具有式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元的 交联聚合物。通过控制各反应物的摩尔比和反应条件，可以得到不同分子量的交联聚合物， 从而满足不同的使用要求。
图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线图。
具体实施例方式本发明提供了一种交联聚合物，在其分子中至少具有式(I)结构的第一重复单元 和式(II)结构的第二重复单元
分子量。
意一种
(II)
其中，1 < η < 25 ；
Q为烷基或芳香基；
R1为分子量为100 2000的聚乙烯亚胺； 所述交联聚合物的分子量为5000 100000。
按照本发明，所述第一重复单元为交联结构单元，使所述交联聚合物具有较大的 在所述第一重复单元中，所述Q为烷基或芳香基，优选为式1) _式4)结构中的任 按照本发明，所述第二重复单元为接枝结构单元，其中，R1为分子量为100 2000 的聚乙烯亚胺，优选分子量为200 1000的聚乙烯亚胺。为了使所述交联聚合物作为基因载体时具有更高的基因传递效率，本发明提供的 交联聚合物的分子量为5000 100000，优选为5000 60000。本发明还提供了一种交联聚合物的制备方法，包括a)将聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇混合，在无水无氧条件下进行聚合反应，得 到第一中间产物；b)将所述第一中间产物与二异氰酸酯混合，加热至50°C 60°C反应，得到第二中 间产物，所述第一中间产物上的羟基与二异氰酸酯的摩尔比为1 1.1 4;c)将所述第二中间产物加入到聚乙烯亚胺溶液中，进行接枝反应，得到分子量为 5000 100000的交联聚合物，所述聚乙烯亚胺的分子量为100 2000。按照本发明，首先将聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇混合，在无水无氧条件下发 生聚合反应，得到第一中间产物，该第一中间产物为线型结构的氨酯类聚合物(L-PAE)，反
应式如下 其中，1 < η < 25，1 <m< 20。分子量在4000以下的聚乙二醇能够被机体迅 速排出而不产生任何毒副作用，因此，本发明使用的聚乙二醇双丙烯酸酯的分子量优选为 150 1000，更优选为200 800。按照本发明，所述聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇发生聚合反应的过程如下分别将聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇溶解于有机溶剂中；将得到的溶液混合，使之发生聚合反应。按照本发明，所述有机溶剂优选为氯仿、二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺；所述聚 合反应的反应温度优选为0°c 50°C，更优选为20°C 50°C ；所述聚合反应的反应时间优 选为1天 5天。聚合反应完成后，将得到的反应混合物冲入石油醚或乙醚中沉淀，将沉淀干燥后， 得到线型结构的第一中间产物(L-PAE)。 得到线型结构的第-下步骤
中间产物后，使用二异氰酸酯进行交联和活化，具体包括以
将第一中间产物和二异氰酸酯分别溶解于有机溶剂中；然后将得到的溶液混合，使第一中间产物上的羟基和二异氰酸酯的摩尔比为 1 1. 1 4 ；将混合后的溶液加热至50°C 60°C使第一中间产物和二异氰酸酯发生反应，得 到第二中间产物。二异氰酸酯的结构如式(IV)所示，含有两个异氰酸官能团，其中，部分二 异氰酸酯的两个异氰酸官能团均与第一中间产物的羟基发生反应，发挥交联剂的作用，得 到具有式(I)结构的第一重复单元；部分二异氰酸酯只有一个异氰酸官能团与第一中间产 物的羟基发生反应，得到具有式(III)结构的重复单元。由此，得到的第二中间产物为包括 式(I)结构的第一重复单元和式(III)结构的重复单元的交联聚合物，即第二中间产物为 网状结构的氨酯类聚合物(N-PAE)。 O = C = N-Q-N = C = O(IV)为了得到包含式(I)结构的第一重复单元和式(III)结构的重复单元的第二中间 产物，所述第一中间产物上的羟基和二异氰酸酯的摩尔比为1 1.1 4，优选为1 1.5 3 ；所述反应时间优选为5h 48h，更优选为IOh 30h，最优选为20h 25h。按照本发明，所述二异氰酸酯优选为六次甲基二异氰酸酯、2，4_甲苯二异氰酸酯、 2，6_甲苯二异氰酸酯或4，4_二苯基二异氰酸酯；所述有机溶剂优选为氯仿、二氯甲烷或N， N-二甲基甲酰胺。得到第二中间产物后，使第二中间产物与聚乙烯亚胺进行接枝反应，得到最终产 物，优选包括以下步骤冰浴条件下，将第二中间产物加入到聚乙烯亚胺溶液中，冰浴反应6h 15h后，升 温至室温继续反应20h 30h，得到反应混合液；将所述反应混合液在乙醚中沉降，将沉降固体溶解后超滤，冷冻干燥后，得到分子 量为5000 100000的交联聚合物。在进行接枝反应时，首先在冰浴条件下反应，目的是降低异氰酸基团与PEI上的 氨基的反应活性，使接枝反应有效进行而尽量避免PEI与第二中间产物发生交联；然后在 室温条件下反应，使第二中间产物上的异氰酸酯基活性基团全部发生反应，提高反应率和接枝率。在此过程中，聚乙烯亚胺与第二中间产物中式(III)结构的重复单元发生接枝反 应，得到式(II)结构的第二重复单元；而式(I)结构的第一重复单元不发生变化，由此，得 到至少包含式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元的交联聚合物，该交 联聚合物为网状结构的聚氨酯接枝聚乙烯亚胺的共聚物(N-PAE-g-PEI)。为了得到低细胞毒性的交联聚合物，所述聚乙烯亚胺的分子量为100 2000，优 选为200 1000。本发明对所述聚乙烯亚胺的结构没有特殊限制，可以为线型结构的聚乙 烯亚胺，也可以为支化结构的聚乙烯亚胺。本发明提供的交联聚合物用作基因载体时，基因传递效率较高，细胞毒性较低，且 可降解，实验表明，将其用于体外转染的基因载体时，转染效率是PEI25k和商业化转染试 剂LipOfectamineTM2000的十倍甚至几十倍，同时表现出较低的细胞毒性。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的交联聚合物及其制备方 法进行详细描述。实施例1在无水无氧条件下，分别将0.61g氨基乙醇和分子量为258的聚乙二醇双丙烯酸 酯(PEGDA)溶解于无水二氯甲烷中，其中PEGDA与氨基乙醇的摩尔比为1 1，得到氨基乙 醇二氯甲烷溶液和PEGDA 二氯甲烷溶液，将所述两种溶液混合，50°C反应1天后，在IOOOmL 乙醚中沉降，将固体干燥后得到淡黄色产物，所述淡黄色产物为线型结构的聚氨酯L-PAE1， 用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的L-PAE及其 分子量。实施例2使用与实施例1相同的原料和步骤进行操作，但是反应时间为3天，得到淡黄色产 物L-PAE2，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的 L-PAE及其分子量。实施例3使用与实施例1相同的原料和步骤进行操作，但是反应时间为5天，得到淡黄色产 物L-PAE3，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的 L-PAE及其分子量。实施例4使用与实施例1相同的条件和步骤进行操作，但是原料为分子量为600的聚乙二 醇双丙烯酸酯(PEGDA)，得到淡黄色产物L-PAE4，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果 参见表1，表1为本发明实施例制备的L-PAE及其分子量。实施例5使用与实施例4相同的原料和步骤进行操作，但是反应时间为3天，得到淡黄色产 物L-PAE5，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的 L-PAE及其分子量。实施例6使用与实施例4相同的原料和步骤进行操作，但是反应时间为5天，得到淡黄色产 物L-PAE6，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的 实施例7取六次甲基二异氰酸酯和0. 5g实施例1制备的L-PAEl分别溶解于干燥的氯 仿中，得到L-PAEl氯仿溶液和六次甲基二异氰酸酯氯仿溶液，其中，L-PAEl中的羟基与 六次甲基二异氰酸酯的摩尔比为1 2;将所述两种溶液混合，控制溶液中反应物总浓度 为0. 05g/mL，50°C反应24h，反应完成后恢复到室温，直接封存，得到网状结构的聚氨酯 N-PAEl，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE 及其分子量。实施例8使用与实施例7相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0. Ig/ mL，得到N-PAE2，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备 的N-PAE及其分子量。实施例9使用与实施例7相同的条件和步骤进行操作，但是原料为甲苯二异氰酸酯，得到 N-PAE3，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE 及其分子量。实施例10使用与实施例9相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0. Ig/ mL，得到N-PAE4，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备 的N-PAE及其分子量。实施例11使用与实施例7相同的条件和步骤进行操作，但是原料为4，4' - 二苯基二异氰酸酯，得到N-PAE5，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。实施例12使用与实施例11相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0. Ig/ mL，得到N-PAE6，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备 的N-PAE及其分子量。
实施例13使用与实施例7相同的条件和步骤进行操作，但是原料为实施例4制备的L-PAE4， 得到N-PAE7，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的 N-PAE及其分子量。实施例14使用与实施例13相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0. Ig/ mL，得到N-PAE8，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备 的N-PAE及其分子量。实施例15使用与实施例9相同的条件和步骤进行操作，但是原料为实施例4制备的L-PAE4， 得到N-PAE9，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的 N-PAE及其分子量。实施例16使用与实施例15相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0. Ig/ mL，得到N-PAE10，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制 备的N-PAE及其分子量。实施例17使用与实施例11相同的条件和步骤进行操作，但是原料为实施例4制备的 L-PAE4，得到N-PAE11，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施 例制备的N-PAE及其分子量。实施例18使用与实施例17相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0. Ig/ mL，得到N-PAE12，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制 备的N-PAE及其分子量。表2本发明实施例制备的N-PAE及其分子量 实施例19无水无氧条件下，分别将实施例7制备的N-PAEl和分子量为423的线型聚乙烯亚 胺(线型PEI423)溶解于无水氯仿中，无水、无氧、冰浴条件下，将N-PAEl氯仿溶液滴加到 线型PEI423氯仿溶液中，冰浴反应IOh后室温反应24h。反应结束后，将反应液用IOOOmL 乙醚沉降，将固体物质溶解于水中后，用截留分子量为3500的超滤管超滤，然后冻干，得到 交联聚合物，即网状结构的聚氨酯接枝聚乙烯亚胺的共聚物N-PAE-g-PEIl，用凝胶渗透色 谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。实施例20使用与实施例19相同的条件和步骤进行反应，但是原料为分子量为600的支化聚 乙烯亚胺(支化PEI600)，得到N-PAE-g-PEI2，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见 表3，表3为本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。实施例21使用与实施例19相同的条件和步骤进行反应，但是原料为实施例8制备的 N-PAE2，得到N-PAE-g-PEI3，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明 实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。实施例22使用与实施例21相同的条件和步骤进行反应，但是原料为支化PEI600，得到 N-PAE-g-PEI4，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的 N-PAE-g-PEI及其分子量。实施例23使用与实施例19相同的条件和步骤进行反应，但是原料为实施例13制备的 N-PAE7，得到N-PAE-g-PEI5，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明 实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。实施例24使用与实施例23相同的条件和步骤进行反应，但是原料为支化PEI600，得到 N-PAE-g-PEI6，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的 N-PAE-g-PEI及其分子量。实施例25使用与实施例19相同的条件和步骤进行反应，但是原料为实施例14制备的 N-PAE8，得到N-PAE-g-PEI7，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明 实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。
实施例26使用与实施例25相同的条件和步骤进行反应，但是原料为支化PEI600，得到 N-PAE-g-PEI8，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的 N-PAE-g-PEI及其分子量。表3本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。 实施例27本发明实施例19制备的N-PAE-g-PEI 1介导的荧光酶质粒对人宫颈癌细胞(HeLa 细胞)的体外转染实验27. IHeLa细胞的培养取HeLa细胞置于含体积百分数为10%的胎牛血清的培养基中，在37°C、含体积百 分数为5%的二氧化碳的孵育箱中连续培养。27. 2体外转染转染前24h内，取对数生长期的HeLa细胞，将其用胰酶消化后置于达尔伯克改良 伊格尔培养基中稀释，然后按每孔ι χ IO4个细胞的密度将HeLa细胞接种于96孔培养板 中，置于37°C、含体积百分数为5%的二氧化碳的孵育箱中继续培养至汇合度达到80% 90% ；转染时，吸弃培养板中的培养基，更换为200 μ L含体积百分数为10%的胎牛血清 的达尔伯克改良伊格尔培养基，然后向培养基中加入复合物颗粒，继续培养48h，所述复合 物颗粒由本发明实施例19制备的N-PAE-g-PEIl与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为15的 比例混合形成；转染完毕后，取出培养板，吸去培养基，用磷酸盐缓冲溶液洗涤2次，加入细胞裂 解液使细胞裂解，然后加入荧光素酶底物，用光度计测定转染效率，以每毫克蛋白的发光单 元数(TLU/mg Protein)表示，结果见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载 体材料的转染效率结果。实施例28采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒 是由本发明实施例20制备的N-PAE-g-PEI2与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为10的比例混合形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的 转染效率结果。实施例29采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒 是由本发明实施例21制备的N-PAE-g-PEI3与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为15的比例 混合形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的 转染效率结果。实施例30采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒 是由本发明实施例22制备的N-PAE-g-PEI4与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为10的比例 混合形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的 转染效率结果。实施例31采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒 是由本发明实施例26制备的N-PAE-g-PEI8与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为10的比例 混合形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的 转染效率结果。实施例32实施例19制备的N-PAE-g-PEIl的细胞毒性测试取HeLa细胞置于含体积百分数为10%的胎牛血清的培养基中，在37°C、含体积百 分数为5%的二氧化碳的孵育箱中连续培养。测试前24h内，取对数生长期的HeLa细胞，将其用胰酶消化后置于达尔伯克改良 伊格尔培养基中稀释，然后按每孔ι χ IO4个细胞的密度将HeLa细胞接种于96孔培养板 中，置于37°C、含体积百分数为5%的二氧化碳的孵育箱中继续培养至汇合度达到80% 90% ；将培养基分为8组，第一组中不加任何试剂继续培养24h，其他7组中分别向培养 基中加入 10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL 禾口 70mg/mL 实施例 19 制 备的N-PAE-g-PEIl溶液与细胞共同培养24h ；向每组培养基中加入20 μ L含质量百分数为0. 5%的噻唑蓝的磷酸盐缓冲溶液， 37°C继续培养4h后吸除培养基，加入200 μ L 二甲基亚砜溶解噻唑蓝甲臜结晶IOmin后，用 酶标仪测定培养板各孔的吸收，重复测定三次，取平均值，并计算细胞存活率，测试结果见 图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线图，其中， 曲线a是本发明实施例19制备的N-PAE-g-PEIl的浓度与细胞存活率曲线。其中，测试波 长选用492nm，细胞存活率按照下列公式计算细胞存活率(％) = (A样品/Afie)*100%其中，A#s是N-PAE-g-PEIl溶液与细胞共同培养的细胞样品孔的吸收；Ase是未添加试剂的细胞空白孔的吸收。实施例33按照实施例32的条件和步骤对实施例20制备的N-PAE-g_PEI2进行细胞毒性测试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线 图，其中，曲线b是本发明实施例20制备的N-PAE-g-PEI2的浓度与细胞存活率曲线。实施例34按照实施例32的条件和步骤对实施例21制备的N-PAE-g_PEI3进行细胞毒性测 试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线 图，其中，曲线C是本发明实施例21制备的N-PAE-g-PEI3的浓度与细胞存活率曲线。实施例35按照实施例32的条件和步骤对实施例22制备的N_PAE-g_PEI4进行细胞毒性测 试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线 图，其中，曲线d是本发明实施例22制备的N-PAE-g-PEI4的浓度与细胞存活率曲线。实施例36按照实施例32的条件和步骤对实施例26制备的N_PAE-g_PEI8进行细胞毒性测 试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线 图，其中，曲线e是本发明实施例26制备的N-PAE-g-PEI8的浓度与细胞存活率曲线。比较例1采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒 是由分子量为25kDa的PEI (PEI25kDa)与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为10的比例混合 形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的转染 效率结果。比较例2采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒 是由商业化转染试剂LipOfectamineTM2000与荧光素酶质粒(pGL3)混合形成，其转染效率 参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的转染效率结果。表4本发明实施例提供的不同基因载体材料的转染效率结果 由表4可知，本发明实施例提供的交联聚合物N-PAE-g-PEI作为基因载体进行体 外转染时，转染效率高于PEI作为载体和商业化转染试剂LipOfectamineTM2000的转染效率。比较例3按照实施例32的条件和步骤对分子量为25kDa的PEI (PEI25kDa)进行细胞毒性 测试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲 线图，其中，曲线f是分子量为25kDa的PEI(PEI25kDa)的浓度与细胞存活率曲线。比较例4按照实施例32的条件和步骤对商业化转染试剂LipOfeCtamineTM2000进行细胞毒 性测试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的 曲线图，其中，曲线g是商业化转染试剂LipofectamineTM2000的浓度与细胞存活率曲线。由图1可知，本发明实施例提供的交联聚合物的细胞毒性远远低于PEI25kDa和商 业化转染试剂 Lipofectamine 2000。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行 若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
权利要求
一种交联聚合物，在其分子中至少具有式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元其中，1＜n＜25；Q为烷基或芳香基；R1为分子量为100～2000的聚乙烯亚胺；所述交联聚合物的分子量为5000～100000。FSA00000178550200011.tif
2.根据权利要求1所述的交联聚合物，其特征在于，所述Q为式1)-式4)结构中的任 意一种
3.根据权利要求1所述的交联聚合物，其特征在于，所述R1为分子量为200 1000的 聚乙烯亚胺。
4.一种交联聚合物的制备方法，包括a)将聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇混合，在无水无氧条件下进行聚合反应，得到第 一中间产物；b)将所述第一中间产物与二异氰酸酯混合，加热至50°C 60°C反应，得到第二中间产 物，所述第一中间产物上的羟基与二异氰酸酯的摩尔比为1 :1. 1 4 ；c)将所述第二中间产物加入到聚乙烯亚胺溶液中，进行接枝反应，得到分子量为 5000 100000的交联聚合物，所述聚乙烯亚胺的分子量为100 2000。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的分子量 为 150 1000。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述二异氰酸酯为六次甲基二异氰 酸酯、2，4-甲苯二异氰酸酯、2，6-甲苯二异氰酸酯或4，4-二苯基二异氰酸酯。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，反应的温度为0°C 50 "C。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，反应的时间为1天 5天。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中，反应的时间为5h 48h。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c)具体为将所述第二中间产物加入聚乙烯亚胺溶液中，冰浴反应6h 15h后，升温至室温继续 反应20h 30h，得到分子量为5000 100000的交联聚合物。
全文摘要
本发明提供了一种交联聚合物，在其分子中至少具有式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元，其中，1＜n＜25；Q为烷基或芳香基；R1为分子量为100～2000的聚乙烯亚胺；所述交联聚合物的分子量为5000～100000。本发明还提供了一种交联聚合物的制备方法。与现有技术相比，本发明提供的交联聚合物中的两个重复单元使得本发明提供的交联聚合物具有较大分子量，从而提高了其基因传递效率。同时，该两个重复单元均具有较低的细胞毒性，因此，所述交联聚合物细胞毒性较低。实验表明，本发明提供的交联聚合物作为基因载体用于体外转染时，其转染效率比PEI25k高十倍甚至几十倍。
文档编号C08G73/04GK101880397SQ20101021566
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月2日 优先权日2010年7月2日
发明者夏加亮, 李非凡, 林琳, 田华雨, 郭兆培, 陈学思, 陈杰, 陈磊 申请人:中国科学院长春应用化学研究所