合成蛋白质的方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于由肽片段组装蛋白质的方法。所述方法使蛋白质的制备方式简单可靠，并且可在工业规模上应用。这种方法可以制备具有治疗或诊断价值的蛋白质。本发明还涉及用于实施所述合成蛋白质方法的试剂盒以及用于检测和/或诊断的试剂盒。
【专利说明】合成蛋白质的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及由肽片段组装蛋白质的新型方法。该方法可以实现通过简单可靠、自动化和适用于工业规模的方法来制备蛋白质。该方法可用来制备治疗或诊断目的的蛋白质。本发明也涉及用于实施该合成方法的试剂盒和自动化装置以及检测和/或诊断试剂盒。
【背景技术】
[0002]当合成的多肽较大时，采用在固相中逐个连接氨基酸的传统方法的多肽合成会受低产率的限制。通过化学连接反应将两个多肽组装成更长多肽是已知的可以克服该限制的方法。
[0003]多肽的全合成对于制备具有明确结构或者带有天然修饰(例如翻译后修饰)或非天然修饰的蛋白质越来越有用。该化学连接反应方法可满足这种要求，但是其被证明在使用和工业应用方面存在局限性。
[0004]通常地，在这些方法中，期望通过连接反应组装成的多肽之间的键是天然的，也就是说与多肽的天然结构一致。
[0005]目前关于天然连接的主要方法是例如由Kent和Dawson提出的国际申请W096/34878和W098/28434中描述的方法。该方法基于(C-端)硫酯肽和半胱氨酰基-肽之间的化学选择性反应。然而，该方法的主要缺点是制备硫酯肽时需要复杂的化学方法。这些方法无法阻止不同的硫酯反应之间的竞争，这不可避免地生成难以分离的混合物，因此影响所得终产物的纯度，并且不可避免地损失产率。
[0006]一种替代方法是所谓的Staudinger连接，其描述于国际申请WOO1/68565和W001/87920中。这包括膦基硫酯与叠氮化物反应并水解该复合反应物以形成酰胺键。但是，该方法难以应用于工业规模。
[0007]在国际申请W02007/037812中描述的另一种方法是基于α -酮酸与N-烷氧基胺的脱羧缩合反应。但是，酮酸是难以制备且难以引入肽中的分子。因此，该第三种方法也难以适用于不具备进行复杂有机合成的设备的肽合成实验室。
[0008]0.Melnyk 等人在 Org.Lett.，U(22)，5238-41 (2010)和专利申请FR-2952058 中公开的工作以及 Hou, W.，Zhang, X.，Li, F.和 Liu, C.F.P印tidylN, N-Bis(2-mercaptoethyl)-amides as Thioester Precursors for Native ChemicalLigation.0rg.Lett.13，386-389(2011)中公开的工作描述了借助肽-二(硫乙基)胺基片段的肽天然连接反应。然而，迄今为止这种方法仍没有用于3个或更多个片段组装合成多肽。
[0009]申请W02011/058188描述了提纯方法，包括在固相肽合成结束时在N-末端连接叠氮官能团。若使用Staudinger-Bertozzi反应或环加成反应(CuAAC, SPAAC)可能会将目标肽接枝到预先由膦或炔功能化的与水相容的树脂上。在洗涤树脂以除去未能共价连接到树脂上的被截断的肽之后，最终在温和条件(碱、亲核、或光照)下将该键断裂解离出肽。然而，在这篇文献中，并未想到使用接枝方法以实行通过连续的肽连接反应来合成蛋白质。
[0010]M.Villain 等人的 Chemistry and Biology8 (2001) 673-679 的文献描述了提纯方法，包含在肽合成结束时通过N-末端残基与醛官能团反应将N-末端含有半胱氨酸或苏氨酸的肽接枝于树脂上的步骤，从而形成噻唑烷或噁唑烷环。然后洗涤该接枝的肽并将其从树脂上分解出来。然而，在这篇文献中，并没有想到使用接枝方法以实行通过连续的肽连接反应来合成蛋白质。
[0011]文献US7884182 和文献“Synthesis of Peptide-PNA-Peptide Conjugates bySem1-Solid-Phase Chemical Ligation Combined with Deactivation/Capture of ExcessReactants,Martijn C.de Koning.Eur.J.0rg.Chem.2004, 850-857”描述了利用固体载体的肽连接反应。作者通过噻唑烷键的形成将H-Cys-A-SR肽(R=烷基)连接到该载体上，然后实施载体上硫酯官能团和H-Cys-B肽之间的天然的连接反应NCL。所述H-Cys-A-SR肽很难合成。在噻唑烷形成期间，由于反应性的两端，该方法具有很高的发生聚合反应或环化反应的几率。最终，该方法无法在载体上实施超过一个的连接反应。
[0012]文献FR2952058描述了在液相中C-末端到N-末端方向上的肽连接反应方法。该方法包括:
[0013]-利用SEA肽，-任选地利用SEAofT肽，然后将其转变为SEA。
[0014]文献US2002/0132975描述了在固相中通过肽片段的连续天然连接反应组装肽的方法。该合成方法可以从N-末端到C-末端或在相反方向上实施。该方法基于:
[0015]-利用含有N-末端半胱氨酸和C-末端COS-基团的肽，
[0016]-在树脂负载的肽的C-末端将-COS-官能团转化为-COSR硫酯基，
[0017]-利用树脂负载的肽的C-末端硫酯官能团来实施在邻近肽片段的末端半胱氨酸上的各个连接反应。
[0018]然而，硫代酸肽(即，带有COS-官能团)，例如专利申请US2002/0132975中描述的起始产品，很难通过合成制备、很难纯化并且该物质不稳定。此外，特别是当肽序列中存在游离的半胱氨酸时，由于还存在半胱氨酸烷基化反应的风险，很难进行硫代酸官能团到硫酯的活化步骤。最终，与SEAoff基团相反，硫代酸基团是未被阻断的反应性基团。对此，Canne，L.E.等人的J.Am.Chem.Soc.1999，121,8720-8727的工作中也有特别的阐明，其中作者发现由硫代酸基团残基反应性导致显著生成环状副产物。
[0019]相对于现有技术的方法，本发明的方法具有更高的SEAoff官能团到硫酯的转化效率，反应条件更温和并且不会导致生成副产物。此外，与其他反应性基团(具体是专利申请US2002/0132975中描述的硫代酸)相反，SEAoff是一种在连接反应条件下被阻断的体系。最终，SEAoff片段易于在固相中通过Fmoc/叔丁基策略合成，这不同于硫代酸肽的情况。
[0020]为了可能实现在工业规模上通过全合成来合成肽，需要改进方法，这就要求寻找简单、廉价、能生产高纯 度的优质产品并且符合工业卫生的方法。
[0021]基于上述理由，有必要寻找收敛性的并且能工业应用的全合成方法，以可能合成所需长度和性质的肽链；具体而言，涉及从N-末端到C-末端组装的方法，其具有实施简单并且获得的肽或多肽纯度高的特点。事实上，与更传统的从C-末端到N-末端的相反组装策略相比，从N-末端到C-末端的组装具有很大的优势，因为这种方法允许通过除去乙酰化的N-截断肽实现肽片段的“自净化”，所述乙酰化的N-截断肽是固相肽合成(SPPS)中的主要杂质。
[0022]本发明使得克服溶液中涉及多重连接反应的困难。本发明使得合成很大的蛋白成为可能。本发明也很容易自动化并且可推广到工业规模。
【发明内容】
[0023]发现，即成为本发明的主题，在固相合成方法中包含简单方法(例如肽-硫酯生成和天然的连接反应)的多个肽片段的组装能够得到收敛性全合成方法，该全合成方法能够自动化、能够应用于工业上而且满足纯度要求标准。
[0024]为了该目的，本发明提议了用于制备包含η个肽片段和至少η-1个带有硫醇官能团的氨基酸的多肽的肽片段组装方法，所述多肽由下式表示:
[0025]ArC1-A2-C2-A3——Ci^1-A1-....-Cn_「An (I)
[0026]其中…八/..、An是肽片段，
[0027]C1、C2、Cf Ch…Clri是带有硫醇官能团的氣基酸残基，
[0028]η为3-50，优选3-20，或者更优选3-10，和
[0029]i是2至η的任意整数。
[0030]该方法包括:
[0031](al)至少一步涉及制备Y-A1-SEAoff(II1),其中A1表示其C-末端带有被称为SEAoff的环-二(硫乙基)胺基
【权利要求】
1.肽片段组装方法，其用于制备包含η个肽片段和至少η-1个带有硫醇官能团的氨基酸的多肽，所述多肽以下式表示:
A1-C1-A2-C2-A3——CH-A1-....-Cn_「An (I) 其中 A1、A2、A3、-“Ai...、An 是肽片段， Cp C2、(V..Cp1…Clri是带有硫醇官能团的氨基酸残基， η为3-50，和 i为2至η的任何整数，所述方法包括: (al)至少一步涉及制备Y-A1-SEAoff(II1)片段，其中A1表示其C-末端带有被称为SEAoff的环-二(硫乙基)胺基
2.根据权利要求1的方法,进一步包含: (e)将肽A1-C1-A2-" C^1A1-" ClriAn(I)从固体载体上分离的步骤。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述固体载体□选自树脂，特别是选自基于聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、胶乳、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、合成或天然亲水聚合物、玻璃珠、硅胶的树脂。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中Cp...(V..Cn是半胱氨酸
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中PG^...PG^-PGn是叔丁基亚磺酰基。
6.根据权利要求1-5任一项的方法,其中: Y’包含选自叠氮的官能团，以及Y选自包含炔官能团的基团，或者 Y’包含炔官能团，以及Y选自包含叠氮官能团的基团，或者 Y’包含醛官能团，以及Y是氢，A1的N-末端氨基酸选自半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸，或者 Y’包含醛官能团，以及Y包含能够形成希夫碱的NH2基团。
7.根据权利要求1-6任一项的方法,其中R选自任选取代的包含1-12个碳原子的直链或支链烷基，或者任选取代的C6-C12芳基。
8.根据权利要求1-7任一项的方法,其中对于每个i= 2、…n-2,所述方法包含 (ci)至少一步涉及在硫醇R-SH的作用下，任选地在还原试剂环二硫化物存在下，将□-Z-A1-C1--C^1AiSEAoff(IIIi)转化为口 -Z-A1-C1--CH-A1-SR(Iiri), (di)至少一步涉及将 Ci (PGi)AwSEAoff 与口 -Z-A1-C1--C^1A1-SR(Iiri)缩合以生成□-Z-A1-C1-" CiAwSEAoff(IIIw),其中(PGi)表示H或氨基酸Ci的硫醇基团的保护基。
9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中，对于每个i= 2、…n-2，所述方法的di)步骤在PGi原位选择性离去而不影响SEAofT并且反应溶剂是包含芳族硫醇的、pH为4-9的缓冲水溶液的条件下进行。
10.制备药用产品的方法，至少包含: -通过权利要求1-9任一项的方法制备至少一种多肽，以及 -将其结合到药物可接受的载体上。
11.接枝有肽并对应于下式(III1)的固体载体:
□-Z-A1-SEAoff (III1) 其中A1表示其C-末端带有被称为SEAoff的环-二(硫乙基)胺基-O的肽片段，□表示固体载体，Z表示A1和□之间的连接基。
12.包含至少一种载体的多肽合成试剂盒，所述载体提供有至少一个接收区，在其上或在其内配置至少一种根据权利要求11所述的接枝的固体载体。
13.用于肽合成的自动化设备，包含至少一个储存库，其中配置接枝了肽并对应于下式(III1)的固体载体: □-Z-A1-SEAoff (III1) 各个独立的储存库，其包含:
-肽(IIi)Ci (PGi)AwSEAoff^P: -至少一种硫醇R-SH，和任选的还原剂环二硫化物 -偶联活化剂和 -洗涤产品， 用于取和分配产品样品的机械工具，以及允许控制应用这些机械工具的数据处理工具。
【文档编号】C08F8/34GK103998455SQ201280062427
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年10月16日 优先权日:2011年10月17日
【发明者】O.梅尔尼克, L.雷鲍特, V.奥卡格尼, A.德尔马斯 申请人:国家科学研究中心