亲水性聚合物颗粒及其制备方法

亲水性聚合物颗粒及其制备方法
【专利摘要】形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒。该方法还包括将聚合物颗粒转换为亲水性颗粒。
【专利说明】亲水性聚合物颗粒及其制备方法
[0001] 本专利申请要求于2012年2月9日提交的美国临时申请号61/597, 053的利益， 所述美国临时申请以引用的方式全文并入本文。
[0002] 本专利申请要求于2012年10月26日提交的美国临时申请号61/719, 045的利益， 所述美国临时申请以引用的方式全文并入本文。
[0003] 本专利申请要求于2〇12年11月30日提交的美国临时申请号61/731,87 3的利益， 所述美国临时申请以引用的方式全文并入本文。

【技术领域】
[0004] 总的来说，本公开内容涉及亲水性聚合物颗粒，并且涉及用于制备并使用此类亲 水性聚合物颗粒的方法。

【背景技术】
[0005] 聚合物颗粒越来越多地用作分离技术中的组分，并且帮助检测化学和生物系统两 者中的分析物。例如，聚合物颗粒已用于色谱技术中以从溶液中分离靶分子。在另一个例 子中，具有磁性涂层的聚合物颗粒用于磁性分离技术中。最近以来，聚合物颗粒已用于增强 ELISA型技术并且可用于捕获多核苷酸。
[0006] 然而，此类分离和分析技术己具有由于颗粒大小中的变异的缺点。颗粒大小中的 大变异导致颗粒重量中的变异，以及可用于与靶分析物相互作用的反应位点数目中的变 异。对于磁性分离技术，大小中的变异可导致低效率分离。对于色谱技术和多种多核苷酸 捕获技术，大小中的变异可导致可用于与多核苷酸相互作用的位点数目中的变异，导致捕 获或分离效率中的变异。
[0007]像这样，改善的聚合物颗粒和用于制造此类聚合物颗粒的方法将是期望的。


【发明内容】

[0008]在第一个方面，形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性 保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物 颗粒，并且将聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
[0009]在第二个方面，形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使具有疏水性 保护基团的丙烯酰胺单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合 物颗粒，并且将聚合物颗粒转换为亲水性颗粒。
[0010]在第三个方面，形成颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中，使可自由基聚 合单体的多个聚体单元与具有疏水性保护基团的二丙烯酰胺交联剂聚合，由此形成包括多 个疏水性保护基团的聚合物颗粒。该方法还包括去除至少一部分所述多个疏水性保护基 团。
[0011] 一在第四个方面，形成颗粒的方法包括使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个 聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护基团的聚合物颗粒；从聚合物颗粒中去除至 少一部分所述多个疏水性保护基团，形成亲水性颗粒；并且使寡核苷酸与亲水性颗粒结合。
[0012] 在第五个方面，多个颗粒包括至少100, 000个颗粒。多个颗粒中的至少一个颗粒 包括水凝胶。多个颗粒具有不超过100微米的平均粒度和不超过5%的变异系数。
[0013] 在第六个方面，系统包括孔阵列。孔阵列的至少一个孔与ISFET传感器可操作地 连接。该系统还包括具有不超过5%的变异系数的多个水凝胶颗粒。多个水凝胶颗粒中的 至少一个水凝胶颗粒设置在孔阵列的孔中。
[0014] 在第七个方面，多个颗粒通过包括下述的方法形成：在水性悬浮液内的分散相中， 使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括多个疏水性保护 基团的聚合物颗粒，并且包括将聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
[0015] 在第八个方面，组合物包括丙烯酰胺单体和交联剂的水性混合物，该丙烯酰胺单 体包括疏水性保护基团，单体和交联剂以在15:1至1:2范围内的单体：交联剂的质量比包 括。
[0016] 在第九个方面，测序多核苷酸的方法包括提供包括孔阵列的装置。至少一个孔与 ISFET可操作地连接，并且包括通过上述方面的方法形成的颗粒。该颗粒附着至多核苷酸。 该方法还包括将包括预定类型的核苷酸的溶液施加于装置，并且观测对施加溶液的离子应 答。
[0017] 在第十个方面，用于核苷酸掺入的方法包括提供通过上述方面的方法形成的颗 粒。该颗粒附着至包括与引物杂交的模板核酸的核酸双链体。该双链体与聚合酶结合。该 方法还包括使颗粒与一种或多种核苷酸接触，并且使用聚合酶将至少一种核苷酸掺入引物 的末端上。
[0018] 在第十一个方面，形成颗粒的方法包括促进种子颗粒在水性悬浮液中形成分散 相，在分散相中使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括 多个疏水性保护基团的聚合物颗粒，并且将聚合物颗粒转换为水凝胶颗粒。
[0019] 在第十二个方面，形成颗粒的方法包括提供在水性悬浮液中的种子颗粒，该种子 颗粒包含疏水性聚合物，并且包括促进种子颗粒在水性悬浮液中形成分散相。该方法还包 括在分散相中使具有疏水性保护基团的亲水性单体的多个聚体单元聚合，由此形成包括具 有多个疏水性保护基团的亲水性聚合物的聚合物颗粒。聚合物颗粒包括疏水性聚合物。该 方法还包括从亲水性聚合物中切割多个疏水性保护基团，并且从聚合物颗粒中提取疏水性 聚合物，形成水凝胶颗粒。
[0020] 在第十三个方面，颗粒包括由羟烷基丙烯酰胺和二丙烯酰胺聚合形成的聚合物。 二丙烯酰胺包括羟基。当暴露于水时，颗粒吸收基于聚合物重量至少300重量％的水。

【专利附图】

【附图说明】
[0021] 通过参考附图，本公开内容可得到更好理解，并且它的众多特征和优点对于本领 域技术人员变得显而易见。
[0022] 图1包括用于制造示例性聚合物颗粒的示例性流程的举例说明。
[0023] 图2包括利用聚合物颗粒的示例性测序方法的举例说明。
[0024]在不同附图中的相同参考符号的使用指示相似或相同项。

【具体实施方式】
[0025] 在示例性实施方式中，形成聚合物颗粒的方法包括在水性悬浮液内的分散相中， 使具有由疏水性保护基团保护的亲水性官能团的单体的多个聚体单元聚合。聚合形成包括 多个疏水性保护基团的聚合物颗粒。该方法还包括将聚合物颗粒转换为亲水性颗粒，例如 水凝胶颗粒。在一个例子中，单体包括亲水性可自由基聚合单体，例如亲水性基于乙烯基的 单体，特别是丙烯酰胺。单体是包括由疏水性保护基团保护的亲水性官能团的亲水性单体。 例如，疏水性保护基团可包括甲硅烷基官能团或其衍生物。聚合还可包括在交联剂的存在 下聚合，所述交联剂例如乙烯基交联剂，包括示例性二丙烯酰胺交联剂。交联剂可以是具有 疏水性保护基团的受保护的交联剂。在一个例子中，将聚合物颗粒转换为亲水性颗粒可包 括从聚合物颗粒中去除疏水性保护基团的至少一部分。特别地，疏水性保护基团可以是酸 可切割的保护基团，并且去除疏水性保护基团可包括从聚合物颗粒中酸切割疏水性保护基 团。
[0026] 通过此类方法制备的示例性聚合物颗粒可具有期望的大小或变异系数。特别地， 聚合物颗粒可以是亲水的。例如，聚合物颗粒可包括水凝胶颗粒。此外，聚合物颗粒可具有 不超过100 μ m，例如不超过30 μ m、不超过3 μ m、或不超过2 μ m的平均粒度。聚合物颗粒可 具有不超过15%，例如不超过5%的变异系数。
[0027] 特别地，此类颗粒可用于捕获靶分析物例如多核苷酸。在一个例子中，聚合物颗粒 可用于使用涉及光检测的测序方法或涉及离子检测的测序方法来测序多核苷酸。
[0028] 在特定实施方式中，分散相在水性悬浮液内形成。分散相优选是疏水的。在一个 例子中，分散相由于促进种子颗粒例如疏水性种子颗粒而形成，以获得分散相。促进有利于 种子颗粒中疏水性组分的吸收。
[0029] 具有可去除的疏水性保护基团的单体更喜欢分散相。单体在分散相内聚合。任选 地，交联剂与在分散相内的单体聚合。在其中分散相由种子颗粒例如疏水性种子颗粒形成 的一个例子中，可去除与种子颗粒结合的聚合物。例如，种子颗粒的聚合物可使用溶剂溶 解，并且可从聚合物颗粒中提取。
[0030] 疏水性保护基团可例如通过从聚合物颗粒中切割疏水性保护基团的至少一部分 而去除。因此，形成亲水性颗粒例如水凝胶颗粒。
[0031] 在一个例子中，可活化所得的亲水性颗粒，以有利于与靶分析物例如多核苷酸的 缀合。例如，切割疏水性保护基团可在亲水性颗粒上留下亲水性官能团，例如羟基、氨基、硫 醇基或其组合。在特定例子中，羟基可通过将羟基转换为磺酸酯基团或氯得到活化。磺酸 酯官能团或氯可使用亲核取代进行取代或替换。特别地，具有亲核末端基团例如胺或硫醇 基的寡核苷酸可通过磺酸酯基团或氯的亲核取代而附着至亲水性颗粒。此类颗粒可特别用 于捕获在测序技术中使用的多核苷酸。
[0032] 在另一个例子中，磺酸化颗粒还可与单官能或多官能单亲核试剂或多亲核试剂反 应，所述亲核试剂可形成与颗粒的附着，同时维持关于包含亲电基团例如马来酰亚胺的寡 核苷酸的亲核活性。另外，残留亲核活性可通过附着至包含多亲电基团的试剂而转换为亲 电活性，所述多亲电基团随后附着至包含亲核基团的寡核苷酸。
[0033] 其他缀合技术包括在颗粒合成过程中使用包含在羧酸上的疏水性保护基团的单 体。羧酸基团的脱保护使得可获得羧酸基团，所述羧酸基团还可与具有亲核基团例如胺的 寡核苷酸反应或促使寡核苷酸附着。
[0034] 其他缀合技术包括在颗粒合成过程中使用包含在胺上的疏水性保护基团的单体。 胺基的脱保护使得可获得亲核基团，所述亲核基团还可用胺反应性双官能双亲电试剂修 饰，所述修饰获得在附着至聚合物颗粒后的单官能亲电基团。此类亲电基团可与具有亲核 基团例如胺或硫醇的寡核苷酸反应，促使通过与空亲电体反应的寡核苷酸附着。
[0035] 如图1中所示，方法100包括提供种子颗粒102。将单体加入悬浮液中，并且优选 位于由促进的种子颗粒形成的分散相104中。使单体和任选的交联剂聚合，形成聚合物颗 粒108。聚合物颗粒108可剥去种子聚合物，形成聚合物颗粒110。去除聚合物颗粒11〇上 的疏水性保护基团，形成亲水性颗粒112。可活化亲水性颗粒112,形成缀合颗粒114。 [0036] 种子颗粒102可包括种子聚合物。在一个例子中，种子聚合物是疏水的。特别地， 种子聚合物可包括苯乙烯类聚合物、丙烯酸类聚合物、丙烯酰胺、另一种疏水的乙烯基聚合 物，或其任何组合。在一个例子中，种子颗粒102是单分散的，例如具有不超过20%的变异 系数。变异系数（CV)定义为标准偏差除以平均值乘以1〇〇,其中"平均值"是平均粒子直径， 并且标准偏差是粒度的标准偏差。作为另外一种选择，"平均值"可以是z-平均值或模式粒 径。依照通常实践，CV在主模式即主峰上进行计算，从而排除与聚集体相关的小峰。因此， 低于或高于模式大小的一些颗粒可在计算中不计算，所述计算可例如基于可检测颗粒的总 粒子数的约 9〇%。此类CV测定可在CPS圆盘式离心机上执行。特别地，种子颗粒102群 体可具有不超过10%，例如不超过5. 0%、不超过3. 5%、不超过3%、不超过2. 5%、不超过 2%、或甚至不超过1.0%的变异系数。此外，种子颗粒1〇2可具有不超过〇.6μπ!的初始粒 度。例如，初始粒度可以是不超过0· 45 μ m,例如不超过0· 35 μ m、或甚至不超过〇. 15 μ m。 作为另外一种选择，具有至少3 μ m，例如至少5 μ m、至少10 μ m、至少20 μ m、或至少50 μ m 的初始粒度的更大种子颗粒可用于形成更大的聚合物颗粒。在一个例子中，初始粒度可以 是不超过100 u m。
[0037]种子颗粒1〇2可在水性悬浮液内得到促进，形成促进的分散相104。特别地，促进 种子颗粒包括使溶剂和促进剂与种子颗粒一起在水性悬浮液内混合，形成分散相。促进的 种子颗粒更容易吸收疏水性组分。溶剂可以是与水混溶的。例如，溶剂可包括醛或酮，例如 甲醛、丙酮、甲基乙基酮、 二异丙基酮、二甲基甲酰胺或其组合；醚溶剂例如四氢呋喃、二甲 醚或其组合；酯溶剂；杂环溶剂例如吡啶、二噁烷、四氢糠醇、N-甲基-2-吡咯烷酮或其组 合；或其组合。在一个例子中，溶剂可包括酮例如丙酮。在另一个例子中，溶剂可包括醚溶 剂例如四氢呋喃。在另外的例子中，溶剂可包括杂环溶剂例如吡啶。
[0038]促进剂或促进试剂可以是疏水的，并且具有低水溶性例如在25Γ下不超过 0.01g/l的水溶性。例如，促进剂可包括二辛酰过氧化物、己二酸二辛酯、邻苯二甲酸正丁 酯、十二醇、分子量低于20kD的聚苯乙烯或其组合。在一个例子中，二辛酰过氧化物还可表 现为聚合反应的引发剂。促进剂还可以是低分子量聚苯乙烯，其例如使用低单体/引发剂 比率在分开的聚合步骤中，或在种子聚合过程中添加链转移试剂而制备。促进剂一般在高 压匀化器中乳化。
[0039]水性悬浮液还可包括表面活性剂。表面活性剂可以是离子表面活性剂、两性表面 活性1剂、或非离子表面活性剂。离子表面活性剂可以是阴离子表面活性剂。在另一个例子 中，离子表面活性剂可以是阳离子表面活性剂。示例性阴离子表面活性剂包括硫酸盐表面 活性剂、磺酸盐表面活性剂、磷酸盐表面活性剂、羧酸盐表面活性剂或其任何组合。示例性 硫酸盐表面活性剂包括烷基硫酸盐，例如月桂基硫酸铵、月桂基硫酸钠（十二烷基硫酸钠， (SDS))，或其组合；烷基醚硫酸盐，例如月桂基聚醚硫酸钠、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠或其任何 组合；或其任何组合。示例性磺酸盐表面活性剂包括烷基磺酸盐例如十二烷基磺酸钠；多 库酯钠例如磺基琥珀酸钠二辛酯；烷基苄基磺酸盐；或其任何组合。示例性磷酸盐表面活 性剂包括烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐或其任何组合。示例性羧酸表面活性剂包括烷 基羧酸盐，例如脂肪酸盐或硬脂酸钠；月桂酰肌氨酸钠；胆汁酸盐例如脱氧胆酸钠；或其任 何组合。
[0040] 示例性阳离子表面活性剂包括伯胺、仲胺或叔胺，季铵表面活性剂或其任何组合。 示例性季铵表面活性剂包括烷基三甲铵盐例如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)或十六烷基 三甲基氯化铵（CTAC);西吡氯铵（CPC);聚乙氧基化牛油胺（Ρ0ΕΑ);苯扎氯铵（BAC);苄索 氯铵（BZT) ;5_溴-5-硝基-1，3-二噁烷；双十八烷基二甲基氯化铵；双十八烷基二甲基溴 化铵（D0DAB);或其任何组合。
[0041] 示例性两性表面活性剂包括具有磺酸盐、羧酸盐或磷酸盐阴离子的伯胺、仲胺或 叔胺，或季铵阳离子。示例性磺酸盐两性表面活性剂包括（3-[(3-胆酰胺丙基）二甲基氨 基]-1-丙磺酸盐）；磺基甜菜碱（sultaine)例如椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱；或其任何 组合。示例性羧酸两性表面活性剂包括氨基酸、亚氨酸、甜菜碱例如椰油酰胺丙基甜菜碱或 其任何组合。示例性磷酸盐两性表面活性剂包括卵磷脂。在进一步的例子中，表面活性剂 可以是非离子表面活性剂例如基于聚乙二醇的表面活性剂。
[0042]回到图1，加入悬浮液中的单体优选天然位于由促进的种子颗粒形成的分散相 104中。交联剂例如疏水性交联剂也可加入水性悬浮液中，并且可优先位于分散相中。在 一个例子中，交联剂具有不超过10g/l的水溶性。此外，致孔剂（porogen)可加入水性悬 浮液中，并且可优先位于分散相中。在进一步的例子中，分散相可包括丙烯酸亚磷醜胺 (acrydite)寡核苷酸，例如离子交换的丙烯酸亚磷酰胺寡核苷酸。如图1中所示，使单体和 任选的交联剂聚合以形成聚合物颗粒108。
[0043] 单体可以是可自由基聚合的单体例如基于乙烯基的单体。特别地，单体可包括与 疏水性保护基团偶联的亲水性单体。在一个例子中，亲水性单体可包括丙烯酰胺、乙酸乙烯 酯、甲基丙烯酸羟烷基酯或其任何组合。在特定例子中，亲水性单体是丙烯酰胺，例如包括 羟基、氨基、羧基或其组合的丙烯酰胺。在一个例子中，亲水性单体是氨基烷基丙烯酰胺、由 胺封端的聚丙二醇官能化的丙烯酰胺（下文所示的C)、丙烯酰基哌嗪（下文所示的D)，或 其组合。在另一个例子中，丙烯酰胺可以是羟烷基丙烯酰胺，例如羟乙基丙烯酰胺。特别地， 羟烷基丙烯酰胺可包括N-三（羟甲基）甲基）丙烯酰胺（下文所示的A)、N-(羟甲基）丙 烯酰胺（下文所示的B)，或其组合。在进一步的例子中，可使用单体的混合物，例如羟烷基 丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的混合物，或丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的混合物。 在一个例子中，胺官能化的丙烯酰胺可以在100:1至1:1的范围（例如100:1至2:1的范 围、50:1至 3:1的范围、50:1至5:1的范围、或甚至印：丨至⑴：丨的范围）内的羟烷基丙烯 酰胺：胺官能化的丙烯酰胺或丙烯酰：胺官能化的丙烯酰胺的比率包括。
[0044] Q ' H Q B 人一她 H v^\ r\ /T^ H
[0045] 在特定例子中，亲水性单体包括羟基或包括胺。疏水性保护基团例如通过与羟基 或胺基键合来屏蔽单体的亲水性。当与羟基键合时，此类保护基团在本文中被称为羟基保 护基团或氢氧基保护基团。特别地，疏水性保护基团可例如通过切割例如酸切割去除。疏 水性基团可选择为在酸性条件下切割，所述切割不导致潜在聚合物或其一部分的水解。例 如，对于低于6的pH值，当丙烯酰胺聚合物存在时，疏水性保护基团在比丙烯酰胺的酰胺部 分水解的pH高的pH下切割。对于高于9的pH值，疏水性保护基团在比丙烯酰胺的酰胺部 分水解的pH低的pH下切割。
[0046] 示例性疏水性保护基团包括有机金属部分。例如，有机金属部分可形成甲硅烷基 醚官能团。甲硅烷基醚官能团可源自卤代甲硅烷基化合物，例如通式RiSiOg (R3) (?)的 化合物，其中&是卤素，例如氯，并且R2、R3和独立地选自氢，烷基例如甲基、乙基、丙基、 丁基、芳基、甲硅烷基、其醚衍生物或其任何组合。示例性甲硅烷基醚官能团源自叔丁基二 甲基氯娃焼、三甲基氯娃烧、二乙基氯娃烧、二丙基氯娃烧、二丁基氯娃烧、一苯基甲基氯娃 烷、氯（二甲基）苯基硅烷，或其组合。在特定例子中，受保护单体包括N-(2_((叔丁基二甲 基甲娃焼基）氧基）乙基）丙稀醜胺或tBDMS-HEAM、N-(2 -((二乙基甲娃烧基）氧基）乙 基）丙烯酰胺或TES-HEAM或其组合。在另一个例子中，疏水性保护基团可包括有机部分。 示例性有机部分可包括烷氧羰基部分，例如叔丁氧羰基、芴基甲氧羰基或其组合。在一个例 子中，此类有机部分可以是与胺官能团例如胺官能化的丙烯酰胺或其共聚物的胺官能团结 合的疏水性保护基团。
[0047] 受保护单体可以相对于初始种子聚合物作为在100:1至1:2的范围（例如50:1 至1:1的范围、45:1至2:1的范围、30:1至5:1的范围、或甚至2〇:1至8:1的范围）内的 重量比（受保护单体：种子聚合物）表示的量包括。作为另外一种选择，单体可以在 10:1 至1:2的范围，例如5:1至1:2的范围，或甚至在2:1至1:2的范围内的量包括。
[0048] 分散相还可包括交联剂。在一个例子中，交联剂以在15:1至1:2的范围（例如 10:1至1:1的范围、6:1至1:1的范围、或甚至4:1至1:1的范围）内的受保护单体与交 联剂的质量比包括。交联剂可具有低水溶性（例如小于Wg/ 1)，导致对于分散相的优先。 特别地，交联剂可以是二乙烯基交联剂。例如，二乙烯基交联剂可包括二丙烯酰胺，例如 Ν，Ν'-(乙烷-1,2-二基）双（2-羟乙基）丙烯酰胺、N，N，-(2-羟丙烷-1,3-二基）二丙 烯酰胺或其组合。在另一个例子中，二乙烯基交联剂包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基 苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯、其受保护的衍生物，或其组合。在 进一步的例子中，交联剂可由疏水性保护基团例如羟基保护基团加以保护。特别地，疏水 性保护基团可以是有机金属部分。例如，有机金属部分可形成甲硅烷基醚官能团。示例性 甲硅烷基醚官能团可源自叔丁基二甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三丙基氯硅 烷、三丁基氯硅烷、二苯基甲基氯硅烷、氯（二甲基）苯基硅烷，或其组合。示例性受保护的 二丙烯酰胺交联剂包括Ν, Ν'-(乙烷-I,2-二基）双（N-(2_((叔丁基二甲基甲硅烷基）氧 基）乙基）丙烯酰胺、N，N' -(N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基）氧基）丙烷-1,3-二基） 二丙烯酰胺、N，Ν' -（乙烷-1，2-二基）双（N-(2-((三乙基甲硅烷基）氧基）乙基）丙烯 酰胺、Ν，Ν'-(Ν-(2-((三乙基甲硅烷基）氧基）丙烷-l， 3_二基）二丙烯酰胺、甲硅烷基保 护的Ν-[2-(丙烯酰氨基）-1，2_二羟乙基]丙烯酰胺例如Ν，Ν'（2,3_双（（三乙基甲硅烷 基）氧基）丁烷-1,4-二基）二丙烯酰胺，或其组合。在另一个例子中，保护基团可包括烷 氧羰基部分，例如叔丁氧羰基、芴基甲氧羰基或其组合。特别地，包括羟基的交联剂可由保 护基团例如上文与受保护单体相关描述的保护基团加以保护。
[0049]另外，使具有疏水性保护基团的亲水性单体聚合可包括在致孔剂的存在下聚合。 示例性致孔剂包括芳香族致孔剂。在一个例子中，芳香族致孔剂包括苯、甲苯、二甲苯、均三 甲苯、乙酸苯乙酯、己二酸二乙酯、乙酸己酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯酯、乙酸丁酯，或其组合。 致孔剂通常具有15-20的溶解度参数。在另一个例子中，致孔剂是烷醇致孔剂例如十二醇。 致孔剂可以相对于在反应系统内的有机相在1重量％至99重量％的范围（例如30重量％ 至 9〇重量％的范围或甚至50重量％至85重量％的范围）内的量包括。
[0050] 单体选自以其无保护形式产生水凝胶的一组单体，使得寡核苷酸和聚合酶可在使 用过程中到达其靶。
[0051] 亲水性丙烯酰胺和尤其是二丙烯酰胺难以在这样的溶剂中溶解，所述溶剂与水不 混溶并且同时溶解疏水性种子聚合物。关于单体和交联剂两者的保护基团可这样选择，使 得单体在疏水相中的溶解度足够大，以实现足够大的浓度以进行聚合。同时，保护基团可以 不大得使得聚合由于立体阻碍而无法进行。脱保护可在不水解聚合物的条件下进行。
[0052] 任选地，可包括聚合引发剂。示例性聚合引发剂可通过自由基生成而引发聚合。示 例性聚合引发剂包括偶氮引发剂例如油溶性偶氮引发剂。另一种引发剂可包括过硫酸铵。 进一步的示例性引发剂可包括四甲基乙二胺。在一个例子中，聚合引发剂可以基于分散相 重量0.001重量％至3重量％的量包括。
[0053] 在聚合后，聚合物颗粒108可剥去种子聚合物，形成仍具有疏水性保护基团的聚 合物颗粒110。例如，种子聚合物可使用溶剂提取，所述溶剂例如醛或酮例如丙酮、甲基乙基 酮、二异丙基酮、乙酸丁酯、环己酮、二甲基甲酰胺或其组合；邻苯二甲酸酯溶剂例如邻苯二 甲酸正丁酯；醚溶剂例如四氢呋喃、二异丙醚、甲基叔丁醚、二甲醚、二乙醚或其组合；酯溶 剂例如乙酸乙酯、乙酸丁酯或其组合；杂环溶剂例如吡啶、二噁烷、四氢糠醇或其组合；卤 代溶剂例如二氯甲烷、氯仿或其组合。作为另外一种选择，种子聚合物可在聚合物颗粒转换 为亲水性颗粒后进行提取。例如，种子聚合物可在使颗粒聚合物脱保护，例如去除聚合物上 起因于受保护单体的甲硅烷基后进行提取。
[0054] 如图1中所示，一旦提取种子聚合物，聚合物颗粒110就可通过去除疏水性保护基 团的至少一部分而转换为亲水性聚合物颗粒。例如，疏水性保护基团可从聚合物颗粒中酸 切割。特别地，此类去除可从聚合物颗粒中去除基本上所有疏水性保护基团，例如去除至少 80%的疏水性保护基团，或甚至至少90%的疏水性保护基团。
[0055] 在一个例子中，疏水性保护基团通过添加酸例如有机酸进行酸切割。特别地，有机 酸可具有在3. 0至5. 5的范围内的PKa。例如，有机酸可包括乙酸、乳酸、柠檬酸或其任何组 合。作为另外一种选择，可使用无机酸。
[0056] -旦去除疏水性保护基团的至少一部分，就形成亲水性颗粒112。亲水性颗粒112 可以是水凝胶颗粒。水凝胶是可吸收其重量至少20%的水，例如其重量至少45 %、至少 65%、至少85%、至少100%、至少300%、至少1〇〇〇%、至少1500%或甚至至少2000%的水 的聚合物。
[0057] 可活化亲水性聚合物112,以有利于与靶分析物例如多核苷酸的缀合。例如，可增 强在亲水性颗粒112上的官能团，以允许与靶分析物或分析物受体的结合。在特定例子中， 亲水性聚合物的官能团可用能够将亲水性聚合物官能团转换为反应部分的试剂进行修饰， 所述反应部分可经历亲核或亲电取代。例如，亲水性颗粒112上的羟基可通过将羟基的至 少一部分替换为磺酸酯基团或氯进行活化。示例性磺酸酯基团可源自三氟乙基磺酰氯、甲 磺酰氯、对甲苯磺酰氯或4-氟苯横酰氯（fosyl chloride)、或其任何组合。横酸酯可作用 于允许亲核体替换磺酸酯。磺酸酯还可与释放的氯反应，以提供可在过程中用于缀合颗粒 的氯化基团。在另一个例子中，可活化在亲水性聚合物112上的胺基。
[0058] 例如，祀分析物或分散物受体可通过由横酸酯基团的亲核取代而与亲水性聚合物 结合。在特定例子中，由亲核体例如胺或硫醇封端的靶分析物受体可经历亲核取代，以替换 亲水性聚合物112的表面上的磺酸酯基团。由于活化，可形成缀合颗粒114。
[0059] 在另一个例子中，磺酸化颗粒还可与单官能或多官能单亲核试剂或多亲核试剂反 应，所述亲核试剂可形成与颗粒的附着，同时维持对包含亲电基团例如马来酰亚胺的寡核 苷酸的亲核活性。另外，残留亲核活性可通过附着至包含多亲电基团的试剂而转换为亲电 活性，所述多亲电基团随后附着至包含亲核基团的寡核苷酸。
[0060] 在另一个例子中，含有官能团的单体可在聚合过程中添加。单体可包括例如含有 羧酸、酯、卤素或其他胺反应基团的丙烯酰胺。酯基团可在与胺寡核苷酸反应前水解。
[0061] 其他缀合技术包括在颗粒合成过程中使用包含在胺上的疏水性保护基团的单体。 胺基的脱保护使得可获得亲核基团，所述亲核基团还可用胺反应性双官能双亲电试剂修 饰，所述修饰获得在附着至聚合物颗粒后的单官能亲电基团。此类亲电基团可与具有亲核 基团例如胺或硫醇的寡核苷酸反应，促使通过与空亲电体反应的寡核苷酸附着。
[0062]如果颗粒112由氨基和羟基丙烯酰胺的组合制备，则水凝胶颗粒的脱保护导致亲 核氨基和中性羟基的组合。氨基可由二官能双亲电部分例如二异氰酸酯或双-NHS酯进行 修饰，导致与亲核体反应的亲水性颗粒。示例性双-NHS酯包括双琥珀酰亚胺C2-C12烷基 酯，例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯或双琥珀酰亚胺戊二酸酯。
[0063]其他活化化学包括掺入多步以转化特定官能团，以容纳特定所需连接。例如，磺酸 酯修饰的轻基可通过几种方法转化成亲核基团。在一个例子中，横酸酯与叠氮化物阴离子 的反应获得叠氮化物取代的亲水聚合物。叠氮化物可经由"CLICK"化学直接用于与乙炔取 代的生物分子缀合，所述"CLICK"化学可伴随或不伴随铜催化进行。任选地，叠氮化物可通 过例如与氢的催化还原或与有机膦的还原而转化为胺。所得的胺随后可用多种试剂转化为 亲电基团，所述多种试剂例如二异氰酸酯、双NHS酯、三聚氯氰或其组合。在一个例子中，使 用二异氰酸酯获得在聚合物和接头之间的脲连接，所述脲连接导致能够与氨基取代的生物 分子反应的残留异氰酸酯基团，以获得在接头和生物分子之间的脲连接。在另一个例子中， 使用双NHS酯获得在聚合物和接头之间的酰胺连接，和能够与氨基取代的生物分子反应的 残留的NHS酯基团，以获得在接头和生物分子之间的酰胺连接。在进一步的例子中，使用三 聚氯氰（cyanuric chloride)获得在聚合物和接头之间的氨基-三嗪连接，和两个残留的 氯-三嗪基团，其中之一能够与氨基取代的生物分子反应，以获得在接头和生物分子之间 的氨基-三嗪连接。其他亲核基团可经由磺酸酯活化掺入颗粒内。例如，磺酸化的颗粒与 硫代苯甲酸阴离子的反应和后续硫代苯甲酸酯的水解将硫醇掺入颗粒内，所述颗粒可随后 与马来酰亚胺取代的生物分子反应，以获得与生物分子的硫代-琥珀酰亚胺连接。硫醇还 可与溴-乙酰基反应。
[0064] 作为另外一种选择，丙烯酸亚磷酰胺寡核苷酸可在聚合过程中用于掺入寡核苷 酸。示例性丙烯酸亚磷酰胺寡核苷酸可包括离子交换的寡核苷酸。
[0065] 使用与在生物分子上的亲核部分偶联的在基底上的亲电部分、或与在生物分子上 的亲电连接偶联的在基底上的亲核连接基团，可在难熔性（refractory)基底或聚合基底 上产生生物分子的共价连接。由于大多数常见目的生物分子的亲水性性质，对于这些偶联 选择的溶剂是水或含一些水溶性有机溶剂的水，以便将生物分子分散到基底上。特别地，由 于其聚阴离子性质，多核苷酸一般在水系统中与基底偶联。因为水通过使亲电体水解为失 活部分用于缀合而与亲核体竞争亲电体，所以水性系统一般导致偶联产物的低得率，其中 得率基于该偶联对的亲电部分。当期望反应的对的亲电部分的高得率时，需要高浓度的亲 核体以驱动反应并减轻水解，导致亲核体的无效使用。在多核酸的情况下，磷酸盐的金属抗 衡离子可替换为亲脂抗衡离子，以便帮助生物分子溶解于极性、非反应性、非水性溶剂中。 这些溶剂可包括酰胺或脲，例如甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、乙酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、 六甲基磷酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N，Ν，Ν'，Ν'-四甲基脲、Ν，Ν'-二甲基-N，Ν'-三 亚甲基脲或其组合；碳酸酯；例如碳酸二甲基酯、碳酸亚丙基酯或其组合；醚例如四氢呋 喃；亚砜和砜例如二甲基亚砜、二甲基砜或其组合；受阻醇例如叔丁醇；或其组合。亲脂阳 离子可包括四烷基铵或四芳基铵阳离子例如四甲基铵、四乙基铵、四丙基胺、四丁基铵、四 戊基铵、四己基铵、四庚基钱、四辛基胺、以及其烷基和芳基混合物，四芳基鳞阳离子例如四 苯基鱗，四烷基紳或四芳基紳例如四苯基紳，以及三烷基锍阳离子例如三甲基锍或其组合。 通过用亲脂阳离子交换金属阳离子将多核酸转换成有机溶剂可溶性材料，可通过多种标准 阳离子交换技术进行。
[0066] 在另一个例子中，颗粒可使用乳状液聚合技术形成，其中疏水相在亲水相内形成 分散相。上文描述的有利于疏水相的单体、交联剂以及其他试剂和化合物趋于位于在其中 发生聚合的疏水相中。 t〇〇67] 表面活性剂例如上文描述的表面活性剂可用于亲水相中，以支持乳状液形成。当 使用种子颗粒时，表面活性剂可以低于临界胶束浓度的浓度使用。作为另外一种选择，表面 活性剂可以大于临界胶束浓度的浓度使用。乳状液聚合通常用水溶性引发剂如过硫酸钾或 过硫酸铵进行。
[0068]通过将引发剂加入单体的加热乳状液中，颗粒成核在水相中开始，并且形成的颗 粒通过表面活性剂得到稳定。如果大多数颗粒在短时间段内产生，则可产生单一尺寸的种 子颗粒。因为单体通过水相从大单体小滴扩散到小得多的种子颗粒内，所以颗粒大小随后 发生增加。
[0069] 特别地，上述方法可产生具有期望粒度和变异系数的多个颗粒。颗粒组可包括 100, 000个颗粒，例如500, 000个颗粒、大于1百万个颗粒、大于丨千万个颗粒或甚至至少 1x10'多个颗粒的颗粒可以是亲水性聚合物颗粒，例如水凝胶颗粒。在特定例子中，水凝胶 颗粒可以是丙烯酰胺颗粒，例如包括交联的羟烷基丙烯酰胺聚合物或羟烷基（hydroalkyl) 丙烯酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的交联共聚物的颗粒。在另一个例子中，颗粒可以是丙烯 酰胺和胺官能化的丙烯酰胺的交联共聚物。
[0070] 该多个颗粒可具有期望的粒度，例如不超过100 μ m、不超过30 μ m、或不超过 3ym的粒度。平均粒度是平均粒子直径。例如，平均粒度可以是不超过2μηι,例如不超 过1· 5 μ m、不超过1· 1 μ m、不超过0· 8 μ m、不超过0· 6 μ m、不超过〇· 5 μ m、或甚至不超过 0. 3μηι。在特定例子中，平均粒度可在0· Ιμηι至ΙΟΟμηι的范围内，例如〇. ?μιη至50μπι 的范围或〇· ?μηι至1. lum的范围。在一些方面，上述方法提供了用于产生颗粒的技术优 点，所述颗粒具有在5μηι至ΙΟΟμηι的范围，例如20 μ m至ΙΟΟμηι的范围或30 μ m至70μηι 的范围内的粒度。在其他方面，上述方法提供了用于产生具有不超过1. Ιμηι的粒度的颗粒 的技术优点。当种子更大时，可形成更大的颗粒。颗粒的大小可基于种子颗粒的大小进行 调整。使用本发明的方法，聚合物颗粒的大小比使用其他方法时更不依赖于表面活性剂选 择和浓度。
[0071] 此外，多个颗粒是单分散的，并且可具有期望的低变异系数，例如不超过20 %的变 异系数。如上，变异系数（CV)定义为标准偏差除以平均值乘以100,其中"平均值"是平均 粒子直径，并且标准偏差是粒度中的标准偏差。作为另外一种选择，"平均值"可以是Ζ-平 均值或模式粒径。依照通常实践，CV在主模式即主峰上进行计算，从而排除与聚集体相关 的小峰。因此，低于或高于模式大小的一些颗粒可在计算中不计算，所述计算可例如基于可 检测颗粒的总粒子数的约90%。此类CV测定可在CPS圆盘式离心机或库尔特粒度仪上执 行。例如，多个颗粒的变异系数（CV)可以是不超过15%，例如不超过10%、不超过5%、不 超过4. 5%、不超过4. 0%、不超过3. 5%、或甚至不超过3. 0%。此类CV可无需过滤或其他 尺寸排阻技术来实现。
[0072] 特别地，为了维持珠大小的低变异，在聚合过程中应避免小滴的合并。该避免在水 包油乳状液中比油包水乳状液中更容易实现，因为更容易使其中水是连续相的系统稳定。 然而，亲水性单体不优先位于油相中。
[0073] 在进一步的例子中，在水中的亲水性聚合物颗粒可以是不超过50重量％聚合物， 例如不超过30重量％聚合物、不超过20重量％聚合物、不超过10重量％聚合物、不超过5 重量％聚合物、或甚至不超过2重量％聚合物。
[0074] 在另外的例子中，聚合物颗粒可具有允许蛋白质和酶扩散的孔隙率。在一个例子 中，聚合物颗粒可具有允许具有下述大小的蛋白质扩散的孔隙率：至少50千道尔顿，例如 至少100千道尔顿、至少200千道尔顿、至少250千道尔顿、或甚至至少350千道尔顿。 [0075] 在另一个例子中，当缀合时，聚合物颗粒可包括至少7χ104/μ m3的多核苷酸密度， 称为核苷酸密度。例如，核苷酸密度可以是至少105/μηι 3,例如至少106/lim3、至少5xl06/ μ m3、至少8χ106/μ m3、至少lxl〇V μ m3、或甚至至少3χ107/μ m3。在进一步的例子中，核苷 酸密度可以是不超过1〇15/μ m3。
[0076] 此类聚合物颗粒可用于多种分离技术和分析技术中。特别地，聚合物颗粒可用于 结合多核苷酸。此类结合多核苷酸可用于从溶液中分离多核苷酸或可用于分析技术例如测 序。在图2中所示的具体例子中，此类聚合物颗粒可在测序技术过程中用作多核苷酸的载 体。例如，此类亲水性颗粒可固定多核苷酸用于使用荧光测序技术的测序。在另一个例子 中，亲水性颗粒可固定多核苷酸的多个拷贝用于使用离子感测技术的测序。
[0077] 一般而言，聚合物颗粒可进行处理，以包括生物分子，所述生物分子包括核苷、核 苷酸、核酸（寡核苷酸和多核苷酸）、多肽、糖、多糖、脂质或其衍生物或类似物。例如，聚合 物颗粒可与生物分子结合或附着。生物分子的末端或任何中间部分都可与聚合物颗粒结合 或附着。聚合物颗粒可使用连接化学与生物分子结合或附着。连接化学包括共价或非共价 键，包括离子键、氢键、亲和键、偶极-偶极键、范德华键和疏水键。连接化学包括在结合配 偶体之间，例如在下述物质之间的亲和力：抗生物素蛋白部分和生物素部分；抗原表位和 抗体或其免疫反应片段；抗体和半抗原；地高辛配基（digoxigen)部分和抗地高辛配基抗 体；荧光素部分和抗荧光素抗体；操纵子和阻遏子；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；类固 醇和类固醇结合蛋白；活性化合物和活性化合物受体；激素和激素受体；酶和底物；免疫球 蛋白和蛋白A ;或者寡核苷酸或多核苷酸及其相应互补体。
[0078] 在一个例子中，聚合物颗粒可用于具有表面的系统中。该系统包括在表面上的一 个或多个聚合物颗粒。表面可以是固体表面。表面可包括平面、凹或凸表面、或其任何组合。 表面可包括纹理或特征，包括蚀刻、空穴化或隆起。表面可缺乏任何纹理或特点。表面可包 括毛细管、通道、凹槽、孔或储库的内壁。表面可以是网。表面可以是多孔、半多孔或非多孔 的。表面可以是滤器或凝胶。表面可包括针（例如针阵列）的顶端。表面可由例如下述材 料制备：玻璃、硼硅玻璃、二氧化硅、石英、熔融石英、云母、聚丙烯酰胺、塑料聚苯乙烯、聚碳 酸酯、聚甲基丙烯酸酯（PMA)、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)、聚二甲基硅氧烷（PDMS)、硅、锗、 石墨、陶瓷、硅、半导体、高折射率电解质、晶体、凝胶、聚合物或薄膜（例如金、银、铝或钻石 的薄膜）。表面可包括具有金属薄膜或金属涂层的固体基底。表面是光学透明、最低限度反 射、最低限度吸收的或显示出低荧光。
[0079] 表面可具有类似于含96、384、1536、3456或9600个孔的微量滴定板的尺度。表面 可在任何一个尺度上是约l-20cm，在任何一个尺度上是约l-l〇cm，在任何一个尺度上是约 0· 10-lcm，或在任何一个尺度上是约〇· OOlnm - lcm。表面（以及任何纹理或特点）可通过 纳米构造技术产生。
[0080] 多个聚合物颗粒可在表面上以随机或有序阵列排列，或以随机和有序阵列的组合 排列。有序阵列包括直线和六角形模式。表面可包括以随机或有序阵列或两者的组合排列 的多个位点。一个或多个聚合物颗粒可位于一个位点、一些位点或所有位点处。一些位点 可具有一个聚合物颗粒，并且其他位点可具有多个聚合物颗粒。至少一个位点可缺乏聚合 物颗粒。在阵列中，至少两个聚合物颗粒可彼此接触，或在聚合物颗粒之间不具有接触。
[0081]、如图2中所示，多个聚合物颗粒2〇4可连同多个多核苷酸2〇2 一起置于溶液中。多 个颗粒204可被活化或以其他方式制备，以与多核苷酸2〇2结合。例如，颗粒2〇4可包括与 多个多核苷酸202的多核苷酸一部分互补的寡核苷酸。在另一个例子中，聚合物颗粒2〇4 可使用诸如生物素-链霉抗生物素蛋白结合的技术由靶多核苷酸2〇4进行修饰。
[0082]在特定实施方式中，对亲水性颗粒和多核苷酸实施聚合酶链反应（PCR)扩增。例 如，分散相小滴2〇6或208作为乳状液的一部分形成，并且可包括亲水性颗粒或多核苷酸。 在一个例子中，多核苷酸202和亲水性颗粒204以低浓度和相对于彼此的低比率提供，使得 单个多核苷酸 2〇2可能位于与单个亲水性颗粒2〇4相同的分散相小滴内。其他小滴例如小 滴208可包括单个亲水性颗粒且不包括多核苷酸。每个小滴 2〇6或2〇8可包括酶、核苷酸、 盐或足以促进多核苷酸复制的其他组分。
[0083]在特定实施方式中，酶例如聚合酶存在于分散相小滴的亲水性颗粒或水凝胶颗粒 中，与分散相小滴的亲水性颗粒或水凝胶颗粒结合或紧密接近。在一个例子中，聚合酶存在 ^分散相小滴中，以有利于多核苷酸的复制。多种核酸聚合酶可用于本文描述的方法中。在 示例性实施方式中，聚合酶可包括可催化多核苷酸复制的酶、其片段或子单元。在另一个实 施方式中，聚合酶可以是天然存在的聚合酶、重组聚合酶、突变型聚合酶、变体聚合酶、融合 物或以其他方式改造的聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子、或其类似物、衍生物或片段。 [00 84]在一个实施方式中，聚合酶可以是任何家族A DNA聚合酶（也称为pol I家族） 或任何家族B DNA聚合酶。在实施方式中，DNA聚合酶可以是与非重组!)嫩聚合酶相比较， 能够以优良的准确度和得率复制多核苷酸的重组形式。例如，聚合酶可包括高保真聚合酶 或热稳定聚合酶。在实施方式中，用于多核苷酸复制的条件可包括'热启动'条件,例如热 启动聚合酶例如Amplitaq Gold? DNA聚合酶（Applied Biosciences)或K0D热启动DNA 聚合酶（EMD Biosciences)。通常，'热启动，聚合酶包括热稳定聚合酶和一种或多种抗体， 所述抗体抑制在环境温度下的DNA聚合酶和3' -5,外切核酸酶活性。
[0085]在实施方式中，聚合酶可以是酶例如Taq聚合酶（来自水生栖热菌（Thermus aquaticus))、Tfi聚合酶（来自丝状栖热菌（Thermus filiformis))、Bst聚合酶（来自 嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus))、Pfu聚合酶（来自强烈炽热球菌 (Pyrococcus furiosus))、Tth聚合酶（来自嗜热栖热菌（Thermus thermophilus))、Pow聚 合酶（来自沃氏热球菌（Pyrococcus woesei))、Tli聚合酶（来自栖热球菌（Thermococcus litoralis))'Ultima 聚合酶（来自海栖热袍菌（Thermotoga maritima))、KOD 聚合酶（来 自超好热原始菌（Thermococcus kodakaraensis))、Pol I和II聚合酶（来自激烈火球菌 (Pyrococcus abyssi))以及Pab (来自激烈火球菌）。
[0086]在实施方式中，聚合酶可以是重组形式的超好热原始菌。在实施方式中，聚合酶可 以是K0D或K0D样DNA聚合酶，例如K0D聚合酶（EMD Biosciences)、K0D "热启动，，聚合酶 (EMD Biosciences)、K0D Xtreme热启动DNA聚合酶（EMD Biosciences)、K0D XL DNA聚合酶 (EMD Biosciences)、Platinum? Taq 1)NA 聚合酶（Invitrogen)、Platimira_ Taq DNA 聚合 酶尚保真度（Invitrogen)、Platinum? Pfx(Invitrogen)、Accuprime? Pfx(Invitrogen)、 Accuprime? Taq DNA 聚合酶局保真度（Invitrogen)或 Ampl itaq DNA 聚合酶 (Applied Biosystems)。在实施方式中，聚合酶可以是含有与本文讨论的聚合酶相似的突 变的DNA聚合酶。 、 _____丄 JA
[0087]在实施方式中，多核苷酸的复制可包括调节复制条件。调节可任选包括.增加或降 低聚合酶浓度；增加或降低核苷酸浓度；增加或降低阳离子浓度；増加或降低反应温度 间或pH等等。调节可包括增加或降低反应速率、增加或降低反应产物得率等等。在实^ 式中，复制可在适当缓冲剂或核苷酸（包括核苷酸类似物或生物素化的核苷酸）的存在下 进行。
[0088]特别地，待扩增的多核苷酸可通过聚合物颗粒捕获。用于捕获核酸的示例性方法 可包括：使多核苷酸与寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸附着至聚合物颗粒。在实施方式中，用 于捕获核酸的方法包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸（例如捕获寡核苷酸）的聚合物颗 粒；(b)提供单链多核苷酸；和 （c)使单链寡核苷酸与单链多核苷酸杂交，由此将单链多核 苷^捕获至聚合物颗粒。在实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸（例如捕 获寡核苷酸）附着。在实施方式中，步骤（ c)可用多个单链多核苷酸进行。在实施方式中， 单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补（或部分互补）的核苷 酸序列。
[0089]在一个例子中，该:方法还包括将多核苷酸扩增成多个多核苷酸，并且使多个多核 苷酸的至少一部分附着至亲水性颗粒，由此生成包括多个附着的多核苷酸的亲水性颗粒。 作为另外一种选择，该方法还可包括通过延伸寡核苷酸将多核苷酸扩增成多个互补多核苷 酸，由此生成包括多个附着的多核苷酸的水凝胶颗粒。
[0090]、在实施方式中，用于核苷酸掺入的方法包括：对多核苷酸进行核苷酸聚合反应，所 述多核苷酸是与附着至聚合物颗粒的寡核苷酸杂交的。在实施方式中，用于核苷酸掺入的 方法包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸（例如引物寡核苷酸）的聚合物颗粒 ；(b)提供单 链模板多核苷酸；（c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；和（d)在适合于聚合酶催 化至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使单链模板多核苷酸与聚合酶和至少 一个核苷酸接触，由此进行核苷酸掺入。在实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核 苷^、（例如捕获寡核苷酸）附着。在实施方式中，步骤 （b)、（c)或（d)可用多个单链多核 苷酸进行。在头施方式中，单链募核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分 互补（或部分互补）的核苷酸序列。在实施方式中，系统包含与单链寡核苷酸杂交的单链 多核苷酸，所述单链寡核苷酸附着至聚合物颗粒，其中至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷 酸的末端上。 '
[0091]在实施方式中，用于引物延伸的方法包括：对多核苷酸进行引物延伸反应，所述多 核苷酸是与附着至聚合物颗粒的寡核苷酸杂交的。在实施方式中，用于核酸引物延伸的方 $包括：(a)提供附着至单链寡核苷酸（例如引物寡核苷酸）的聚合物颗粒； (b)提供单链 模板多核苷酸；(c)使单链寡核苷酸与单链模板多核苷酸杂交；和（d)在适合于聚合酶催化 至少一个核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使单链模板多核苷酸与聚合酶和至少一 个核苷酸接触，由此延伸引物。在实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸（例 如捕获寡核苷酸）附着。在实施方式中，步骤（b)、（ c)或（d)可用多个单链多核苷酸进行。 在实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分互补（或部 分互补）的核苷酸序列。在实施方式中，系统包含与单链寡核苷酸杂交的单链多核苷酸，所 述单链寡核苷酸附着至聚合物颗粒，其中所述单链寡核苷酸由一个或多个核苷酸延伸。 [0092]在实施方式中，用于核酸扩增的方法包括：对多核苷酸进行引物延伸反应，所述多 懷紐酸杂交。在实式中，用·酸扩漏方法包括： 丨?恩--?核?酸（例如引物雜飾）的聚合物臟；(b)提供单链模板多核 苷^;(。）使单链募核苷酸与单麵板多核苷酸杂交；( d)在适合于聚合酶将至少-个核昔 酸催化聚合鮮齡核_上的条件下，使单谢舰多核細与聚合酶輕少-种核苷酸 接触、以便生成延伸的单链寡核麵。在实施方式中，该方法还包括 ：(e)从延伸的单链寡 核苷酸去除（嫩P使变性）单f雜板斜紐酸，使得单链猶箝謝親附着至聚合物颗粒； ⑴」吏剩余的单链寡核苷酸与第二单链模板多核苷酸杂交；和 （g)在适合于第二聚合酶催 化第一至少:个核苷酸聚合到单链寡核苷酸上的条件下，使第二单链模板多核苷酸与第二 聚合酶和第二至少一个核苷酸接触，以便生成后续延伸的单链寡核苷酸。在实施方式中，步 骤（ e)、（1和、(g)可重复至少一次。在实施方式中，聚合酶和第二聚合酶包含热稳定的聚 合酶。在实施方式中，适合于核苷酸聚合的条件包括在高温下进行核苷酸聚合步骤（例如 步骤（d)或、(g))。在实施方式中，适合于核苷酸聚合的条件包括在交替温度（例如高温和 相^更低的温度）下进、行核苷酸聚合步骤（例如步骤 （d)或（g))。在实施方式中，交替温 度范围为60-95°C。在实施方式中，温度循环可以是约 1〇秒至约5分钟、或约10分钟、或约 15分钟或更久。在实施方式中，用于核酸扩增的方法可生成各自附着至多个模板多核苷酸 的一种或$种聚合物颗粒，所述多个模板多核苷酸包含与单链模板多核苷酸或第二单链模 板多核苷酸互补的序列。在实施方式中，聚合物颗粒各自可与多个单链寡核苷酸（例如捕 获募核苷酸）附着。在实施方式中，步骤（b)、（ c)、（d)、（e)、（f)或（g)可用多个单链多核 苷酸进行。在实施方式中，单链寡核苷酸的至少一部分包含与单链多核苷酸的至少一部分 互补（或部分互补）的核苷酸序列。在实施方式中，用于核酸扩增的方法（如上所述）可 在油相（例如分散相小滴）中的水相溶液中进行。
[0093]在PCR后，形成颗粒例如颗粒210,其可包括亲水性颗粒212和多核苷酸的多个拷 贝214。虽然多核苷酸214作为在颗粒210的表面上示出，但多核苷酸214可在颗粒210内 延伸。具有相对于水的低浓度聚合物的水凝胶和亲水性颗粒可包括在颗粒 21〇内部和各处 的多核苷酸区段，或多核苷酸可位于孔及其他开口内。特别地，颗粒21〇可允许酶、核苷酸、 引物和用于监控反应的反应产物的扩散。大量多核苷酸/颗粒产生更佳的信号。
[0094]在实施方式中，可收集来自破乳操作的聚合物颗粒并在用于测序的制剂中洗涤。 收集可通过下述进行：使生物素部分（例如与附着至聚合物颗粒的扩增的多核苷酸模板连 接）与抗生物素蛋白部分接触，并且与缺乏生物素化模板的聚合物颗粒分离。可使携带双 链模板多核苷酸的收集的聚合物颗粒变性，以获得单链模板多核苷酸用于测序。变性步骤 可包括用碱例如（NaOH)、甲酰胺或吡咯烷酮处理。
[0095]在示例性实施方式中，颗粒210可用于测序装置中。例如，测序装置216可包括孔 218的阵列。颗粒210可置于孔218内。
[0096]在一个例子中，引物可加入孔218中，或颗粒210可在置于孔218内之前预暴露于 引物。特别地，颗粒210可包括结合的引物。引物和多核苷酸形成包括与引物杂交的多核 苷酸（例如模板核酸）的核酸双链体。核酸双链体是至少部分双链的多核苷酸。酶和核苷 酸可提供给孔218,以促进可察觉的反应，例如核苷酸掺入。
[0097]测序可通过检测核苷酸添加进行。核苷酸添加可使用诸如荧光发射法或离子检测 法的方法进行检测。例如，一组荧光标记的核苷酸可提供给系统216,并且可迁移至孔218。 激发能也可提供给孔2 is。当核苷酸由聚合酶捕获并加入延伸引物的末端时，核苷酸的标记 可发荧光，从而指示加入哪种类型的核苷酸。
[0098] 在替代例子中，包括单一类型核苷酸的溶液可顺序进料。响应核苷酸添加，在孔 218的局部环境内的pH可改变。此类pH变化可通过离子敏感场效应晶体管（ISFET)进行 检测。像这样，pH变化可用于生成指示与颗粒210的多核苷酸互补的核苷酸次序的信号。 [0099] 特别地，测序系统可包括设置在离子传感器例如场效应晶体管（FET)的传感器垫 上的孔或多个孔。在实施方式中，系统包括装载到孔内的一个或多个聚合物颗粒，所述孔设 置在离子传感器（例如FET)的传感器垫上，或包括装载到多个孔内的一个或多个聚合物颗 粒，所述多个孔设置在离子传感器（例如FET)的传感器垫上。在实施方式中，FET可以是 chemFET或ISFET。"chemFET"或化学场效应晶体管包括充当化学传感器的一类场效应晶 体管。chemFET具有M0SFET晶体管的类似结构，其中在门电极上的电荷由化学过程施加。 "ISFET"或离子敏感场效应晶体管可用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度（例如H+)改 变时，通过晶体管的电流相应地改变。
[0100] 在实施方式中，FET可以是FET阵列。如本文使用的，"阵列"是元件例如传感器或 孔的平面排列。阵列可以是一维或二维的。一维阵列可以是具有在第一维度中的一列（或 行）元件和在第二维度中的多个列（或行）的阵列。第一和第二维度中的列（或行）数目 可相同或不同。FET或阵列可包含10 2、103、104、105、106、10 7或更多卩已1'。
[0101] 在实施方式中，一种或多种微流体结构可在FET传感器阵列上方制造，以提供生 物学或化学反应的约束或限制。例如，在一个实现中，一种或多种微流体结构可构造为设置 在阵列的一种或多种传感器上的一个或多个孔（或微孔、或反应室、或反应孔，因为这些术 语在本文中可互换使用），使得给定孔设置在其上的一种或多种传感器检测并测量给定孔 中的分析物存在、水平或浓度。在实施方式中，可存在FET传感器和反应孔的1:1对应。
[0102] 回到图2,在另一个例子中，孔阵列的孔218可以可操作地连接至测量装置。例如， 对于荧光发射法，孔218可以可操作地偶联至光检测装置。在离子检测的情况下，孔218的 下表面可设置在离子传感器例如场效应晶体管的传感器垫上。
[0103] 涉及经由核苷酸掺入的离子副产物检测测序的一个示例性系统为Ion Torrent PGM?测序仪（Life Technologies)，所述Ion Torrent PGM?测序仪是基于离子的测序 系统，其通过检测作为核苷酸掺入的副产物产生的氢离子来测序核酸模板。通常，氢离 子作为在通过聚合酶的模板依赖性核酸合成过程中发生的核苷酸掺入的副产物释放。 Ion Torrent PGM?测序仪通过检测核苷酸掺入的氢离子副产物来检测核苷酸掺入。Ion Torrent PGM?测序仪可包括待测序的多个模板多核苷酸，每个模板设置在阵列中的各自测 序反应孔内。阵列的孔可各自与至少一种离子传感器偶联，所述离子传感器可检测作为核 苷酸掺入的副产物产生的H+离子的释放或溶液pH变化。离子传感器包括与离子敏感的检 测层偶联的场效应晶体管（FET)，所述离子敏感的检测层可感测H+离子的存在或溶液pH变 化。离子传感器可提供指示核苷酸掺入的输出信号，所述输出信号可表示为其量级与各自 孔或反应室中的H+离子浓度关联的电压变化。不同核苷酸类型可连续流动到反应室内，并 且可以由模板序列决定的次序通过聚合酶掺入延伸引物（或聚合位点）内。每个核苷酸掺 入可伴随反应孔中H+离子的释放，连同局限性pH的伴随变化。H+离子的释放可通过传感器 的FET登记，所述传感器产生指示核苷酸掺入的发生的信号。在特定核苷酸流动过程中未 掺入的核苷酸可能不产生信号。来自FET的信号幅度还可与掺入延伸核酸分子内的特定类 型核苷酸的数目关联，由此允许分辨均聚物区域。因此，在测序仪的运行过程中，进入反应 室内的多个核苷酸流连同跨越多个孔或反应室的掺入监控可允许仪器同时分辨多个核酸 模板的序列。关于Ion Torrent PGM?测序仪组成、设计和操作的更多细节可例如在下述专 利申请中找到：美国专利申请序列号12/002781，目前作为美国专利
【发明者】G.丰努姆, G.莫达尔, N.许斯, A.E.莫尔特伯格, D.特兰, J.阿斯罗德, M.T.戈克曼, S.门琴, C.福勒, L.安德鲁齐, W.欣茨, D.格雷姆亚辛斯基, D.莱特, A.马斯特罗亚尼, B.罗森布鲁姆, S.坎, C.斯托拉奇克, T.索科尔斯基 申请人:生命技术公司