通过双重AAV载体有效递送大基因的制作方法

本发明涉及构建体、载体、相应的宿主细胞和药物组合物，其允许有效的基因治疗，尤其是大于5kb的基因。

背景技术：

总体全球发生率为1/2000(1)的遗传性视网膜变性(ird)是全球范围内失明的主要病因。其中最常见和严重的ird是视网膜色素变性(rp)、莱伯先天性黑朦(lca)和斯特格氏病(stgd)，其最常见地遗传为单基因病症。导致ird的突变大部分发生在表达于视网膜中的神经元感光细胞(pr)、视杆细胞和/或视锥细胞的基因中(2)。对于这些失明疾病，目前没有可用的疗法。

基因治疗在治疗ird方面的前景巨大。在可用的基因转移载体中，那些基于小腺相关病毒(aav)的载体最有效地靶向pr和视网膜色素上皮(rpe)(3-4)，用于在单次视网膜下给药后进行长期治疗(3-4)。目前，发明人等已证明，视网膜下给予aav是良好耐受的并有效地改善受2型lca影响的患者的视力，2型lca是由rpe65(一种rpe中表达的基因)中突变导致的(5-9)。这些结果总体而言预示着能够治疗其他形式的lca和ird。aav载体血清型(如aav2/8，其有效靶向pr(10-14)和rpe)的可用性进一步支持该方法。然而，aav的主要限制是其装载能力(cargocapacity)，其被认为限于约5kb，母体病毒基因组的大小(15-19)。这限制了针对由编码序列(cds)大于5kb的基因(本发明中称作大基因)中突变导致的常见ird的aav基因治疗方法的应用。包括：

斯特格氏病(stgd；mim#248200)是最常见的遗传性黄斑变性，其由编码位于pr外节的全反式视网膜转运蛋白的abca4基因(cds:6822bp)中的突变导致(20)；亚瑟综合征ib型(ush1b；mim#276900)是最严重的rp和耳聋形式，其由编码非常规myo7a的myo7a基因(cds:6648bp)(21)中的突变导致，该非常规myo7a是表达于视网膜内pr和rpe中的基于肌动蛋白的马达蛋白(22-24)。

视锥-视杆营养不良3型、眼底黄色斑点症、衰老相关黄斑变性2型、早发重度视网膜营养不良和视网膜色素变性19型也与abca4突变相关(abca4相关疾病)。

已研究了多种策略来克服aav装载能力的限制。一些工作组(包括发明人自己)已尝试通过开发所谓的超大型载体来将大基因“强制”放入许多可用的aav衣壳之一中(25-27)。虽然给予超大型aav载体实现了人遗传性疾病的啮齿类动物和犬模型中治疗相关水平的转基因表达(27-30)，包括stgd和ush1b的abca4-/-和shaker1(sh1)小鼠模型的视网膜(27-30)，但超大型aav介导的转导的内在机制仍不清楚。与发明人等最初提议的相反(25-27)，超大型aav载体不含有完整大基因组的纯群体，而是含有大部分长度小于等于5kb的截短基因组的异质性混合物(15-18)。感染后，已提出将靶细胞核中这些截短基因组的重新组装作为超大型aav载体转导的机制(15-17，31)。与转导机制和体内效力无关，超大型aav基因组大小的异质性是其应用于人基因治疗的主要限制。

或者，利用aav基因组经历分子间连环化的固有能力(32)通过将大基因表达盒切割成两半(大小小于5kb，各自含有两个单独的(双重)aav载体之一)来对大基因进行体内转移(33-35)。在双重aav反式剪接策略中，剪接供体(sd)信号位于载体5’一半的3’端且剪接受体(sa)信号位于载体3’一半的5’端。通过双重aav载体和反向末端重复(itr)介导的两半头对尾连环化对同一细胞进行共感染后，反式剪接导致产生成熟的mrna和全长蛋白质(33)。反式剪接已成功地用于在肌肉和视网膜中表达大基因(36-37)。

具体而言，reich等(37)使用aav2和aav5衣壳进行反式剪接策略并通过使用lacz基因作为报告基因显示两种载体均转导视网膜色素上皮细胞和感光细胞。未将该策略用于治疗性基因和/或大基因。

或者，双重aav载体中含有的两半大转基因表达盒可含有同源重叠序列(位于载体5’一半的3’端和载体3’一半的5’端，双重aav重叠)，其将通过同源重组介导单个大基因组的重建(34)。该策略依赖于转基因重叠序列的重组发生性质(38)。第三种双重aav策略(杂合)基于向反式剪接载体中添加来自外源性基因(即碱性磷酸酶，ap(35，39))的高度重组发生区。添加的区域位于载体5’一半中sd信号的下游和载体3’一半中sa信号的上游以提高双重aav之间的重组。

文献us2010/003218涉及基于ap的杂合双重载体系统。该文献显示表达小型抗肌萎缩蛋白(mini-dystrophin)的基于ap的杂合双重载体的转导效率，但没有关于效力的数据。

lopes等(30)研究了通过腺相关病毒使用大myo7acdna进行视网膜基因治疗并发现使用aav2或aav5单个载体的myo7a疗法在某种程度上是有效的，而双重aav2方法被证明有效性较低。

因此，仍需要可用于重建大基因表达以进行有效基因治疗的构建体和载体。

资助声明

本发明受到意大利特雷森基金会(italiantelethonfoundation)(基金号tgm11mt1和欧洲基金)的支持。意大利特雷森基金会享有本发明的权利。

双重aav反式剪接和双重aav杂合ap策略的研究在国家眼科研究所(nationaleyeinstitute)授予的合同号r24ry019861下得到美国政府的支持。美国政府享有本发明的一定权利。

技术实现要素：

使用腺相关病毒(aav)载体的视网膜基因治疗在人中是安全和有效的。然而，aav装载能量限于5kb阻止其适用于那些超过5kb基因的突变所致的遗传性视网膜疾病，如斯特格氏病(stgd)或亚瑟综合征ib型(ush1b)。用于在视网膜中测试和基于将大基因“强制”包装至aav衣壳(超大型aav)的大基因转移的先前方法无法简单地转化至临床领域，这是因为载体基因组大小的异质性，其体现安全方面的顾虑。

利用aav进行分子间连环化的能力，发明人生成了双重aav载体，其通过剪接(反式剪接)、同源重组(重叠)或两种的组合(杂合)来重建大基因。

为确定哪种基于aav的策略最有效地在视网膜中转导大基因，发明人使用egfp、abca4或myo7a在hek293细胞中并在小鼠和猪视网膜中(体内)逐一比较了若干种基于aav的策略。

发明人发现，双重反式剪接和杂合而非重叠aav载体有效地转导小鼠和猪感光细胞，即遗传性视网膜变性治疗中的主要细胞靶标。双重反式剪接或杂合aav对视网膜转导的水平导致stgd和ush1b的abca4-/-和sh1小鼠模型的表型出现显著改善。对于需要递送大基因的视网膜疾病的基因治疗而言，双重aav反式剪接或杂合载体是富有吸引力的策略。

因此，本发明的一个实施方式是一种双重构建体系统，用于在宿主细胞中表达感兴趣的基因的编码序列，所述编码序列由5’端部分和3’端部分组成，所述双重构建体系统包含：

a)第一质粒，其以5’-3’方向包含：

-5’反向末端重复(5’-itr)序列；

-启动子序列；

-所述编码序列的5’端部分，所述5’端部分可操作地连接所述启动子并处于所述启动子的控制下；

-剪接供体信号的核酸序列；以及

-3’反向末端重复(3’-itr)序列；以及

b)第二质粒，其以5’-3’方向包含：

-5’反向末端重复(5’-itr)序列；

-剪接受体信号的核酸序列；

-所述编码序列的3’端；

-聚腺苷酰化信号核酸序列；以及

-3’反向末端重复(3’-itr)序列。

本发明的一个优选实施方式是一种双重构建体系统，用于在宿主细胞中表达感兴趣的基因的编码序列，所述编码序列由5’端部分和3’端部分组成，所述双重构建体系统包含：

a)第一质粒，其以5’-3’方向包含：

-5’反向末端重复(5’-itr)序列；

-启动子序列；

-所述编码序列的5’端部分，所述5’端部分可操作地连接所述启动子并处于所述启动子的控制下；

-剪接供体信号的核酸序列；以及

-3’反向末端重复(3’-itr)序列；以及

b)第二质粒，其以5’-3’方向包含：

-5’反向末端重复(5’-itr)序列；

-剪接受体信号的核酸序列；

-所述编码序列的3’端；

-聚腺苷酰化信号核酸序列；以及

-3’反向末端重复(3’-itr)序列，

其中，在将所述第一质粒和所述第二质粒导入宿主细胞后，通过剪接供体和剪接受体信号重建所述编码序列。本发明的双重构建体系统可有利地用于重建大基因表达。当编码序列重建时，基因表达发生。

优选地，所述第一质粒和所述第二质粒还分别包含3’itr的5’位置和5’itr的3’位置中的重组发生区的核酸序列。

更优选地，该重组发生区是f1噬菌体重组发生区。

更优选地，重组发生区的核酸序列基本由以下序列组成：

gggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaat(seqidno.3)。该重组发生区还可以是seqidno.3的片段，所述片段维持全长序列的重组发生性质。优选地，该片段与seqidno.3具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同性。

更优选地，itr的核苷酸序列衍生自相同或不同的aav血清型。

优选地，第一质粒的3’-itr和第二质粒的5’-itr来自同一aav血清型。

优选地，第一质粒的5’-itr和3’-itr和第二质粒的5’-itr和3’-itr分别来自不同aav血清型。

优选地，第一质粒的5’-itr和第二质粒的3’-itr来自不同aav血清型。

优选地，该编码序列在天然的外显子-外显子连接点处被分为5’端部分和3’端部分。

在优选的实施方式中，剪接供体信号的核酸序列基本由以下序列组成：

gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttct(seqidno.1)。

在优选的实施方式中，剪接受体信号的核酸序列基本由以下序列组成：

gataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag(seqidno.2)。

剪接受体信号和剪接供体信号还可由本领域技术人员在已知的序列中选择。

剪接体内含子通常位于真核细胞的蛋白质编码基因的序列内。在内含子内，需要供体位点(内含子的5’端)、分支位点(靠近内含子的3’端)和受体位点(内含子的3’端)来进行剪接。该剪接供体位点在较大、较不高度保守的区域内的位于内含子5’端处包含几乎不变的序列gu。内含子3’端的剪接受体位点以几乎不变的ag序列终止该内含子。在ag的上游(5'方向)，存在富嘧啶(c和u)区域或多聚嘧啶序列。在该多聚嘧啶序列的上游是分支点，其包含腺嘌呤核苷酸。

在优选的实施方式中，该第一质粒还包含至少一种增强子序列，其与编码序列可操作地连接。可由本领域技术人员选择任何已知的合适的增强子序列。

优选地，该编码序列是编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质能够修正遗传疾病，特别是遗传性视网膜变性。

优选地，该编码序列选自：abca4、myo7a、cep290、cdh23、eys、ush2a、gpr98或alms1。

本发明的另一个实施方式是一种双重病毒载体系统，其包含：

a)含有第一质粒的第一病毒载体，所述第一质粒以5’-3’方向包含：

5’反向末端重复(5’-itr)序列、启动子序列，所述编码序列的5’端部分(所述5’端部分与所述启动子可操作地连接并在其控制下)、剪接供体信号的核酸序列，和3’反向末端重复(3’-itr)序列；以及

b)含有第二质粒的第二病毒载体，所述第二质粒以5’-3’方向包含：

5’反向末端重复(5’-itr)序列、剪接受体信号的核酸序列、所述编码序列的3’端、聚腺苷酰化信号核酸序列，和3’反向末端重复(3’-itr)序列。

优选地，这些载体是腺相关病毒(aav)载体。

优选地，这些腺相关病毒(aav)载体选自相同或不同的aav血清型。

优选地，该腺相关病毒选自血清型2、血清型8、血清型5、血清型7或血清型9。

本发明的另一个实施方式是使用本发明所述的双重病毒载体系统转化的宿主细胞。

该宿主细胞优选是哺乳动物细胞、人细胞、视网膜细胞、非胚胎干细胞。

本发明的另一个实施方式是用于医疗应用、优选用于基因治疗、更优选用于治疗和/或预防以视网膜变性为特征的病理学或病症的本发明的双重构建体系统、本发明的双重病毒载体系统或本发明的宿主细胞。优选地，该视网膜变性是遗传性的。

更优选，该病理学或病症选自：视网膜色素变性、莱伯先天性黑朦(lca)、斯特格氏病、亚瑟病、阿尔斯特雷姆综合征、由abca4基因中突变导致的疾病(也称作abca-4相关疾病)。由abca4基因中突变导致的疾病(也称作abca-4相关疾病)的示例是视锥-视杆营养不良3型、眼底黄色斑点症、衰老相关黄斑变性2型、早发重度视网膜营养不良和视网膜色素变性19型。

本发明的另一个实施方式是一种药物组合物，其包含本发明所述的双重构建体系统、本发明所述的双重病毒载体系统或本发明所述的宿主细胞和药学上可接受的载剂。

本发明的另一个实施方式是一种治疗和/或预防以视网膜变性为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予有效量的本发明所述双重构建体系统、本发明所述双重病毒载体系统或本发明所述宿主细胞。

本发明的另一个实施方式是一种用作重组发生区的由seqidno.3组成的核酸。

本发明的另一个实施方式是一种诱导遗传重组的方法，包括使用由seqidno.3组成的序列。

在本发明中，该启动子优选选自：巨细胞病毒启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、感光细胞间类视黄醇结合蛋白启动子、卵黄状黄斑营养不良2启动子。但可以使用本领域已知的任何合适启动子。

在本发明中，该编码序列在天然的外显子-外显子连接点处被分为第一和第二片段(5’端部分和3’端部分)。优选地，编码序列的各片段的大小不应超过10kb。优选地，各5’端部分和3’端部分的大小可以是4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb、7.5kb、8kb、8.5kb、9kb、9.5kb或更小。

在过去的十年间，已在数以百计的临床试验中将基因治疗应用于治疗疾病。已开发了多种工具以向人细胞递送基因；其中，遗传工程改造的病毒(包括腺病毒)是最常用的基因递送工具。大多数系统含有能够容纳感兴趣的基因的载体和辅助细胞，这些辅助细胞可提供病毒结构蛋白和酶以允许生成含有载体的感染性病毒颗粒。腺相关病毒是一种病毒家族，其在核苷酸和氨基酸序列、基因组结构、致病性和宿主范围方面存在差异。该多样性提供了使用具有不同生物学性质的病毒来开发不同的治疗性应用的机会。如同使用任何递送工具那样，效率、靶向特定组织或细胞类型的能力、感兴趣的基因的表达以及基于腺病毒的系统的安全性对于基因治疗的成功应用至关重要。近年来已在这些研究领域做出了众多尝试。已对基于腺相关病毒的载体和辅助细胞进行了多种修饰以改变基因表达、靶向递送、改善病毒效价并提高安全性。本发明代表了该设计过程的改进，其中其作用是向这类病毒载体有效地递送感兴趣的基因。

病毒是基因递送的合理工具。其在细胞内复制并因此进化出进入细胞并使用细胞装置表达其基因的机制。基于病毒的基因递送的概念是对病毒进行工程改造以使其表达感兴趣的基因。取决于具体应用和病毒类型，大多数病毒载体含有阻碍其在宿主中像野生型病毒那样自由复制的能力的突变。已对来自若干不同家族的病毒进行修饰以生成用于基因递送的病毒载体。这些病毒包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、小核糖核酸病毒和α病毒。本发明优选使用腺相关病毒。

理想的用于基因递送的基于腺相关病毒的载体必须是有效、细胞特异性、受调控和安全的。递送效率是重要的，因为其可决定治疗的效力。目前的努力旨在使用腺相关病毒载体实现细胞类型特异性感染和基因表达。此外，腺相关病毒载体正在被开发用于调控感兴趣基因的表达，因为治疗可能需要长时间或受调控的表达。安全性是病毒基因递送的一个重要问题，因为大多数病毒是病原体或具有致病潜力。重要的是，在基因递送期间，患者还不会不经意地接受具有全复制潜能的致病性病毒。

腺相关病毒(aav)是一种感染人和一些其他灵长类物种的小病毒。目前已知aav不会导致疾病，因此该病毒导致非常轻度的免疫应答。使用aav的基因治疗载体可感染分裂和静止的细胞，并维持在染色体外状态且不整合至宿主细胞的基因组中。这些特征使得aav是一种建立用于基因治疗的病毒载体和建立同基因人疾病模型的非常有吸引力的候选物。

因为多种特征，野生型aav吸引了基因治疗研究者的大量兴趣。其中最主要的是该病毒明显缺少致病性。其还可感染非分裂细胞并能够在人染色体19的特定位点处(命名为aavs1)稳定整合至宿主细胞基因组中。该特征使其与逆转录病毒相比更具可预测性，所述逆转录病毒代表了随机插入和诱变的威胁，这之后有时会发生癌症。aav基因组最频繁地整合至上述位点，而向基因组的随机整合以可忽略的频率发生。然而，开发aav作为基因治疗载体通过从载体的dna上除去rep和cap消除了该整合能力。所需基因以及驱动该基因表达的启动子被插入反向末端重复(itr)之间，所述反向末端重复辅助在通过宿主细胞dna聚合酶复合物将单链载体dna转化为双链dna后在核中形成多联体(concatamer)。基于aav的基因治疗载体在宿主细胞核中形成附加型多联体。在非分裂细胞中，这些多联体在宿主细胞生命期间维持完整。在分裂细胞中，aavdna通过细胞分裂而丢失，因为附加型dna不会随宿主细胞dna复制。aavdna向宿主基因组中的随机整合是可检测的，但以非常低的频率发生。aav还具有非常低的免疫原性，似乎限于生成中和抗体，而其不诱导清楚界定的细胞毒性应答。该特征以及感染静止细胞的能力使其在用于人基因治疗的载体方面优于腺病毒。

aav基因组、转录组和蛋白质组

aav基因组由长度约4.7千碱基的正义或反义的单链脱氧核糖核酸(ssdna)构成。该基因组包含位于dna链两端的反向末端重复(itr)以及两个开放阅读框(orf)：rep和cap。前者由编码aav生命周期所需的rep蛋白的四个重叠基因组成，且后者含有衣壳蛋白的重叠核苷酸序列：vp1、vp2和vp3，其相互作用以形成二十四面对称的衣壳。

itr序列

反向末端重复(itr)序列各自包含145个碱基。该名称来源于其对称性，所述对称性是aav基因组的有效增殖所必需的。这些序列的另一个性质是其形成发卡结构的能力，所述发卡结构有助于所谓自启效应(self-priming)，其允许第二dna链的引发酶非依赖性合成。这些itr还显示是aavdna整合至宿主细胞基因组(人的第19号染色体)并从中拯救以及aavdna的有效衣壳化和生成完全组装且脱氧核酸酶耐受性aav颗粒所必需的。

对于基因治疗，itr似乎是与治疗性基因顺式相邻所需的唯一序列：结构(cap)和包装(rep)基因可反式递送。在该假定下，建立了许多方法以有效生成含有报告基因或治疗性基因的重组aav(raav)载体。然而，还公开了itr不是顺式有效复制和衣壳化所需的唯一元件。一些研究组鉴定到了rep基因编码序列内命名为顺式作用rep依赖性元件(care)的序列。care被证明在顺式情况下增加复制和衣壳化。

截至2006年已描述了11种aav血清型，2004年时描述了第11种。所有已知的血清型都可感染来自多种不同组织类型的细胞。通过衣壳血清型确定组织特异性且假型化aav载体以改变其向性范围对其在治疗中的应用可能是重要的。在本发明中优选aav血清型2和血清型5的itr。

血清型2

迄今为止，血清型2(aav2)被研究得最为透彻。aav2对于骨骼肌、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞具有天然向性。

已描述了三种针对aav2的细胞受体：硫酸乙酰肝素蛋白多糖(hspg)、avβ5整联蛋白和成纤维细胞生长因子受体1(fgfr-1)。第一种的功能是主要受体，而后两种具有共受体活性并能够使aav通过受体介导的胞吞作用进入细胞。这些研究结果受到了qiu,handa等的怀疑。hspg的功能是主要受体，但其在胞外基质中的丰度可清除aav颗粒并损伤感染效率。

血清型2和癌症

研究证明，该病毒的血清型2(aav-2)明显杀伤癌细胞而不损害健康细胞。“我们的结果表明，感染大部分群体但不具有已知疾病作用的2型腺相关病毒杀伤多种类型的癌细胞但对健康细胞没有影响”，宾夕法尼亚州的宾州州立大学医学院的免疫学和微生物学教授craigmeyers说。这可导向新的抗癌试剂。

其他血清型

虽然aav2是多种基于aav2的研究中最常用的血清型，但也证明其他血清型可更有效地作为基因递送载体。例如，aav在感染气道上皮细胞中似乎更好，aav7对鼠骨骼肌细胞具有非常高的转导率(类似于aav1和aav5)，aav8最适合转导肝细胞且aav1和5被证明在向血管内皮细胞的基因递送中非常有效。在脑中，大多数aav血清型显示神经元向性，而aav5还能转导星形细胞。aav1和aav2的杂合体aav6还显示比aav2低的免疫原性。

各血清型的不同之处可在于其结合的受体。例如，aav4和aav5转导可被可溶性唾液酸抑制(对于各种这类血清型有不同的形式)，且aav5显示通过血细胞衍生的生长因子受体进入细胞。

在本发明中，可向患者给予本发明的递送载剂。本领域技术人员能够确定适当的给药速率。术语“给予”包括通过病毒或非病毒技术递送。病毒递送机制包括但不限于上文所述腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和杆状病毒载体等。非病毒递送机制包括脂质介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质体转染试剂、阳离子表面两亲物(cfa)及其组合。

通过本发明所述载体系统递送一种或多种治疗基因可单独使用或与其他治疗或治疗组分联用。

本发明还提供了一种通过基因治疗来治疗个体的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的本发明的载体/构建体或宿主细胞，其包含一种或多种可递送的治疗性和/或诊断性转基因或由所述转基因生成或获得的病毒颗粒。该药物组合物可用于人或动物用途。通常，医师都可确定对单个患者而言最适用的实际剂量且其会根据特定个体的年龄、体重和反应而变化。该组合物可任选包含药学上可接受的运载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用运载体、赋形剂或稀释剂的选择可基于指定的给药途径和标准药学实践。除运载体、赋形剂或稀释剂外，该药物组合物还可包含任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂和辅助或提高病毒进入靶位点的其他运载体试剂(例如脂质递送系统)。适当时，药物组合物可通过以下任意一种或多种方式给予：吸入给予，以栓剂或阴道栓的形式给予，以洗剂、溶液剂、乳膏、软膏或撒粉的形式外用，使用皮肤贴片，以包含淀粉或乳糖等赋形剂的片剂形式口服给予，或单独或与赋形剂混合的胶囊或卵泡形式，以包含调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或混悬剂形式给予，或者可以胃肠外注射给予，例如海绵体内、静脉内、肌内或皮下。对于胃肠外给药，这些组合物最好是无菌水溶液形式，可包含其他物质如足量的盐或单糖以使溶液与血液等渗。对于含服或舌下给药，这些组合物可以是采用常规方式配制的片剂或锭剂形式。

本领域技术人员应理解将多核苷酸或载体整合至宿主细胞内的标准方法，例如转染、脂质转染、电穿孔、微注射、病毒感染、热击、转化(细胞融合或细胞膜的化学通透后)。

本文中，术语“宿主细胞或遗传工程改造的宿主细胞”指使用前文所述构建体或载体转导、转化或转染的宿主细胞。

作为适当宿主细胞的代表性示例，可举例细菌细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌)、真菌细胞(如酵母)、昆虫细胞(如sf9)、动物细胞(如cho或cos)、植物细胞等。本领域技术人员根据本文教导能够选择合适的宿主。优选地，所述宿主细胞是动物细胞，且更优选是人细胞。本发明还提供了包含本发明所述重组表达载体中任一种的宿主细胞。该宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体(如人)中分离。该宿主细胞可以是粘附性细胞或悬浮的细胞，即悬液形式生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的且包括例如dh5α、大肠杆菌细胞、中华仓鼠卵巢细胞、猴vero细胞、cos细胞、hek293细胞等。

通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。

图1.用于大基因转导的基于aav的策略的示意图。

cds：编码序列；pa：聚腺苷酰化序列；sd：剪接供体信号；sa：剪接受体信号；ap：碱性磷酸酶重组发生区(39)；ak：f1噬菌体重组发生区。虚线(dottedline)显示sd和sa之间发生的剪接，点线(pointedline)显示可用于同源重组的重叠区域。发明人发现，双重反式剪接和杂合ak可用于成功地重建大基因表达。具体而言，双重反式剪接和杂合ak载体而非重叠和杂合ap载体有效地转导小鼠和猪感光细胞。正常尺寸和超大型aav载体质粒含有全长表达盒，其包含启动子、全长转基因cds和聚腺苷酰信号(pa)(表1)。生成双重aav载体所需的两个单独的aav载体质粒(5’和3’)含有启动子以及之后的转基因cds的n端部分(5’质粒)或转基因cds的c端部分以及之后的pa信号(3’质粒，表1)。所有质粒的结构都示于方法和材料部分。

图2.双重aav重叠、反式剪接和杂合ak载体有效地在体外转导大基因。

用编码egfp(a和d)、abca4(b和e)和myo7a(c和f)的aav2/2载体感染的hek293细胞的western印迹。(a至c)箭头显示全长蛋白质，各泳道下描述了加载的蛋白质的微克数，分子量梯标显示在左侧。(d至f)egfp(d)、abca4(e)和myo7a(f)蛋白质条带的定量。将egfp、abca4和myo7a条带的强度除以微管蛋白(d)或细丝蛋白a(e-f)条带的强度。这些直方图显示相对于双重aav反式剪接(ts)载体的百分比形式的蛋白质表达，平均值显示在相应柱上方。误差线：平均值±s.e.m.(平均值的标准误)。(a-c)代表n＝4(a-b)或n＝3(c)的独立实验或对其定量的western印迹图像。oz：aav超大型；ov：双重aav重叠；ts：双重aav反式剪接；ap：双重aav杂合ap；ak：双重aav杂合ak；5’+3’：用5’和3’一半载体共感染的细胞；5’：仅用5’一半载体感染的细胞；3’：仅用3’一半载体感染的细胞；α-egfp：抗egfp抗体；α-3xflag：抗3xflag抗体；α-myo7a：抗myo7a抗体；α-β-微管蛋白：抗β-微管蛋白抗体；α-细丝蛋白：抗细丝蛋白a抗体。*anovap值小于0.05；**anovap值小于0.001。(f)下图中的星号表示oz和ap的显著差异。

图3.双重aav重叠载体在小鼠和猪视网膜中转导rpe而非感光细胞。

注射编码abca4-3xflag的aav2/8双重aav重叠载体(ov)或编码正常大小egfp的aav2/8载体(egfp)(其在遍在巨细胞病毒(cmv)启动子、pr特异性视紫红质(rho)和视紫红质激酶(rhok)启动子或rpe特异性卵黄状黄斑营养不良2(vmd2)启动子控制下)后一个月c57bl/6(a)和大白猪(b)视网膜裂解物的western印迹分析。(a-b)箭头表示全长蛋白质，分子量梯标显示在左侧，各泳道加载150微克蛋白质。显示了分析的视网膜总数中abca4阳性视网膜的数目(n)和百分比；α-3xflag：抗3xflag抗体；α-营养障碍素(α-dysferlin)：抗营养障碍素抗体(c)注射编码遍在鸡β肌动蛋白(cba)启动子或感光细胞特异性视紫红质(rho)启动子控制下myo7a-ha的aav2/8重叠载体(ov)后三个月c57/bl6洗眼杯(左图)和视网膜(右图)的western印迹分析。箭头表示全长蛋白质，分子量梯标显示在左侧，各泳道加载100微克蛋白质。显示了分析的视网膜总数中myo7a阳性视网膜的数目(n)和百分比。α-ha：抗血凝素(ha)抗体。

图4.双重aav反式剪接和杂合ak载体有效转导rpe和感光细胞。

视网膜下注射编码遍在巨细胞病毒(cmv)启动子控制下egfp的aav2/8载体后一个月来自c57bl/6小鼠的视网膜冷冻切片的荧光分析。图中描述了比例尺(20μm)。ns：aav正常尺寸；oz：超大型；ts：双重aav反式剪接；ap：双重aav杂合ap；ak：双重aav杂合ak；rpe：视网膜色素上皮；onl：外核层。

图5.双重aav反式剪接和杂合ak有效转导小鼠和猪感光细胞。

(a)视网膜下注射编码pr特异性视紫红质启动子(rho)控制下egfp的aav2/8载体后一个月来自c57bl/6小鼠的视网膜冷冻切片的荧光分析。图中描述了比例尺(20μm)。(b)视网膜下注射编码pr特异性rho启动子控制下egfp的aav2/8载体后一个月来自大白猪的视网膜冷冻切片的荧光分析。图中描述了比例尺(50μm)。ns：aav正常尺寸；ts：双重aav反式剪接；ak：双重aav杂合ak；rpe：视网膜色素上皮；onl：外核层。

图6.视网膜下给予双重aav反式剪接和杂合ak载体导致小鼠感光细胞中稳健但可变的abca4表达水平。

(a)注射编码pr特异性视紫红质启动子(rho)控制下的abca4的双重aav反式剪接(ts)和双重aav杂合ak(ak)载体后一个月c57bl/6视网膜裂解物的western印迹分析。箭头表示全长蛋白质，分子量梯标显示在左侧，各泳道加载150微克蛋白质。显示了分析的视网膜总数中abca4阳性视网膜的数目(n)和百分比。5’+3’：用5’和3’一半载体共感染的细胞；α-3xflag：抗3xflag抗体；α-营养障碍素：抗营养障碍素抗体。(b)对使用双重aav杂合ak载体(ak-abca4；n＝5个眼)或使用aav正常尺寸egfp(egfp；n＝3个眼)作为对照注射的野生型balb/c(wt；n＝3个眼)和abca4-/-小鼠的视网膜切片使用抗ha抗体进行免疫电镜分析。黑色点表示abca4-ha蛋白的免疫金标记。图中描述了比例尺(200mm)。

图7.视网膜下注射双重aav杂合ak载体减少abca4-/-小鼠中的脂褐质颗粒累积。

(a)来自野生型balb/c(wt)和使用双重aav杂合ak载体(abca4-/-ak-abca4)或使用aav正常尺寸egfp(abca4-/-egfp)作为对照注射的abca4-/-小鼠的视网膜切片的透射电镜分析。黑色箭头表示脂褐质颗粒。图中描述了比例尺(1.6μm)。(b)对于各样品，至少30个视野(25μm²)中计数的脂褐质颗粒的平均数目的定量。wt：balb/c小鼠；abca4-/-egfp/5’/3’：使用aav正常尺寸egfp或双重aav杂合ak的5’或3’一半(作为对照)注射的abca4-/-小鼠；abca4-/-ak-abca4：使用双重aav杂合ak载体注射的小鼠；abca4-/-ts-abca4：使用双重aav反式剪接载体注射的小鼠。描述了经分析的眼数目(n)。平均值描述于相应柱上方。误差线：平均值±s.e.m.(平均值的标准误)。*panova<0.05。

图8.视网膜下注射双重aav杂合ak载体降低abca4-/-rpe的厚度。

来自使用双重aav反式剪接(ts-abca4)和杂合ak载体(ak-abca4)或使用aav正常尺寸egfp(egfp)和双重杂合ak载体的5’或3’一半(5’/3’)作为对照注射的abca4-/-小鼠和野生型balb/c(wt)的视网膜切片的透射电镜分析的代表性图片。虚线表示rpe细胞的边缘。图中描述了比例尺(3.8μm)。(b)对于各样品，至少30个视野中计数的平均rpe厚度的定量。描述了经分析的眼数目(n)。平均值描述于相应柱上方。误差线：平均值±s.e.m.(平均值的标准误)。s.d.m：wt:±716；ts-abca4:±698。

图9.视网膜下给予双重aav反式剪接和杂合ak载体导致小鼠中稳健的myo7a表达。

(a)注射编码遍在鸡β-肌动蛋白(cba)启动子控制下的myo7a-ha的双重aav反式剪接(ts)和杂合ak(ak)载体一个月后c57bl/6洗眼杯的western印迹分析。箭头表示全长蛋白质，分子量梯标显示在左侧，各泳道加载100微克蛋白质。显示了分析的视网膜总数中myo7a阳性洗眼杯的数目(n)和百分比。5’+3’：用5’和3’一半载体共注射的眼；5’：用5’一半载体注射的眼；3’：用3’一半载体注射的眼；α-ha：抗血凝素(ha)抗体；α-营养障碍素：抗营养障碍素抗体。

图10.视网膜下给予双重aav反式剪接和杂合ak载体拯救sh1sh1-/-rpe中的黑素体定位。

(a)使用aav正常尺寸egfp(egfp，n＝4个眼)注射的sh1+/+和sh1+/-眼以及使用双重aav反式剪接(ts-myo7a，n＝3个眼)、杂合ak(ak-myo7a；n＝3个眼)或5’一半载体(5’ts/5’ak，n＝3个眼)作为对照注射的sh1-/-眼的环氧化合物(epoxy)组织染色的代表性半薄视网膜切片。图中描述了比例尺(10mm)。(b)视网膜下递送双重aav载体后两个月sh1小鼠的rpe绒毛中黑素体定位的定量。该定量描述为顶部黑素体的平均数目/视野，平均值示于相应柱上方。误差线：平均值±s.e.m.(平均值的标准误)。*panova<0.05，**panova<0.001。

图11.视网膜下给予双重aav反式剪接和杂合ak载体减少sh1-/-pr衔接纤毛处的视紫红质累积。

视网膜下递送双重aav载体后两个月sh1小鼠的pr衔接纤毛处视紫红质金颗粒数目的定量。该定量描述为单位衔接纤毛长度(nm)的平均金颗粒数目，平均值描述于相应柱上。误差线：平均值±s.e.m.(平均值的标准误)。

图12.双重aav反式剪接和杂合ak载体有效地在体外转导大基因cep290。

使用编码在其c端具有血凝素(ha)标签的cep290的aav2/2载体感染的hek293细胞的western印迹(a-b)。(a)箭头表示全长蛋白质，各泳道加载了60微克蛋白质，分子量梯标显示在左侧。(b)cep290蛋白条带的定量。将cep290条带的强度除以细丝蛋白a条带的强度。直方图显示相对于双重aav反式剪接(ts)载体的百分比形式的蛋白质表达，平均值显示在相应柱上方。误差线：平均值±s.e.m.(平均值的标准误)。western印迹图像代表来自n＝5次独立实验的定量。ov：双重aav重叠；ts：双重aav反式剪接；ak：双重aav杂合ak；5’+3’：用5’和3’一半载体共感染的细胞；3’：仅用3’一半感染的对照细胞；α-ha：抗ha抗体；α-细丝蛋白a：抗细丝蛋白a抗体。

图13.使用双重aav反式剪接和杂合ak载体治疗的3月龄abca4-/-小鼠从光脱敏恢复的改善

注射后6周时abca4-/-和balb/c小鼠中从光脱敏恢复。相对b-波是脱敏后和脱敏前b-波振幅(μv)的比例，其都由1cds/m²诱发。时间(分钟)指脱敏后时间。描述了60分钟时的平均恢复率(％)。panovaabca4-/-ak-abca4对比abca4-/-未注射/5’：0.05；panovaabca4-/-ts-abca4对比abca4-/-未注射/5’：0.009；panovaabca4-/-ak-abca4对比wt：0.002；panovaabca4-/-ts-abca4对比wt：0.02；panovawt对比abca4-/-未注射/5’：0.00001。wt：balb/c小鼠(n＝4)；abca4-/-ts-abca4：使用双重aav反式剪接载体注射的小鼠(n＝5)；abca4-/-ak-abca4：使用双重aav杂合ak载体注射的小鼠(n＝5)；abca4-/-未注射/5’：未注射的abca4-/-小鼠(n＝2)或使用双重aavts或杂合ak载体的5’一半注射的小鼠(n＝5)。数据显示为平均值±s.e.m(该平均值的标准误)。*panova<0.05。

图14.双重aav杂合ak载体在sh1-/-感光细胞中诱导比双重aav反式剪接载体更强的myo7a表达。

相对于sh1+/+眼中表达的内源性myo7a，sh1-/-眼中双重aav载体的myo7a水平的定量。使用编码cba(左图)或rho(右图)启动子控制下的myo7a的双重aavts和杂合ak载体注射sh1-/-眼。直方图显示相对于sh1+/+myo7a的myo7a蛋白表达(百分比形式)；平均值描述于相应柱上方。使用抗myo7a抗体通过western印迹分析进行定量且将myo7a和myo7a条带强度的测量标准化至营养障碍素(数据未显示)。误差线：平均值±s.d.m.(平均值的标准偏差)。定量代表：i.左图：n＝2sh1+/+洗眼杯，且n＝5或n＝1分别用ts-myo7a或ak-myo7a治疗的sh1-/-洗眼杯；ii.右图：n＝2sh1+/+视网膜，且n＝1或n＝3分别用ts-myo7a或ak-myo7a治疗的sh1-/-视网膜。**p斯氏t检验小于0.001。

图15.小鼠中视网膜下递送后aav正常尺寸、双重aav反式剪接和杂合ak载体提供最稳健的转导。

视网膜下注射编码egfp的aav2/8载体后c57bl/6眼的活体成像眼底荧光。nz：正常尺寸；oz：超大型；ts：双重aav反式剪接；ap：双重aav杂合ap；ak：双重aav杂合ak。各组图显示不同的眼。

图16.向猪视网膜递送双重aav反式剪接和杂合ak载体后稳健的abca4和myo7a表达。(a)注射感光细胞特异性视紫红质(rho)启动子控制下的编码nsegfp的aav2/8载体(neg)(作为阴性对照)或编码abca4-3xflag的aav2/8反式剪接(ts；n＝2)和杂合ak(ak；n＝3)载体后一个月大白猪视网膜裂解物的western印迹分析。(b)注射遍在鸡β肌动蛋白(cba)启动子控制下编码myo7a-ha的双重aav2/8反式剪接(ts：n＝5rpe；n＝3视网膜)和杂合ak(ak:n＝5rpe，n＝5视网膜)载体或双重aav-myo7a-ha的单个3’一半(neg)(作为阴性对照)后一个月大白猪视网膜裂解物的western印迹分析。(a–b)箭头表示全长蛋白质，分子量梯标显示在左侧，各泳道加载150–180μg蛋白质。α-3xflag：抗3xflag抗体；α-ha：抗血凝素抗体；α-营养障碍素：抗营养障碍素抗体。

图17.具有异源itr的双重aav杂合ak载体在体外转导大基因。(a)具有异源itr2和itr5的双重aav杂合ak载体的设计。(b)使用编码abca4(左图)和myo7a(右图)的具有异源itr的双重aav杂合ak载体感染的hek293细胞的western印迹分析。箭头表示全长蛋白质，加载了50微克蛋白质，分子量梯标显示在左侧。5’+3’：用5’和3’一半载体共感染的细胞；5’：仅用5’一半载体感染的细胞；3’：仅用3’一半载体感染的细胞；neg：用编码egfp的aav2/8载体感染的细胞。α-3xflag：抗3xflag抗体；α-myo7a：抗myo7a抗体；α-细丝蛋白：抗细丝蛋白a抗体。(a)prom：启动子；cds：编码序列；pa：聚腺苷酰化信号；sd：剪接供体信号；sa：剪接受体信号；点线显示可用于同源重组的重叠区域，虚线显示sd和sa之间发生的剪接。描述了异源itr2和itr5的位置。

发明详述

材料和方法

aav载体质粒的生成

用于aav载体生产的质粒衍生自pzac2.1(52)或paav2.1(53)质粒，其含有aav血清型2的反向末端重复(itr)(表1)。

表1.用于aav载体生产的质粒

n.b.cmv：巨细胞病毒启动子；cba：鸡β-肌动蛋白；rho：人视紫红质启动子；rhok：人视紫红质激酶启动子；vmd2：卵黄状黄斑营养不良2启动子；egfp：强化绿色荧光蛋白；abca4：人atp-结合盒，亚家族a，成员4；myo7a：人肌凝蛋白(myosin)viia；sv40：猿猴病毒40聚腺苷酰化信号；bgh：牛生长激素聚腺苷酰化信号；3xflag：3xflag标签；ha：血凝素标签；ap：碱性磷酸酶重组发生区；ak：f1噬菌体重组发生区；ts：反式剪接；itr5:2：具有来自aav血清型5的左itr和来自aav血清型2的由itr的质粒；itr2:5：具有来自aav血清型2的左itr和来自aav血清型5的由itr的质粒。如果没有特别说明，左和右itr来自aav血清型2。

正常尺寸和超大型aav载体质粒含有全长表达盒，其包含启动子、全长转基因cds和聚腺苷酰化信号(pa)(表1)。生成双重aav载体所需的两个单独的aav载体质粒(5’和3’)含有启动子以及之后的转基因cds的n端部分(5’质粒)或转基因cds的c端部分以及之后的pa信号(3’质粒，表1)。通过在pzac2.1(52)中克隆paav2.1-cmv-egfp质粒(720bp)(53)的egfpcds来生成正常尺寸egfp质粒；通过将来自人abca4(nm_000350.2,bp1960-5591)的3632bp的dna填充序列插入cmv启动子的上游并将由鼠abca4(nm007378.1，1066-1和7124-6046bp；总共2145bp)和人harmonin(nm153676.3131-1606bp；总共1476bp)组成的3621bp的第二dna填充序列插入pa信号的下游来从paav2.1-cmv-egfp(53)生成超大型egfp(该构建体用于图1a、d，图4和图15的实验)。为生成双重aav载体质粒，将egfpcds(720bp)分割为两个构建体：一个含有n端cds(pmid:9759496,bp1-393)且另一个含有c端cds(pmid:9759496,bp394-720)。

超大型abca4质粒含有全长人abca4cds(genenm_000350.2,bp105-6926)，而超大型myo7a质粒含有来自同种型1的全长人myo7acds(nm_000260.3,bp273-6920)。为生成用于双重aavov载体的质粒，将abca4和myo7acds分割为两个构建体，一个含有n端cds(abca4：nm_000350.2,bp105-3588；myo7a：nm_000350.2,bp273-3782)且另一个含有c端cds(abca4：nm_000350.2,bp2819-6926；myo7a：nm_000350.2,bp2913-6920)。因此，重叠的载体质粒共有的同源性区域是770bp(abca4)和870bp(myo7a)。为生产双重aavov载体的质粒，将人cep290cds分割为两个构建体，一个含有n端cds(cep290：nm_025114,bp345-4076)且另一个含有c端cds(cep290：nm_025114,bp3575-7784)。因此，重叠的载体质粒共有的同源性区域是502bp。

为生成反式剪接和杂合载体质粒，在天然的外显子-外显子连接点处分割abca4和myo7acds。abca4在外显子19-20处分割(5’一半：nm_000350.2,105-3022bp；3’一半：nm_000350.2,bp3023-6926)且myo7a在外显子24-25处分割(5’一半：nm_000350.2,bp273-3380；3’一半：nm_000350.2,bp3381-6926)。abca4和myo7a都在其c端连接标签：abca4具有3xflag(gactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatgacaag)或血凝素(ha)标签(tatccgtatgatgtgccggattatgcg)；myo7a仅具有ha标签。为生成反式剪接和杂合载体质粒，在天然的外显子-外显子连接点处(外显子29-30)分割cep290cds(5’一半：nm_025114,345-3805；3’一半：nm_025114,3806-7784)。cep290蛋白在其c端处具有血凝素(ha)标签。反式剪接和杂合双重aav载体质粒中含有的剪接供体(sd)和剪接受体(sa)信号如下：5’gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttct-3’(sd)seqidno.1；5’gataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag-3’(sa),seqidno.2。杂合ap载体质粒中含有的重组发生序列(存在于第一和第二质粒中)衍生自碱性磷酸酶(ap)基因(nm_001632,bp823-1100)，如先前所述(39)。杂合ak载体质粒中含有的重组发生序列(存在于第一和第二质粒中)衍生自噬菌体f1基因组(genebank登录号：j02448.1；bp5850-5926)。ak序列是：

5’gggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaat-3’，seqidno.3。

遍在cmv启动子包含在pzac2.1(52)或paav2.1-cmv-egfp(53)中；遍在cba启动子衍生自paav2.1-cba-egfp(11)，pr特异性人rho和rhok启动子分别衍生自paav2.1-rho-egfp和paav2.1rhok-egfp(10)；rpe特异性vmd2启动子(ng_009033.1,4870-5470bp)对应于先前描述的ecori-xcmi启动子片段(41)并由人基因组dna扩增。

为生成具有来自aav血清型2和5的异源itr的双重aav杂合ak载体，我们用itr5替换5’一半载体的左itr2和3’一半载体的右itr2(如图17a所述)。使用异源性itr生产aav2载体的质粒如下pzac5:2-cmv-5’abca4-sd-ak、pzac2:5-ak-sd-3’abca4-3xflag、paav5:2-cba-5’myo7a-sd-ak和paav2:5-ak-sd-3’myo7a-ha(表1)。

序列

abca4基因

pzac2.1-cmv-abca4_5’ak

左itr2

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct(seqidno.4)

左itr5

ctctcccccctgtcgcgttcgctcgctcgctggctcgtttgggggggtggcagctcaaagagctgccagacgacggccctctggccgtcgcccccccaaacgagccagcgagcgagcgaacgcgacaggggggagagtgccacactctcaagcaagggggttttgtaagcagtga(seqidno.5)

cmv增强子

tcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttggcattgattattgac(seqidno.6)

cmv启动子

tagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgt(seqidno.7)

嵌合内含子

gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag(seqidno.8)

abca45’

atgggcttcgtgagacagatacagcttttgctctggaagaactggaccctgcggaaaaggcaaaagattcgctttgtggtggaactcgtgtggcctttatctttatttctggtcttgatctggttaaggaatgccaacccgctctacagccatcatgaatgccatttccccaacaaggcgatgccctcagcaggaatgctgccgtggctccaggggatcttctgcaatgtgaacaatccctgttttcaaagccccaccccaggagaatctcctggaattgtgtcaaactataacaactccatcttggcaagggtatatcgagattttcaagaactcctcatgaatgcaccagagagccagcaccttggccgtatttggacagagctacacatcttgtcccaattcatggacaccctccggactcacccggagagaattgcaggaagaggaattcgaataagggatatcttgaaagatgaagaaacactgacactatttctcattaaaaacatcggcctgtctgactcagtggtctaccttctgatcaactctcaagtccgtccagagcagttcgctcatggagtcccggacctggcgctgaaggacatcgcctgcagcgaggccctcctggagcgcttcatcatcttcagccagagacgcggggcaaagacggtgcgctatgccctgtgctccctctcccagggcaccctacagtggatagaagacactctgtatgccaacgtggacttcttcaagctcttccgtgtgcttcccacactcctagacagccgttctcaaggtatcaatctgagatcttggggaggaatattatctgatatgtcaccaagaattcaagagtttatccatcggccgagtatgcaggacttgctgtgggtgaccaggcccctcatgcagaatggtggtccagagacctttacaaagctgatgggcatcctgtctgacctcctgtgtggctaccccgagggaggtggctctcgggtgctctccttcaactggtatgaagacaataactataaggcctttctggggattgactccacaaggaaggatcctatctattcttatgacagaagaacaacatccttttgtaatgcattgatccagagcctggagtcaaatcctttaaccaaaatcgcttggagggcggcaaagcctttgctgatgggaaaaatcctgtacactcctgattcacctgcagcacgaaggatactgaagaatgccaactcaacttttgaagaactggaacacgttaggaagttggtcaaagcctgggaagaagtagggccccagatctggtacttctttgacaacagcacacagatgaacatgatcagagataccctggggaacccaacagtaaaagactttttgaataggcagcttggtgaagaaggtattactgctgaagccatcctaaacttcctctacaagggccctcgggaaagccaggctgacgacatggccaacttcgactggagggacatatttaacatcactgatcgcaccctccgccttgtcaatcaatacctggagtgcttggtcctggataagtttgaaagctacaatgatgaaactcagctcacccaacgtgccctctctctactggaggaaaacatgttctgggccggagtggtattccctgacatgtatccctggaccagctctctaccaccccacgtgaagtataagatccgaatggacatagacgtggtggagaaaaccaataagattaaagacaggtattgggattctggtcccagagctgatcccgtggaagatttccggtacatctggggcgggtttgcctatctgcaggacatggttgaacaggggatcacaaggagccaggtgcaggcggaggctccagttggaatctacctccagcagatgccctacccctgcttcgtggacgattctttcatgatcatcctgaaccgctgtttccctatcttcatggtgctggcatggatctactctgtctccatgactgtgaagagcatcgtcttggagaaggagttgcgactgaaggagaccttgaaaaatcagggtgtctccaatgcagtgatttggtgtacctggttcctggacagcttctccatcatgtcgatgagcatcttcctcctgacgatattcatcatgcatggaagaatcctacattacagcgacccattcatcctcttcctgttcttgttggctttctccactgccaccatcatgctgtgctttctgctcagcaccttcttctccaaggccagtctggcagcagcctgtagtggtgtcatctatttcaccctctacctgccacacatcctgtgcttcgcctggcaggaccgcatgaccgctgagctgaagaaggctgtgagcttactgtctccggtggcatttggatttggcactgagtacctggttcgctttgaagagcaaggcctggggctgcagtggagcaacatcgggaacagtcccacggaaggggacgaattcagcttcctgctgtccatgcagatgatgctccttgatgctgctgtctatggcttactcgcttggtaccttgatcaggtgtttccaggagactatggaaccccacttccttggtactttcttctacaagagtcgtattggcttggcggtgaagggtgttcaaccagagaagaaagagccctggaaaagaccgagcccctaacagaggaaacggaggatccagagcacccagaaggaatacacgactccttctttgaacgtgagcatccagggtgggttcctggggtatgcgtgaagaatctggtaaagatttttgagccctgtggccggccagctgtggaccgtctgaacatcaccttctacgagaaccagatcaccgcattcctgggccacaatggagctgggaaaaccaccacctt(seqidno.9)

剪接供体信号

gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttct(seqidno.1)

ak

gggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaat(seqidno.3)

右itr2(或5’itr2)

aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.10)

pzac2.1-cmv-abca4_5’ak的全长序列

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcttcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttggcattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcactagaagctttattgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcagtgcttctgacacaacagtctcgaacttaagctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattacagctcttaaggctagagtacttaatacgactcactataggctagcctcgagaattcacgcgtggtacctctagagtcgacccgggcggccgccatgggcttcgtgagacagatacagcttttgctctggaagaactggaccctgcggaaaaggcaaaagattcgctttgtggtggaactcgtgtggcctttatctttatttctggtcttgatctggttaaggaatgccaacccgctctacagccatcatgaatgccatttccccaacaaggcgatgccctcagcaggaatgctgccgtggctccaggggatcttctgcaatgtgaacaatccctgttttcaaagccccaccccaggagaatctcctggaattgtgtcaaactataacaactccatcttggcaagggtatatcgagattttcaagaactcctcatgaatgcaccagagagccagcaccttggccgtatttggacagagctacacatcttgtcccaattcatggacaccctccggactcacccggagagaattgcaggaagaggaattcgaataagggatatcttgaaagatgaagaaacactgacactatttctcattaaaaacatcggcctgtctgactcagtggtctaccttctgatcaactctcaagtccgtccagagcagttcgctcatggagtcccggacctggcgctgaaggacatcgcctgcagcgaggccctcctggagcgcttcatcatcttcagccagagacgcggggcaaagacggtgcgctatgccctgtgctccctctcccagggcaccctacagtggatagaagacactctgtatgccaacgtggacttcttcaagctcttccgtgtgcttcccacactcctagacagccgttctcaaggtatcaatctgagatcttggggaggaatattatctgatatgtcaccaagaattcaagagtttatccatcggccgagtatgcaggacttgctgtgggtgaccaggcccctcatgcagaatggtggtccagagacctttacaaagctgatgggcatcctgtctgacctcctgtgtggctaccccgagggaggtggctctcgggtgctctccttcaactggtatgaagacaataactataaggcctttctggggattgactccacaaggaaggatcctatctattcttatgacagaagaacaacatccttttgtaatgcattgatccagagcctggagtcaaatcctttaaccaaaatcgcttggagggcggcaaagcctttgctgatgggaaaaatcctgtacactcctgattcacctgcagcacgaaggatactgaagaatgccaactcaacttttgaagaactggaacacgttaggaagttggtcaaagcctgggaagaagtagggccccagatctggtacttctttgacaacagcacacagatgaacatgatcagagataccctggggaacccaacagtaaaagactttttgaataggcagcttggtgaagaaggtattactgctgaagccatcctaaacttcctctacaagggccctcgggaaagccaggctgacgacatggccaacttcgactggagggacatatttaacatcactgatcgcaccctccgccttgtcaatcaatacctggagtgcttggtcctggataagtttgaaagctacaatgatgaaactcagctcacccaacgtgccctctctctactggaggaaaacatgttctgggccggagtggtattccctgacatgtatccctggaccagctctctaccaccccacgtgaagtataagatccgaatggacatagacgtggtggagaaaaccaataagattaaagacaggtattgggattctggtcccagagctgatcccgtggaagatttccggtacatctggggcgggtttgcctatctgcaggacatggttgaacaggggatcacaaggagccaggtgcaggcggaggctccagttggaatctacctccagcagatgccctacccctgcttcgtggacgattctttcatgatcatcctgaaccgctgtttccctatcttcatggtgctggcatggatctactctgtctccatgactgtgaagagcatcgtcttggagaaggagttgcgactgaaggagaccttgaaaaatcagggtgtctccaatgcagtgatttggtgtacctggttcctggacagcttctccatcatgtcgatgagcatcttcctcctgacgatattcatcatgcatggaagaatcctacattacagcgacccattcatcctcttcctgttcttgttggctttctccactgccaccatcatgctgtgctttctgctcagcaccttcttctccaaggccagtctggcagcagcctgtagtggtgtcatctatttcaccctctacctgccacacatcctgtgcttcgcctggcaggaccgcatgaccgctgagctgaagaaggctgtgagcttactgtctccggtggcatttggatttggcactgagtacctggttcgctttgaagagcaaggcctggggctgcagtggagcaacatcgggaacagtcccacggaaggggacgaattcagcttcctgctgtccatgcagatgatgctccttgatgctgctgtctatggcttactcgcttggtaccttgatcaggtgtttccaggagactatggaaccccacttccttggtactttcttctacaagagtcgtattggcttggcggtgaagggtgttcaaccagagaagaaagagccctggaaaagaccgagcccctaacagaggaaacggaggatccagagcacccagaaggaatacacgactccttctttgaacgtgagcatccagggtgggttcctggggtatgcgtgaagaatctggtaaagatttttgagccctgtggccggccagctgtggaccgtctgaacatcaccttctacgagaaccagatcaccgcattcctgggccacaatggagctgggaaaaccaccaccttgtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttccaattgaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.11)

pzac2.1-abca4_3’ak_sv40

左itr2

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct(seqidno.4)

ak

gggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaat(seqidno.3)

剪接受体信号

gataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag(seqidno.2)

abca4_3’

gtccatcctgacgggtctgttgccaccaacctctgggactgtgctcgttgggggaagggacattgaaaccagcctggatgcagtccggcagagccttggcatgtgtccacagcacaacatcctgttccaccacctcacggtggctgagcacatgctgttctatgcccagctgaaaggaaagtcccaggaggaggcccagctggagatggaagccatgttggaggacacaggcctccaccacaagcggaatgaagaggctcaggacctatcaggtggcatgcagagaaagctgtcggttgccattgcctttgtgggagatgccaaggtggtgattctggacgaacccacctctggggtggacccttactcgagacgctcaatctgggatctgctcctgaagtatcgctcaggcagaaccatcatcatgtccactcaccacatggacgaggccgacctccttggggaccgcattgccatcattgcccagggaaggctctactgctcaggcaccccactcttcctgaagaactgctttggcacaggcttgtacttaaccttggtgcgcaagatgaaaaacatccagagccaaaggaaaggcagtgaggggacctgcagctgctcgtctaagggtttctccaccacgtgtccagcccacgtcgatgacctaactccagaacaagtcctggatggggatgtaaatgagctgatggatgtagttctccaccatgttccagaggcaaagctggtggagtgcattggtcaagaacttatcttccttcttccaaataagaacttcaagcacagagcatatgccagccttttcagagagctggaggagacgctggctgaccttggtctcagcagttttggaatttctgacactcccctggaagagatttttctgaaggtcacggaggattctgattcaggacctctgtttgcgggtggcgctcagcagaaaagagaaaacgtcaacccccgacacccctgcttgggtcccagagagaaggctggacagacaccccaggactccaatgtctgctccccaggggcgccggctgctcacccagagggccagcctcccccagagccagagtgcccaggcccgcagctcaacacggggacacagctggtcctccagcatgtgcaggcgctgctggtcaagagattccaacacaccatccgcagccacaaggacttcctggcgcagatcgtgctcccggctacctttgtgtttttggctctgatgctttctattgttatccctccttttggcgaataccccgctttgacccttcacccctggatatatgggcagcagtacaccttcttcagcatggatgaaccaggcagtgagcagttcacggtacttgcagacgtcctcctgaataagccaggctttggcaaccgctgcctgaaggaagggtggcttccggagtacccctgtggcaactcaacaccctggaagactccttctgtgtccccaaacatcacccagctgttccagaagcagaaatggacacaggtcaacccttcaccatcctgcaggtgcagcaccagggagaagctcaccatgctgccagagtgccccgagggtgccgggggcctcccgcccccccagagaacacagcgcagcacggaaattctacaagacctgacggacaggaacatctccgacttcttggtaaaaacgtatcctgctcttataagaagcagcttaaagagcaaattctgggtcaatgaacagaggtatggaggaatttccattggaggaaagctcccagtcgtccccatcacgggggaagcacttgttgggtttttaagcgaccttggccggatcatgaatgtgagcgggggccctatcactagagaggcctctaaagaaatacctgatttccttaaacatctagaaactgaagacaacattaaggtgtggtttaataacaaaggctggcatgccctggtcagctttctcaatgtggcccacaacgccatcttacgggccagcctgcctaaggacagaagccccgaggagtatggaatcaccgtcattagccaacccctgaacctgaccaaggagcagctctcagagattacagtgctgaccacttcagtggatgctgtggttgccatctgcgtgattttctccatgtccttcgtcccagccagctttgtcctttatttgatccaggagcgggtgaacaaatccaagcacctccagtttatcagtggagtgagccccaccacctactgggtaaccaacttcctctgggacatcatgaattattccgtgagtgctgggctggtggtgggcatcttcatcgggtttcagaagaaagcctacacttctccagaaaaccttcctgcccttgtggcactgctcctgctgtatggatgggcggtcattcccatgatgtacccagcatccttcctgtttgatgtccccagcacagcctatgtggctttatcttgtgctaatctgttcatcggcatcaacagcagtgctattaccttcatcttggaattatttgagaataaccggacgctgctcaggttcaacgccgtgctgaggaagctgctcattgtcttcccccacttctgcctgggccggggcctcattgaccttgcactgagccaggctgtgacagatgtctatgcccggtttggtgaggagcactctgcaaatccgttccactgggacctgattgggaagaacctgtttgccatggtggtggaaggggtggtgtacttcctcctgaccctgctggtccagcgccacttcttcctctcccaatggattgccgagcccactaaggagcccattgttgatgaagatgatgatgtggctgaagaaagacaaagaattattactggtggaaataaaactgacatcttaaggctacatgaactaaccaagatttatccaggcacctccagcccagcagtggacaggctgtgtgtcggagttcgccctggagagtgctttggcctcctgggagtgaatggtgccggcaaaacaaccacattcaagatgctcactggggacaccacagtgacctcaggggatgccaccgtagcaggcaagagtattttaaccaatatttctgaagtccatcaaaatatgggctactgtcctcagtttgatgcaatcgatgagctgctcacaggacgagaacatctttacctttatgcccggcttcgaggtgtaccagcagaagaaatcgaaaaggttgcaaactggagtattaagagcctgggcctgactgtctacgccgactgcctggctggcacgtacagtgggggcaacaagcggaaactctccacagccatcgcactcattggctgcccaccgctggtgctgctggatgagcccaccacagggatggacccccaggcacgccgcatgctgtggaacgtcatcgtgagcatcatcagagaagggagggctgtggtcctcacatcccacagcatggaagaatgtgaggcactgtgtacccggctggccatcatggtaaagggcgcctttcgatgtatgggcaccattcagcatctcaagtccaaatttggagatggctatatcgtcacaatgaagatcaaatccccgaaggacgacctgcttcctgacctgaaccctgtggagcagttcttccaggggaacttcccaggcagtgtgcagagggagaggcactacaacatgctccagttccaggtctcctcctcctccctggcgaggatcttccagctcctcctctcccacaaggacagcctgctcatcgaggagtactcagtcacacagaccacactggaccaggtgtttgtaaattttgctaaacagcagactgaaagtcatgacctccctctgcaccctcgagctgctggagccagtcgacaagcccaggacgactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatgacaagtgagcggccgc(seqidno.12)

sv40聚a

ttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagatgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatcgataaggatcttcctagagcatggctac(seqidno.13)

右itr2

aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.10)

右itr5

tcactgcttacaaaacccccttgcttgagagtgtggcactctcccccctgtcgcgttcgctcgctcgctggctcgtttgggggggcgacggccagagggccgtcgtctggcagctctttgagctgccacccccccaaacgagccagcgagcgagcgaacgcgacaggggggagag(seqidno.14)

pzac2.1-abca4_3’ak_sv40的全长序列

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctggatccgggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttcgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtccatcctgacgggtctgttgccaccaacctctgggactgtgctcgttgggggaagggacattgaaaccagcctggatgcagtccggcagagccttggcatgtgtccacagcacaacatcctgttccaccacctcacggtggctgagcacatgctgttctatgcccagctgaaaggaaagtcccaggaggaggcccagctggagatggaagccatgttggaggacacaggcctccaccacaagcggaatgaagaggctcaggacctatcaggtggcatgcagagaaagctgtcggttgccattgcctttgtgggagatgccaaggtggtgattctggacgaacccacctctggggtggacccttactcgagacgctcaatctgggatctgctcctgaagtatcgctcaggcagaaccatcatcatgtccactcaccacatggacgaggccgacctccttggggaccgcattgccatcattgcccagggaaggctctactgctcaggcaccccactcttcctgaagaactgctttggcacaggcttgtacttaaccttggtgcgcaagatgaaaaacatccagagccaaaggaaaggcagtgaggggacctgcagctgctcgtctaagggtttctccaccacgtgtccagcccacgtcgatgacctaactccagaacaagtcctggatggggatgtaaatgagctgatggatgtagttctccaccatgttccagaggcaaagctggtggagtgcattggtcaagaacttatcttccttcttccaaataagaacttcaagcacagagcatatgccagccttttcagagagctggaggagacgctggctgaccttggtctcagcagttttggaatttctgacactcccctggaagagatttttctgaaggtcacggaggattctgattcaggacctctgtttgcgggtggcgctcagcagaaaagagaaaacgtcaacccccgacacccctgcttgggtcccagagagaaggctggacagacaccccaggactccaatgtctgctccccaggggcgccggctgctcacccagagggccagcctcccccagagccagagtgcccaggcccgcagctcaacacggggacacagctggtcctccagcatgtgcaggcgctgctggtcaagagattccaacacaccatccgcagccacaaggacttcctggcgcagatcgtgctcccggctacctttgtgtttttggctctgatgctttctattgttatccctccttttggcgaataccccgctttgacccttcacccctggatatatgggcagcagtacaccttcttcagcatggatgaaccaggcagtgagcagttcacggtacttgcagacgtcctcctgaataagccaggctttggcaaccgctgcctgaaggaagggtggcttccggagtacccctgtggcaactcaacaccctggaagactccttctgtgtccccaaacatcacccagctgttccagaagcagaaatggacacaggtcaacccttcaccatcctgcaggtgcagcaccagggagaagctcaccatgctgccagagtgccccgagggtgccgggggcctcccgcccccccagagaacacagcgcagcacggaaattctacaagacctgacggacaggaacatctccgacttcttggtaaaaacgtatcctgctcttataagaagcagcttaaagagcaaattctgggtcaatgaacagaggtatggaggaatttccattggaggaaagctcccagtcgtccccatcacgggggaagcacttgttgggtttttaagcgaccttggccggatcatgaatgtgagcgggggccctatcactagagaggcctctaaagaaatacctgatttccttaaacatctagaaactgaagacaacattaaggtgtggtttaataacaaaggctggcatgccctggtcagctttctcaatgtggcccacaacgccatcttacgggccagcctgcctaaggacagaagccccgaggagtatggaatcaccgtcattagccaacccctgaacctgaccaaggagcagctctcagagattacagtgctgaccacttcagtggatgctgtggttgccatctgcgtgattttctccatgtccttcgtcccagccagctttgtcctttatttgatccaggagcgggtgaacaaatccaagcacctccagtttatcagtggagtgagccccaccacctactgggtaaccaacttcctctgggacatcatgaattattccgtgagtgctgggctggtggtgggcatcttcatcgggtttcagaagaaagcctacacttctccagaaaaccttcctgcccttgtggcactgctcctgctgtatggatgggcggtcattcccatgatgtacccagcatccttcctgtttgatgtccccagcacagcctatgtggctttatcttgtgctaatctgttcatcggcatcaacagcagtgctattaccttcatcttggaattatttgagaataaccggacgctgctcaggttcaacgccgtgctgaggaagctgctcattgtcttcccccacttctgcctgggccggggcctcattgaccttgcactgagccaggctgtgacagatgtctatgcccggtttggtgaggagcactctgcaaatccgttccactgggacctgattgggaagaacctgtttgccatggtggtggaaggggtggtgtacttcctcctgaccctgctggtccagcgccacttcttcctctcccaatggattgccgagcccactaaggagcccattgttgatgaagatgatgatgtggctgaagaaagacaaagaattattactggtggaaataaaactgacatcttaaggctacatgaactaaccaagatttatccaggcacctccagcccagcagtggacaggctgtgtgtcggagttcgccctggagagtgctttggcctcctgggagtgaatggtgccggcaaaacaaccacattcaagatgctcactggggacaccacagtgacctcaggggatgccaccgtagcaggcaagagtattttaaccaatatttctgaagtccatcaaaatatgggctactgtcctcagtttgatgcaatcgatgagctgctcacaggacgagaacatctttacctttatgcccggcttcgaggtgtaccagcagaagaaatcgaaaaggttgcaaactggagtattaagagcctgggcctgactgtctacgccgactgcctggctggcacgtacagtgggggcaacaagcggaaactctccacagccatcgcactcattggctgcccaccgctggtgctgctggatgagcccaccacagggatggacccccaggcacgccgcatgctgtggaacgtcatcgtgagcatcatcagagaagggagggctgtggtcctcacatcccacagcatggaagaatgtgaggcactgtgtacccggctggccatcatggtaaagggcgcctttcgatgtatgggcaccattcagcatctcaagtccaaatttggagatggctatatcgtcacaatgaagatcaaatccccgaaggacgacctgcttcctgacctgaaccctgtggagcagttcttccaggggaacttcccaggcagtgtgcagagggagaggcactacaacatgctccagttccaggtctcctcctcctccctggcgaggatcttccagctcctcctctcccacaaggacagcctgctcatcgaggagtactcagtcacacagaccacactggaccaggtgtttgtaaattttgctaaacagcagactgaaagtcatgacctccctctgcaccctcgagctgctggagccagtcgacaagcccaggactgagcggccgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagatgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatcgataaggatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.15)

pzac2.1-cmv-abca4_5’ts

pzac2.1-cmv-abca4_5’ts的全长序列

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcttcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttggcattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcactagaagctttattgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcagtgcttctgacacaacagtctcgaacttaagctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattacagctcttaaggctagagtacttaatacgactcactataggctagcctcgagaattcacgcgtggtacctctagagtcgacccgggcggccgccatgggcttcgtgagacagatacagcttttgctctggaagaactggaccctgcggaaaaggcaaaagattcgctttgtggtggaactcgtgtggcctttatctttatttctggtcttgatctggttaaggaatgccaacccgctctacagccatcatgaatgccatttccccaacaaggcgatgccctcagcaggaatgctgccgtggctccaggggatcttctgcaatgtgaacaatccctgttttcaaagccccaccccaggagaatctcctggaattgtgtcaaactataacaactccatcttggcaagggtatatcgagattttcaagaactcctcatgaatgcaccagagagccagcaccttggccgtatttggacagagctacacatcttgtcccaattcatggacaccctccggactcacccggagagaattgcaggaagaggaattcgaataagggatatcttgaaagatgaagaaacactgacactatttctcattaaaaacatcggcctgtctgactcagtggtctaccttctgatcaactctcaagtccgtccagagcagttcgctcatggagtcccggacctggcgctgaaggacatcgcctgcagcgaggccctcctggagcgcttcatcatcttcagccagagacgcggggcaaagacggtgcgctatgccctgtgctccctctcccagggcaccctacagtggatagaagacactctgtatgccaacgtggacttcttcaagctcttccgtgtgcttcccacactcctagacagccgttctcaaggtatcaatctgagatcttggggaggaatattatctgatatgtcaccaagaattcaagagtttatccatcggccgagtatgcaggacttgctgtgggtgaccaggcccctcatgcagaatggtggtccagagacctttacaaagctgatgggcatcctgtctgacctcctgtgtggctaccccgagggaggtggctctcgggtgctctccttcaactggtatgaagacaataactataaggcctttctggggattgactccacaaggaaggatcctatctattcttatgacagaagaacaacatccttttgtaatgcattgatccagagcctggagtcaaatcctttaaccaaaatcgcttggagggcggcaaagcctttgctgatgggaaaaatcctgtacactcctgattcacctgcagcacgaaggatactgaagaatgccaactcaacttttgaagaactggaacacgttaggaagttggtcaaagcctgggaagaagtagggccccagatctggtacttctttgacaacagcacacagatgaacatgatcagagataccctggggaacccaacagtaaaagactttttgaataggcagcttggtgaagaaggtattactgctgaagccatcctaaacttcctctacaagggccctcgggaaagccaggctgacgacatggccaacttcgactggagggacatatttaacatcactgatcgcaccctccgccttgtcaatcaatacctggagtgcttggtcctggataagtttgaaagctacaatgatgaaactcagctcacccaacgtgccctctctctactggaggaaaacatgttctgggccggagtggtattccctgacatgtatccctggaccagctctctaccaccccacgtgaagtataagatccgaatggacatagacgtggtggagaaaaccaataagattaaagacaggtattgggattctggtcccagagctgatcccgtggaagatttccggtacatctggggcgggtttgcctatctgcaggacatggttgaacaggggatcacaaggagccaggtgcaggcggaggctccagttggaatctacctccagcagatgccctacccctgcttcgtggacgattctttcatgatcatcctgaaccgctgtttccctatcttcatggtgctggcatggatctactctgtctccatgactgtgaagagcatcgtcttggagaaggagttgcgactgaaggagaccttgaaaaatcagggtgtctccaatgcagtgatttggtgtacctggttcctggacagcttctccatcatgtcgatgagcatcttcctcctgacgatattcatcatgcatggaagaatcctacattacagcgacccattcatcctcttcctgttcttgttggctttctccactgccaccatcatgctgtgctttctgctcagcaccttcttctccaaggccagtctggcagcagcctgtagtggtgtcatctatttcaccctctacctgccacacatcctgtgcttcgcctggcaggaccgcatgaccgctgagctgaagaaggctgtgagcttactgtctccggtggcatttggatttggcactgagtacctggttcgctttgaagagcaaggcctggggctgcagtggagcaacatcgggaacagtcccacggaaggggacgaattcagcttcctgctgtccatgcagatgatgctccttgatgctgctgtctatggcttactcgcttggtaccttgatcaggtgtttccaggagactatggaaccccacttccttggtactttcttctacaagagtcgtattggcttggcggtgaagggtgttcaaccagagaagaaagagccctggaaaagaccgagcccctaacagaggaaacggaggatccagagcacccagaaggaatacacgactccttctttgaacgtgagcatccagggtgggttcctggggtatgcgtgaagaatctggtaaagatttttgagccctgtggccggccagctgtggaccgtctgaacatcaccttctacgagaaccagatcaccgcattcctgggccacaatggagctgggaaaaccaccaccttgtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctcaattgaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.16)

pzac2.1-abca4_3’ts_sv40

pzac2.1-abca4_3’ts_sv40的全长序列

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtccatcctgacgggtctgttgccaccaacctctgggactgtgctcgttgggggaagggacattgaaaccagcctggatgcagtccggcagagccttggcatgtgtccacagcacaacatcctgttccaccacctcacggtggctgagcacatgctgttctatgcccagctgaaaggaaagtcccaggaggaggcccagctggagatggaagccatgttggaggacacaggcctccaccacaagcggaatgaagaggctcaggacctatcaggtggcatgcagagaaagctgtcggttgccattgcctttgtgggagatgccaaggtggtgattctggacgaacccacctctggggtggacccttactcgagacgctcaatctgggatctgctcctgaagtatcgctcaggcagaaccatcatcatgtccactcaccacatggacgaggccgacctccttggggaccgcattgccatcattgcccagggaaggctctactgctcaggcaccccactcttcctgaagaactgctttggcacaggcttgtacttaaccttggtgcgcaagatgaaaaacatccagagccaaaggaaaggcagtgaggggacctgcagctgctcgtctaagggtttctccaccacgtgtccagcccacgtcgatgacctaactccagaacaagtcctggatggggatgtaaatgagctgatggatgtagttctccaccatgttccagaggcaaagctggtggagtgcattggtcaagaacttatcttccttcttccaaataagaacttcaagcacagagcatatgccagccttttcagagagctggaggagacgctggctgaccttggtctcagcagttttggaatttctgacactcccctggaagagatttttctgaaggtcacggaggattctgattcaggacctctgtttgcgggtggcgctcagcagaaaagagaaaacgtcaacccccgacacccctgcttgggtcccagagagaaggctggacagacaccccaggactccaatgtctgctccccaggggcgccggctgctcacccagagggccagcctcccccagagccagagtgcccaggcccgcagctcaacacggggacacagctggtcctccagcatgtgcaggcgctgctggtcaagagattccaacacaccatccgcagccacaaggacttcctggcgcagatcgtgctcccggctacctttgtgtttttggctctgatgctttctattgttatccctccttttggcgaataccccgctttgacccttcacccctggatatatgggcagcagtacaccttcttcagcatggatgaaccaggcagtgagcagttcacggtacttgcagacgtcctcctgaataagccaggctttggcaaccgctgcctgaaggaagggtggcttccggagtacccctgtggcaactcaacaccctggaagactccttctgtgtccccaaacatcacccagctgttccagaagcagaaatggacacaggtcaacccttcaccatcctgcaggtgcagcaccagggagaagctcaccatgctgccagagtgccccgagggtgccgggggcctcccgcccccccagagaacacagcgcagcacggaaattctacaagacctgacggacaggaacatctccgacttcttggtaaaaacgtatcctgctcttataagaagcagcttaaagagcaaattctgggtcaatgaacagaggtatggaggaatttccattggaggaaagctcccagtcgtccccatcacgggggaagcacttgttgggtttttaagcgaccttggccggatcatgaatgtgagcgggggccctatcactagagaggcctctaaagaaatacctgatttccttaaacatctagaaactgaagacaacattaaggtgtggtttaataacaaaggctggcatgccctggtcagctttctcaatgtggcccacaacgccatcttacgggccagcctgcctaaggacagaagccccgaggagtatggaatcaccgtcattagccaacccctgaacctgaccaaggagcagctctcagagattacagtgctgaccacttcagtggatgctgtggttgccatctgcgtgattttctccatgtccttcgtcccagccagctttgtcctttatttgatccaggagcgggtgaacaaatccaagcacctccagtttatcagtggagtgagccccaccacctactgggtaaccaacttcctctgggacatcatgaattattccgtgagtgctgggctggtggtgggcatcttcatcgggtttcagaagaaagcctacacttctccagaaaaccttcctgcccttgtggcactgctcctgctgtatggatgggcggtcattcccatgatgtacccagcatccttcctgtttgatgtccccagcacagcctatgtggctttatcttgtgctaatctgttcatcggcatcaacagcagtgctattaccttcatcttggaattatttgagaataaccggacgctgctcaggttcaacgccgtgctgaggaagctgctcattgtcttcccccacttctgcctgggccggggcctcattgaccttgcactgagccaggctgtgacagatgtctatgcccggtttggtgaggagcactctgcaaatccgttccactgggacctgattgggaagaacctgtttgccatggtggtggaaggggtggtgtacttcctcctgaccctgctggtccagcgccacttcttcctctcccaatggattgccgagcccactaaggagcccattgttgatgaagatgatgatgtggctgaagaaagacaaagaattattactggtggaaataaaactgacatcttaaggctacatgaactaaccaagatttatccaggcacctccagcccagcagtggacaggctgtgtgtcggagttcgccctggagagtgctttggcctcctgggagtgaatggtgccggcaaaacaaccacattcaagatgctcactggggacaccacagtgacctcaggggatgccaccgtagcaggcaagagtattttaaccaatatttctgaagtccatcaaaatatgggctactgtcctcagtttgatgcaatcgatgagctgctcacaggacgagaacatctttacctttatgcccggcttcgaggtgtaccagcagaagaaatcgaaaaggttgcaaactggagtattaagagcctgggcctgactgtctacgccgactgcctggctggcacgtacagtgggggcaacaagcggaaactctccacagccatcgcactcattggctgcccaccgctggtgctgctggatgagcccaccacagggatggacccccaggcacgccgcatgctgtggaacgtcatcgtgagcatcatcagagaagggagggctgtggtcctcacatcccacagcatggaagaatgtgaggcactgtgtacccggctggccatcatggtaaagggcgcctttcgatgtatgggcaccattcagcatctcaagtccaaatttggagatggctatatcgtcacaatgaagatcaaatccccgaaggacgacctgcttcctgacctgaaccctgtggagcagttcttccaggggaacttcccaggcagtgtgcagagggagaggcactacaacatgctccagttccaggtctcctcctcctccctggcgaggatcttccagctcctcctctcccacaaggacagcctgctcatcgaggagtactcagtcacacagaccacactggaccaggtgtttgtaaattttgctaaacagcagactgaaagtcatgacctccctctgcaccctcgagctgctggagccagtcgacaagcccaggactgagcggccgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagatgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatcgataaggatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.17)

myo7a

paav2.1-cba-myo7a_5’ak

5’itr2

aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.10)

左itr5

ctctcccccctgtcgcgttcgctcgctcgctggctcgtttgggggggtggcagctcaaagagctgccagacgacggccctctggccgtcgcccccccaaacgagccagcgagcgagcgaacgcgacaggggggagagtgccacactctcaagcaagggggttttgtaagcagtga(seqidno.18)

cmv增强子

gctagcgtgccacctggtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgg(seqidno.19)

cba启动子

tcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgg(seqidno.20)

sv40内含子

gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag(seqidno.21)

5’hmyo7acds

atggtgattcttcagcagggggaccatgtgtggatggacctgagattggggcaggagttcgacgtgcccatcggggcggtggtgaagctctgcgactctgggcaggtccaggtggtggatgatgaagacaatgaacactggatctctccgcagaacgcaacgcacatcaagcctatgcaccccacgtcggtccacggcgtggaggacatgatccgcctgggggacctcaacgaggcgggcatcttgcgcaacctgcttatccgctaccgggaccacctcatctacacgtatacgggctccatcctggtggctgtgaacccctaccagctgctctccatctactcgccagagcacatccgccagtataccaacaagaagattggggagatgcccccccacatctttgccattgctgacaactgctacttcaacatgaaacgcaacagccgagaccagtgctgcatcatcagtggggaatctggggccgggaagacggagagcacaaagctgatcctgcagttcctggcagccatcagtgggcagcactcgtggattgagcagcaggtcttggaggccacccccattctggaagcatttgggaatgccaagaccatccgcaatgacaactcaagccgtttcggaaagtacatcgacatccacttcaacaagcggggcgccatcgagggcgcgaagattgagcagtacctgctggaaaagtcacgtgtctgtcgccaggccctggatgaaaggaactaccacgtgttctactgcatgctggagggcatgagtgaggatcagaagaagaagctgggcttgggccaggcctctgactacaactacttggccatgggtaactgcataacctgtgagggccgggtggacagccaggagtacgccaacatccgctccgccatgaaggtgctcatgttcactgacaccgagaactgggagatctcgaagctcctggctgccatcctgcacctgggcaacctgcagtatgaggcacgcacatttgaaaacctggatgcctgtgaggttctcttctccccatcgctggccacagctgcatccctgcttgaggtgaaccccccagacctgatgagctgcctgactagccgcaccctcatcacccgcggggagacggtgtccaccccactgagcagggaacaggcactggacgtgcgcgacgccttcgtaaaggggatctacgggcggctgttcgtgtggattgtggacaagatcaacgcagcaatttacaagcctccctcccaggatgtgaagaactctcgcaggtccatcggcctcctggacatctttgggtttgagaactttgctgtgaacagctttgagcagctctgcatcaacttcgccaatgagcacctgcagcagttctttgtgcggcacgtgttcaagctggagcaggaggaatatgacctggagagcattgactggctgcacatcgagttcactgacaaccaggatgccctggacatgattgccaacaagcccatgaacatcatctccctcatcgatgaggagagcaagttccccaagggcacagacaccaccatgttacacaagctgaactcccagcacaagctcaacgccaactacatcccccccaagaacaaccatgagacccagtttggcatcaaccattttgcaggcatcgtctactatgagacccaaggcttcctggagaagaaccgagacaccctgcatggggacattatccagctggtccactcctccaggaacaagttcatcaagcagatcttccaggccgatgtcgccatgggcgccgagaccaggaagcgctcgcccacacttagcagccagttcaagcggtcactggagctgctgatgcgcacgctgggtgcctgccagcccttctttgtgcgatgcatcaagcccaatgagttcaagaagcccatgctgttcgaccggcacctgtgcgtgcgccagctgcggtactcaggaatgatggagaccatccgaatccgccgagctggctaccccatccgctacagcttcgtagagtttgtggagcggtaccgtgtgctgctgccaggtgtgaagccggcctacaagcagggcgacctccgcgggacttgccagcgcatggctgaggctgtgctgggcacccacgatgactggcagataggcaaaaccaagatctttctgaaggaccaccatgacatgctgctggaagtggagcgggacaaagccatcaccgacagagtcatcctccttcagaaagtcatccggggattcaaagacaggtctaactttctgaagctgaagaacgctgccacactgatccagaggcactggcggggtcacaactgtaggaagaactacgggctgatgcgtctgggcttcctgcggctgcaggccctgcaccgctcccggaagctgcaccagcagtaccgcctggcccgccagcgcatcatccagttccaggcccgctgccgcgcctatctggtgcgcaaggccttccgccaccgcctctgggctgtgctcaccgtgcaggcctatgcccggggcatgatcgcccgcaggctgcaccaacgcctcagggctgagtatctgtggcgcctcgaggctgagaaaatgcggctggcggaggaagagaagcttcggaaggagatgagcgccaagaaggccaaggaggaggccgagcgcaagcatcaggagcgcctggcccagctggctcgtgaggacgctgagcgggagctgaaggagaaggaggccgctcggcggaagaaggagctcctggagcagatggaaagggcccgccatgagcctgtcaatcactcagacatggtggacaagatgtttggcttcctggggacttcaggtggcctgccaggccaggagggccaggcacctagtggctttgaggacctggagcgagggcggagggagatggtggaggaggacctggatgcagccctgcccctgcctgacgaggatgaggaggacctctctgagtataaatttgccaagttcgcggccacctacttccaggggacaactacgcactcctacacccggcggccactcaaacagccactgctctaccatgacgacgagggtgaccagctg(seqidno.22)

剪接供体信号

gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttct(seqidno.1)

ak

gggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaat(seqidno.3)

3’itr2

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct(seqidno.4)

paav2.1-cba-myo7a_5’ak的全长序列

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcctaatcgggaattcgcccttaagctagcgtgccacctggtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcggctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccaggcggccgccatggtgattcttcagcagggggaccatgtgtggatggacctgagattggggcaggagttcgacgtgcccatcggggcggtggtgaagctctgcgactctgggcaggtccaggtggtggatgatgaagacaatgaacactggatctctccgcagaacgcaacgcacatcaagcctatgcaccccacgtcggtccacggcgtggaggacatgatccgcctgggggacctcaacgaggcgggcatcttgcgcaacctgcttatccgctaccgggaccacctcatctacacgtatacgggctccatcctggtggctgtgaacccctaccagctgctctccatctactcgccagagcacatccgccagtataccaacaagaagattggggagatgcccccccacatctttgccattgctgacaactgctacttcaacatgaaacgcaacagccgagaccagtgctgcatcatcagtggggaatctggggccgggaagacggagagcacaaagctgatcctgcagttcctggcagccatcagtgggcagcactcgtggattgagcagcaggtcttggaggccacccccattctggaagcatttgggaatgccaagaccatccgcaatgacaactcaagccgtttcggaaagtacatcgacatccacttcaacaagcggggcgccatcgagggcgcgaagattgagcagtacctgctggaaaagtcacgtgtctgtcgccaggccctggatgaaaggaactaccacgtgttctactgcatgctggagggcatgagtgaggatcagaagaagaagctgggcttgggccaggcctctgactacaactacttggccatgggtaactgcataacctgtgagggccgggtggacagccaggagtacgccaacatccgctccgccatgaaggtgctcatgttcactgacaccgagaactgggagatctcgaagctcctggctgccatcctgcacctgggcaacctgcagtatgaggcacgcacatttgaaaacctggatgcctgtgaggttctcttctccccatcgctggccacagctgcatccctgcttgaggtgaaccccccagacctgatgagctgcctgactagccgcaccctcatcacccgcggggagacggtgtccaccccactgagcagggaacaggcactggacgtgcgcgacgccttcgtaaaggggatctacgggcggctgttcgtgtggattgtggacaagatcaacgcagcaatttacaagcctccctcccaggatgtgaagaactctcgcaggtccatcggcctcctggacatctttgggtttgagaactttgctgtgaacagctttgagcagctctgcatcaacttcgccaatgagcacctgcagcagttctttgtgcggcacgtgttcaagctggagcaggaggaatatgacctggagagcattgactggctgcacatcgagttcactgacaaccaggatgccctggacatgattgccaacaagcccatgaacatcatctccctcatcgatgaggagagcaagttccccaagggcacagacaccaccatgttacacaagctgaactcccagcacaagctcaacgccaactacatcccccccaagaacaaccatgagacccagtttggcatcaaccattttgcaggcatcgtctactatgagacccaaggcttcctggagaagaaccgagacaccctgcatggggacattatccagctggtccactcctccaggaacaagttcatcaagcagatcttccaggccgatgtcgccatgggcgccgagaccaggaagcgctcgcccacacttagcagccagttcaagcggtcactggagctgctgatgcgcacgctgggtgcctgccagcccttctttgtgcgatgcatcaagcccaatgagttcaagaagcccatgctgttcgaccggcacctgtgcgtgcgccagctgcggtactcaggaatgatggagaccatccgaatccgccgagctggctaccccatccgctacagcttcgtagagtttgtggagcggtaccgtgtgctgctgccaggtgtgaagccggcctacaagcagggcgacctccgcgggacttgccagcgcatggctgaggctgtgctgggcacccacgatgactggcagataggcaaaaccaagatctttctgaaggaccaccatgacatgctgctggaagtggagcgggacaaagccatcaccgacagagtcatcctccttcagaaagtcatccggggattcaaagacaggtctaactttctgaagctgaagaacgctgccacactgatccagaggcactggcggggtcacaactgtaggaagaactacgggctgatgcgtctgggcttcctgcggctgcaggccctgcaccgctcccggaagctgcaccagcagtaccgcctggcccgccagcgcatcatccagttccaggcccgctgccgcgcctatctggtgcgcaaggccttccgccaccgcctctgggctgtgctcaccgtgcaggcctatgcccggggcatgatcgcccgcaggctgcaccaacgcctcagggctgagtatctgtggcgcctcgaggctgagaaaatgcggctggcggaggaagagaagcttcggaaggagatgagcgccaagaaggccaaggaggaggccgagcgcaagcatcaggagcgcctggcccagctggctcgtgaggacgctgagcgggagctgaaggagaaggaggccgctcggcggaagaaggagctcctggagcagatggaaagggcccgccatgagcctgtcaatcactcagacatggtggacaagatgtttggcttcctggggacttcaggtggcctgccaggccaggagggccaggcacctagtggctttgaggacctggagcgagggcggagggagatggtggaggaggacctggatgcagccctgcccctgcctgacgaggatgaggaggacctctctgagtataaatttgccaagttcgcggccacctacttccaggggacaactacgcactcctacacccggcggccactcaaacagccactgctctaccatgacgacgagggtgaccagctggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttccaattgaagggcgaattccgatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.23)

paav2.1-myo7a_3’ak_bgh

5’itr2

aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.10)

ak

gggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaat(seqidno.3)

剪接受体信号

gataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag(seqidno.1)

3’hmyo7acds

gcagccctggcggtctggatcaccatcctccgcttcatgggggacctccctgagcccaagtaccacacagccatgagtgatggcagtgagaagatccctgtgatgaccaagatttatgagaccctgggcaagaagacgtacaagagggagctgcaggccctgcagggcgagggcgaggcccagctccccgagggccagaagaagagcagtgtgaggcacaagctggtgcatttgactctgaaaaagaagtccaagctcacagaggaggtgaccaagaggctgcatgacggggagtccacagtgcagggcaacagcatgctggaggaccggcccacctccaacctggagaagctgcacttcatcatcggcaatggcatcctgcggccagcactccgggacgagatctactgccagatcagcaagcagctgacccacaacccctccaagagcagctatgcccggggctggattctcgtgtctctctgcgtgggctgtttcgccccctccgagaagtttgtcaagtacctgcggaacttcatccacgggggcccgcccggctacgccccgtactgtgaggagcgcctgagaaggacctttgtcaatgggacacggacacagccgcccagctggctggagctgcaggccaccaagtccaagaagccaatcatgttgcccgtgacattcatggatgggaccaccaagaccctgctgacggactcggcaaccacggccaaggagctctgcaacgcgctggccgacaagatctctctcaaggaccggttcgggttctccctctacattgccctgtttgacaaggtgtcctccctgggcagcggcagtgaccacgtcatggacgccatctcccagtgcgagcagtacgccaaggagcagggcgcccaggagcgcaacgccccctggaggctcttcttccgcaaagaggtcttcacgccctggcacagcccctccgaggacaacgtggccaccaacctcatctaccagcaggtggtgcgaggagtcaagtttggggagtacaggtgtgagaaggaggacgacctggctgagctggcctcccagcagtactttgtagactatggctctgagatgatcctggagcgcctcctgaacctcgtgcccacctacatccccgaccgcgagatcacgcccctgaagacgctggagaagtgggcccagctggccatcgccgcccacaagaaggggatttatgcccagaggagaactgatgcccagaaggtcaaagaggatgtggtcagttatgcccgcttcaagtggcccttgctcttctccaggttttatgaagcctacaaattctcaggccccagtctccccaagaacgacgtcatcgtggccgtcaactggacgggtgtgtactttgtggatgagcaggagcaggtacttctggagctgtccttcccagagatcatggccgtgtccagcagcagggagtgccgtgtctggctctcactgggctgctctgatcttggctgtgctgcgcctcactcaggctgggcaggactgaccccggcggggccctgttctccgtgttggtcctgcaggggagcgaaaacgacggcccccagcttcacgctggccaccatcaagggggacgaatacaccttcacctccagtaatgctgaggacattcgtgacctggtggtcaccttcctagaggggctccggaagagatctaagtatgttgtggccctgcaggataaccccaaccccgcaggcgaggagtcaggcttcctcagctttgccaagggagacctcatcatcctggaccatgacacgggcgagcaggtcatgaactcgggctgggccaacggcatcaatgagaggaccaagcagcgtggggacttccccaccgactgtgtgtacgtcatgcccactgtcaccatgccacctcgtgagattgtggccctggtcaccatgactcccgatcagaggcaggacgttgtccggctcttgcagctgcgaacggcggagcccgaggtgcgtgccaagccctacacgctggaggagttttcctatgactacttcaggcccccacccaagcacacgctgagccgtgtcatggtgtccaaggcccgaggcaaggaccggctgtggagccacacgcgggaaccgctcaagcaggcgctgctcaagaagctcctgggcagtgaggagctctcgcaggaggcctgcctggccttcattgctgtgctcaagtacatgggcgactacccgtccaagaggacacgctccgtcaatgagctcaccgaccagatctttgagggtcccctgaaagccgagcccctgaaggacgaggcatatgtgcagatcctgaagcagctgaccgacaaccacatcaggtacagcgaggagcggggttgggagctgctctggctgtgcacgggccttttcccacccagcaacatcctcctgccccacgtgcagcgcttcctgcagtcccgaaagcactgcccactcgccatcgactgcctgcaacggctccagaaagccctgagaaacgggtcccggaagtaccctccgcacctggtggaggtggaggccatccagcacaagaccacccagattttccacaaggtctacttccctgatgacactgacgaggccttcgaagtggagtccagcaccaaggccaaggacttctgccagaacatcgccaccaggctgctcctcaagtcctcagagggattcagcctctttgtcaaaattgcagacaaggtcatcagcgttcctgagaatgacttcttctttgactttgttcgacacttgacagactggataaagaaagctcggcccatcaaggacggaattgtgccctcactcacctaccaggtgttcttcatgaagaagctgtggaccaccacggtgccagggaaggatcccatggccgattccatcttccactattaccaggagttgcccaagtatctccgaggctaccacaagtgcacgcgggaggaggtgctgcagctgggggcgctgatctacagggtcaagttcgaggaggacaagtcctacttccccagcatccccaagctgctgcgggagctggtgccccaggaccttatccggcaggtctcacctgatgactggaagcggtccatcgtcgcctacttcaacaagcacgcagggaagtccaaggaggaggccaagctggccttcctgaagctcatcttcaagtggcccacctttggctcagccttcttcgaggtgaagcaaactacggagccaaacttccctgagatcctcctaattgccatcaacaagtatggggtcagcctcatcgatcccaaaacgaaggatatcctcaccactcatcccttcaccaagatctccaactggagcagcggcaacacctacttccacatcaccattgggaacttggtgcgcgggagcaaactgctctgcgagacgtcactgggctacaagatggatgacctcctgacttcctacattagccagatgctcacagccatgagcaaacagcggggctccaggagcggcaagtga(seqidno.24)

bgh聚a

gcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctgggga(seqidno.25)

3’itr2

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct(seqidno.4)

右itr5

tcactgcttacaaaacccccttgcttgagagtgtggcactctcccccctgtcgcgttcgctcgctcgctggctcgtttgggggggcgacggccagagggccgtcgtctggcagctctttgagctgccacccccccaaacgagccagcgagcgagcgaacgcgacaggggggagag(seqidno.14)

paav2.1-myo7a_3’ak_bgh的全长序列

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgccctttgatcagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttcgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggcagccctggcggtctggatcaccatcctccgcttcatgggggacctccctgagcccaagtaccacacagccatgagtgatggcagtgagaagatccctgtgatgaccaagatttatgagaccctgggcaagaagacgtacaagagggagctgcaggccctgcagggcgagggcgaggcccagctccccgagggccagaagaagagcagtgtgaggcacaagctggtgcatttgactctgaaaaagaagtccaagctcacagaggaggtgaccaagaggctgcatgacggggagtccacagtgcagggcaacagcatgctggaggaccggcccacctccaacctggagaagctgcacttcatcatcggcaatggcatcctgcggccagcactccgggacgagatctactgccagatcagcaagcagctgacccacaacccctccaagagcagctatgcccggggctggattctcgtgtctctctgcgtgggctgtttcgccccctccgagaagtttgtcaagtacctgcggaacttcatccacgggggcccgcccggctacgccccgtactgtgaggagcgcctgagaaggacctttgtcaatgggacacggacacagccgcccagctggctggagctgcaggccaccaagtccaagaagccaatcatgttgcccgtgacattcatggatgggaccaccaagaccctgctgacggactcggcaaccacggccaaggagctctgcaacgcgctggccgacaagatctctctcaaggaccggttcgggttctccctctacattgccctgtttgacaaggtgtcctccctgggcagcggcagtgaccacgtcatggacgccatctcccagtgcgagcagtacgccaaggagcagggcgcccaggagcgcaacgccccctggaggctcttcttccgcaaagaggtcttcacgccctggcacagcccctccgaggacaacgtggccaccaacctcatctaccagcaggtggtgcgaggagtcaagtttggggagtacaggtgtgagaaggaggacgacctggctgagctggcctcccagcagtactttgtagactatggctctgagatgatcctggagcgcctcctgaacctcgtgcccacctacatccccgaccgcgagatcacgcccctgaagacgctggagaagtgggcccagctggccatcgccgcccacaagaaggggatttatgcccagaggagaactgatgcccagaaggtcaaagaggatgtggtcagttatgcccgcttcaagtggcccttgctcttctccaggttttatgaagcctacaaattctcaggccccagtctccccaagaacgacgtcatcgtggccgtcaactggacgggtgtgtactttgtggatgagcaggagcaggtacttctggagctgtccttcccagagatcatggccgtgtccagcagcagggagtgccgtgtctggctctcactgggctgctctgatcttggctgtgctgcgcctcactcaggctgggcaggactgaccccggcggggccctgttctccgtgttggtcctgcaggggagcgaaaacgacggcccccagcttcacgctggccaccatcaagggggacgaatacaccttcacctccagtaatgctgaggacattcgtgacctggtggtcaccttcctagaggggctccggaagagatctaagtatgttgtggccctgcaggataaccccaaccccgcaggcgaggagtcaggcttcctcagctttgccaagggagacctcatcatcctggaccatgacacgggcgagcaggtcatgaactcgggctgggccaacggcatcaatgagaggaccaagcagcgtggggacttccccaccgactgtgtgtacgtcatgcccactgtcaccatgccacctcgtgagattgtggccctggtcaccatgactcccgatcagaggcaggacgttgtccggctcttgcagctgcgaacggcggagcccgaggtgcgtgccaagccctacacgctggaggagttttcctatgactacttcaggcccccacccaagcacacgctgagccgtgtcatggtgtccaaggcccgaggcaaggaccggctgtggagccacacgcgggaaccgctcaagcaggcgctgctcaagaagctcctgggcagtgaggagctctcgcaggaggcctgcctggccttcattgctgtgctcaagtacatgggcgactacccgtccaagaggacacgctccgtcaatgagctcaccgaccagatctttgagggtcccctgaaagccgagcccctgaaggacgaggcatatgtgcagatcctgaagcagctgaccgacaaccacatcaggtacagcgaggagcggggttgggagctgctctggctgtgcacgggccttttcccacccagcaacatcctcctgccccacgtgcagcgcttcctgcagtcccgaaagcactgcccactcgccatcgactgcctgcaacggctccagaaagccctgagaaacgggtcccggaagtaccctccgcacctggtggaggtggaggccatccagcacaagaccacccagattttccacaaggtctacttccctgatgacactgacgaggccttcgaagtggagtccagcaccaaggccaaggacttctgccagaacatcgccaccaggctgctcctcaagtcctcagagggattcagcctctttgtcaaaattgcagacaaggtcatcagcgttcctgagaatgacttcttctttgactttgttcgacacttgacagactggataaagaaagctcggcccatcaaggacggaattgtgccctcactcacctaccaggtgttcttcatgaagaagctgtggaccaccacggtgccagggaaggatcccatggccgattccatcttccactattaccaggagttgcccaagtatctccgaggctaccacaagtgcacgcgggaggaggtgctgcagctgggggcgctgatctacagggtcaagttcgaggaggacaagtcctacttccccagcatccccaagctgctgcgggagctggtgccccaggaccttatccggcaggtctcacctgatgactggaagcggtccatcgtcgcctacttcaacaagcacgcagggaagtccaaggaggaggccaagctggccttcctgaagctcatcttcaagtggcccacctttggctcagccttcttcgaggtgaagcaaactacggagccaaacttccctgagatcctcctaattgccatcaacaagtatggggtcagcctcatcgatcccaaaacgaaggatatcctcaccactcatcccttcaccaagatctccaactggagcagcggcaacacctacttccacatcaccattgggaacttggtgcgcgggagcaaactgctctgcgagacgtcactgggctacaagatggatgacctcctgacttcctacattagccagatgctcacagccatgagcaaacagcggggctccaggagcggcaagtgaccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgagatctgcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggactcgagttaagggcgcaattcccgattaggatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.26)

paav2.1-cba-myo7a_5’ts

全长序列

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcctaatcgggaattcgcccttaagctagcgtgccacctggtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcggctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccaggcggccgccatggtgattcttcagcagggggaccatgtgtggatggacctgagattggggcaggagttcgacgtgcccatcggggcggtggtgaagctctgcgactctgggcaggtccaggtggtggatgatgaagacaatgaacactggatctctccgcagaacgcaacgcacatcaagcctatgcaccccacgtcggtccacggcgtggaggacatgatccgcctgggggacctcaacgaggcgggcatcttgcgcaacctgcttatccgctaccgggaccacctcatctacacgtatacgggctccatcctggtggctgtgaacccctaccagctgctctccatctactcgccagagcacatccgccagtataccaacaagaagattggggagatgcccccccacatctttgccattgctgacaactgctacttcaacatgaaacgcaacagccgagaccagtgctgcatcatcagtggggaatctggggccgggaagacggagagcacaaagctgatcctgcagttcctggcagccatcagtgggcagcactcgtggattgagcagcaggtcttggaggccacccccattctggaagcatttgggaatgccaagaccatccgcaatgacaactcaagccgtttcggaaagtacatcgacatccacttcaacaagcggggcgccatcgagggcgcgaagattgagcagtacctgctggaaaagtcacgtgtctgtcgccaggccctggatgaaaggaactaccacgtgttctactgcatgctggagggcatgagtgaggatcagaagaagaagctgggcttgggccaggcctctgactacaactacttggccatgggtaactgcataacctgtgagggccgggtggacagccaggagtacgccaacatccgctccgccatgaaggtgctcatgttcactgacaccgagaactgggagatctcgaagctcctggctgccatcctgcacctgggcaacctgcagtatgaggcacgcacatttgaaaacctggatgcctgtgaggttctcttctccccatcgctggccacagctgcatccctgcttgaggtgaaccccccagacctgatgagctgcctgactagccgcaccctcatcacccgcggggagacggtgtccaccccactgagcagggaacaggcactggacgtgcgcgacgccttcgtaaaggggatctacgggcggctgttcgtgtggattgtggacaagatcaacgcagcaatttacaagcctccctcccaggatgtgaagaactctcgcaggtccatcggcctcctggacatctttgggtttgagaactttgctgtgaacagctttgagcagctctgcatcaacttcgccaatgagcacctgcagcagttctttgtgcggcacgtgttcaagctggagcaggaggaatatgacctggagagcattgactggctgcacatcgagttcactgacaaccaggatgccctggacatgattgccaacaagcccatgaacatcatctccctcatcgatgaggagagcaagttccccaagggcacagacaccaccatgttacacaagctgaactcccagcacaagctcaacgccaactacatcccccccaagaacaaccatgagacccagtttggcatcaaccattttgcaggcatcgtctactatgagacccaaggcttcctggagaagaaccgagacaccctgcatggggacattatccagctggtccactcctccaggaacaagttcatcaagcagatcttccaggccgatgtcgccatgggcgccgagaccaggaagcgctcgcccacacttagcagccagttcaagcggtcactggagctgctgatgcgcacgctgggtgcctgccagcccttctttgtgcgatgcatcaagcccaatgagttcaagaagcccatgctgttcgaccggcacctgtgcgtgcgccagctgcggtactcaggaatgatggagaccatccgaatccgccgagctggctaccccatccgctacagcttcgtagagtttgtggagcggtaccgtgtgctgctgccaggtgtgaagccggcctacaagcagggcgacctccgcgggacttgccagcgcatggctgaggctgtgctgggcacccacgatgactggcagataggcaaaaccaagatctttctgaaggaccaccatgacatgctgctggaagtggagcgggacaaagccatcaccgacagagtcatcctccttcagaaagtcatccggggattcaaagacaggtctaactttctgaagctgaagaacgctgccacactgatccagaggcactggcggggtcacaactgtaggaagaactacgggctgatgcgtctgggcttcctgcggctgcaggccctgcaccgctcccggaagctgcaccagcagtaccgcctggcccgccagcgcatcatccagttccaggcccgctgccgcgcctatctggtgcgcaaggccttccgccaccgcctctgggctgtgctcaccgtgcaggcctatgcccggggcatgatcgcccgcaggctgcaccaacgcctcagggctgagtatctgtggcgcctcgaggctgagaaaatgcggctggcggaggaagagaagcttcggaaggagatgagcgccaagaaggccaaggaggaggccgagcgcaagcatcaggagcgcctggcccagctggctcgtgaggacgctgagcgggagctgaaggagaaggaggccgctcggcggaagaaggagctcctggagcagatggaaagggcccgccatgagcctgtcaatcactcagacatggtggacaagatgtttggcttcctggggacttcaggtggcctgccaggccaggagggccaggcacctagtggctttgaggacctggagcgagggcggagggagatggtggaggaggacctggatgcagccctgcccctgcctgacgaggatgaggaggacctctctgagtataaatttgccaagttcgcggccacctacttccaggggacaactacgcactcctacacccggcggccactcaaacagccactgctctaccatgacgacgagggtgaccagctggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctcaattgaagggcgaattccgatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.27)

paav2.1-myo7a_3’ts_bgh

全长序列

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggcagccctggcggtctggatcaccatcctccgcttcatgggggacctccctgagcccaagtaccacacagccatgagtgatggcagtgagaagatccctgtgatgaccaagatttatgagaccctgggcaagaagacgtacaagagggagctgcaggccctgcagggcgagggcgaggcccagctccccgagggccagaagaagagcagtgtgaggcacaagctggtgcatttgactctgaaaaagaagtccaagctcacagaggaggtgaccaagaggctgcatgacggggagtccacagtgcagggcaacagcatgctggaggaccggcccacctccaacctggagaagctgcacttcatcatcggcaatggcatcctgcggccagcactccgggacgagatctactgccagatcagcaagcagctgacccacaacccctccaagagcagctatgcccggggctggattctcgtgtctctctgcgtgggctgtttcgccccctccgagaagtttgtcaagtacctgcggaacttcatccacgggggcccgcccggctacgccccgtactgtgaggagcgcctgagaaggacctttgtcaatgggacacggacacagccgcccagctggctggagctgcaggccaccaagtccaagaagccaatcatgttgcccgtgacattcatggatgggaccaccaagaccctgctgacggactcggcaaccacggccaaggagctctgcaacgcgctggccgacaagatctctctcaaggaccggttcgggttctccctctacattgccctgtttgacaaggtgtcctccctgggcagcggcagtgaccacgtcatggacgccatctcccagtgcgagcagtacgccaaggagcagggcgcccaggagcgcaacgccccctggaggctcttcttccgcaaagaggtcttcacgccctggcacagcccctccgaggacaacgtggccaccaacctcatctaccagcaggtggtgcgaggagtcaagtttggggagtacaggtgtgagaaggaggacgacctggctgagctggcctcccagcagtactttgtagactatggctctgagatgatcctggagcgcctcctgaacctcgtgcccacctacatccccgaccgcgagatcacgcccctgaagacgctggagaagtgggcccagctggccatcgccgcccacaagaaggggatttatgcccagaggagaactgatgcccagaaggtcaaagaggatgtggtcagttatgcccgcttcaagtggcccttgctcttctccaggttttatgaagcctacaaattctcaggccccagtctccccaagaacgacgtcatcgtggccgtcaactggacgggtgtgtactttgtggatgagcaggagcaggtacttctggagctgtccttcccagagatcatggccgtgtccagcagcagggagtgccgtgtctggctctcactgggctgctctgatcttggctgtgctgcgcctcactcaggctgggcaggactgaccccggcggggccctgttctccgtgttggtcctgcaggggagcgaaaacgacggcccccagcttcacgctggccaccatcaagggggacgaatacaccttcacctccagtaatgctgaggacattcgtgacctggtggtcaccttcctagaggggctccggaagagatctaagtatgttgtggccctgcaggataaccccaaccccgcaggcgaggagtcaggcttcctcagctttgccaagggagacctcatcatcctggaccatgacacgggcgagcaggtcatgaactcgggctgggccaacggcatcaatgagaggaccaagcagcgtggggacttccccaccgactgtgtgtacgtcatgcccactgtcaccatgccacctcgtgagattgtggccctggtcaccatgactcccgatcagaggcaggacgttgtccggctcttgcagctgcgaacggcggagcccgaggtgcgtgccaagccctacacgctggaggagttttcctatgactacttcaggcccccacccaagcacacgctgagccgtgtcatggtgtccaaggcccgaggcaaggaccggctgtggagccacacgcgggaaccgctcaagcaggcgctgctcaagaagctcctgggcagtgaggagctctcgcaggaggcctgcctggccttcattgctgtgctcaagtacatgggcgactacccgtccaagaggacacgctccgtcaatgagctcaccgaccagatctttgagggtcccctgaaagccgagcccctgaaggacgaggcatatgtgcagatcctgaagcagctgaccgacaaccacatcaggtacagcgaggagcggggttgggagctgctctggctgtgcacgggccttttcccacccagcaacatcctcctgccccacgtgcagcgcttcctgcagtcccgaaagcactgcccactcgccatcgactgcctgcaacggctccagaaagccctgagaaacgggtcccggaagtaccctccgcacctggtggaggtggaggccatccagcacaagaccacccagattttccacaaggtctacttccctgatgacactgacgaggccttcgaagtggagtccagcaccaaggccaaggacttctgccagaacatcgccaccaggctgctcctcaagtcctcagagggattcagcctctttgtcaaaattgcagacaaggtcatcagcgttcctgagaatgacttcttctttgactttgttcgacacttgacagactggataaagaaagctcggcccatcaaggacggaattgtgccctcactcacctaccaggtgttcttcatgaagaagctgtggaccaccacggtgccagggaaggatcccatggccgattccatcttccactattaccaggagttgcccaagtatctccgaggctaccacaagtgcacgcgggaggaggtgctgcagctgggggcgctgatctacagggtcaagttcgaggaggacaagtcctacttccccagcatccccaagctgctgcgggagctggtgccccaggaccttatccggcaggtctcacctgatgactggaagcggtccatcgtcgcctacttcaacaagcacgcagggaagtccaaggaggaggccaagctggccttcctgaagctcatcttcaagtggcccacctttggctcagccttcttcgaggtgaagcaaactacggagccaaacttccctgagatcctcctaattgccatcaacaagtatggggtcagcctcatcgatcccaaaacgaaggatatcctcaccactcatcccttcaccaagatctccaactggagcagcggcaacacctacttccacatcaccattgggaacttggtgcgcgggagcaaactgctctgcgagacgtcactgggctacaagatggatgacctcctgacttcctacattagccagatgctcacagccatgagcaaacagcggggctccaggagcggcaagtgaccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgagatctgcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggactcgagttaagggcgcaattcccgattaggatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(seqidno.28)

ap:

gtgatcctaggtggaggccgaaagtacatgtttcgcatgggaaccccagaccctgagtacccagatgactacagccaaggtgggaccaggctggacgggaagaatctggtgcaggaatggctggcgaagcgccagggtgcccggtacgtgtggaaccgcactgagctcatgcaggcttccctggacccgtctgtgacccatctcatgggtctctttgagcctggagacatgaaatacgagatccaccgagactccacactggacccctccctgatgga(seqidno.29)

3xflag标签:

gactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatgacaag(seqidno.30)

ha:atgtatgatgttcctgattatgctagcctc(seqidno.31)

出于本发明的目的，将abca4、myo7a和cep290的编码序列与能够在哺乳动物视网膜细胞(特别是感光细胞)中调节其表达的启动子序列功能性连接，所述编码序列优选分别选自本发明公开的序列或由于遗传密码简并而编码同一氨基酸序列的序列。可用于本发明的合适的启动子包括巨细胞病毒启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、感光细胞间类视黄醇结合蛋白启动子、卵黄状黄斑营养不良2启动子，其保留转录启动子活性的片段或变体。

病毒递送系统包括但不限于：腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、假型aav载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。假型aav载体是在第二aav血清型的衣壳中含有一种aav血清型的基因组的载体；例如，aav2/8载体含aav8衣壳和aav2基因组(auricchio等(2001)hum.mol.genet.10(26):3075-81)。这类载体也称为嵌合载体。递送系统的其他示例包括离体递送系统，其包括但不限于dna转染方法，如电穿孔、dna基因枪、脂质介导的转染、收缩的dna介导的转染。

可根据本领域技术人员已知的方法和使用本领域技术人员已知的技术来构建aav载体。腺相关病毒载体构建和在治疗中应用的理论和实践参见若干科学和专利出版物(以下文献通过引用纳入本文：flottetr.adeno-associatedvirus-basedgenetherapyforinheriteddisorders(针对遗传性疾病的基于腺相关病毒的基因治疗).pediatrres.2005年12月；58(6):1143-7；goncalvesma.adeno-associatedvirus:fromdefectivevirustoeffectivevector(腺相关病毒：从缺陷型病毒到有效的载体),virolj.2005年5月6日；2:43；suraceem,auricchioa.adeno-associatedviralvectorsforretinalgenetransfer(用于视网膜基因转移的腺相关病毒载体).progretineyeres.2003年11月；22(6):705-19；mandelrj,manfredssonfp,foustkd,risinga,reimsniders,nashk,burgerc.recombinantadeno-associatedviralvectorsastherapeuticagentstotreatneurologicaldisorders(作为治疗神经疾病治疗剂的重组腺相关病毒载体).molther.2006年3月；13(3):463-83)。

含有aab载体的药物组合物的合适的给药形式包括但不限于可注射溶液剂或混悬剂、眼洗剂和眼用软膏剂。在有效的实施方式中，通过视网膜下注射递送aav载体，例如通过在视网膜下空间中、在前房中或在眼球后空间中注射。优选通过视网膜下方法递送病毒载体(参见bennicellij,等，molther.2008年1月22日；reversalofblindnessinanimalmodelsoflebercongenitalamaurosisusingoptimizedaav2-mediatedgenetransfer(使用优化的aav2介导的基因转移在莱伯先天性黑朦的动物模型中逆转失明))。

用于治疗的病毒剂量应在个案基础上确定，这取决于给药途径、疾病的严重程度、患者的总体状态和其他临床参数。通常，合适的剂量范围是10⁸至10¹³vg(载体基因组)/眼。

aav载体生产

aav载体由tigemaav载体中心生成，通过三重转染hek293细胞随后进行两轮cscl2纯化(54)。对于各病毒制备，将通过点印迹分析(55)和使用taqman的pcr定量(54)(应用生物系统公司(appliedbiosystems)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)实现的效价平均化来确定物理效价(基因组拷贝(gc)/ml)。

hek293细胞的aav感染

将hek293细胞维持在含有10％胎牛血清和2mml-谷氨酰胺的杜尔伯科改良伊格尔培养基(dmem)中(gibco，英杰公司(invitrogens.r.l.)，意大利米兰)。将细胞以2×10⁶个细胞/孔的密度置于六孔板中并在16小时后通过磷酸钙方法使用1,3μg的含有ad辅助基因的pdeltaf6辅助质粒(56)转染。5小时后，使用dmem对细胞清洗一次并在700μl无血清dmem的终体积中使用aav2/2载体孵育(m.o.i：各载体为10⁵个gc/细胞；使用双重aav载体1:1共感染导致2x10⁵个总gc/细胞)。两小时后向细胞中添加2ml的完全dmem。在感染后72小时收获细胞以进行western印迹分析。

动物模型

该研究遵循实验室动物护理和使用的nih指南、在眼科和视觉研究中使用动物的视觉和眼科研究协会声明以及意大利健康部动物操作规定。将小鼠置于遗传学和生物物理学研究所动物房中(意大利那不勒斯)并维持于12小时光/暗循环中(光阶段期间10-50勒克司暴露)。c57bl/6和balb/c小鼠购自哈兰意大利公司(harlanitalysrl)(意大利乌迪内)。通过与balb/c小鼠(rpe65leu450纯合子)(57)连续杂交和回交来生成白化abca4-/-小鼠并维持同系交配。通过杂交纯合子小鼠来进行育种。着色的sh14626sb/4626sb(称作sh1-/-)小鼠进口自wts研究所(wellcometrustsangerinstitute)(英国剑桥，karensteel博士的礼物)并与购自哈兰意大利公司(意大利乌迪内)的cba/ca小鼠回交两次以得到杂合子sh1+/4626sb(称作sh1+/-)小鼠以扩增群体。使小鼠维持互交；通过杂交杂合子雌性与杂合子雄性来进行育种。用于该研究的色素化sh1小鼠是亚瑟1b影响的(sh1-/-)或未影响的(sh1+/-和sh1+/+)。通过基因组dna(提取自小鼠尾尖)的pcr分析并随后进行dna测序来对myo7a^4626sb等位基因进行基因分型。用于pcr扩增的引物是：fw1(gtggagcttgacatctacttgacc)和rev3(agctgaccctcatgactctgc)，生成712bp的产物，使用fw1引物进行测序。该研究中使用的雌性大白猪在意大利国家猪育种协会的lwherd手册(aziendaagricolapasotti，伊莫拉，意大利)中注册为纯种。

小鼠和猪中aav载体的视网膜下注射

通过腹膜内注射2ml/100g体重的阿佛丁(1.25％w/v的2,2,2-三溴甲醇和2.5％v/v的2-甲基-2-丁醇(西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich)，意大利米兰))麻醉小鼠(4-5周龄)(58)，随后通过liang等所述的经巩膜经脉络膜方法(59)视网膜下递送aav2/8载体。所有眼都使用1μl的载体溶液治疗。递送的aav2/8剂量(gc/眼)在不同的小鼠实验中变化，如“结果”部分所述。向aav2/8载体溶液中加入aav2/1-cmv-人酪氨酸激酶(60)(剂量：2x10⁸gc/眼)或aav2/5-cmv-egfp(编码正常大小的egfp，剂量：4x10⁸gc/眼)，其经视网膜下分别递送至白化(abca4-/-和balb/c)(图6b，7-8)或色素化sh1小鼠中(图10-11)。这允许我们在转导的那部分洗眼杯内标记rpe，其随后进行解剖和分析(图6b，7-8，10-11)。如前所述向猪视网膜视网膜下递送aav载体(11)。所有眼都使用100μl的aav2/8载体溶液治疗。aav2/8剂量是1x10¹⁰(图3b)或1x10¹¹gc的各载体/眼(图5b和16)且共注射双重aav载体导致总剂量分别为2x10¹⁰gc/眼或2x10¹¹gc/眼。

western印迹分析

在ripa缓冲液(50mmtris-hclph8.0，150mmnacl，1％np40，0.5％脱氧胆酸钠，1mmedtaph8.0，0.1％sds)中裂解用于western印迹分析的样品(hek293细胞、视网膜或洗眼杯)以提取egfp和myo7a蛋白，或在sie缓冲液(250mm蔗糖，3mm咪唑ph7.4，1％乙醇和1％np-40)中裂解以提取abca4蛋白。

在ripa缓冲液中裂解猪样品(经治疗的视网膜区域以及整个rpe片)以从rpe片中提取myo7a，并在sie缓冲液中裂解以从视网膜中提取myo7a和abca4。

向裂解缓冲液中补充蛋白酶抑制剂(完全蛋白酶抑制剂混合物片，罗氏公司(roche)，意大利米兰)和1mm苯甲基磺酰氟。裂解后，将egfp和myo7a样品在1x拉姆力样品缓冲液中99℃下变性5分钟；将abca4样品在附加有4m脲的1x拉姆力样品缓冲液中37℃下变性15分钟；通过7％(abca4和myo7a样品)或12％(egfp样品)sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离裂解物。用于免疫印迹的抗体如下：抗egfp(sc-8334，圣克鲁兹公司(santacruz)，美国德克萨斯州达拉斯，1:500)；抗-3xflag(a8592，西格玛-奥德里奇公司，1:1000)；使用对应于人myo7a蛋白的氨基酸941-1070的肽生成的抗-myo7a(多克隆，普利姆公司(primmsrl)，意大利米兰，1:500)；抗-ha抗体(prb-101p-200，ha.11，科文斯公司(covance)，美国新泽西州普林斯顿，1:2000)；抗-β微管蛋白(t5201，西格玛-奥德里奇公司，1:10000)；抗-细丝蛋白a(货号#4762，细胞信号技术公司(cellsignalingtechnology)，美国马萨诸塞州丹佛，1:1000)；抗-营养障碍素(营养障碍素，克隆ham1/7b6，monx10795，特步生物公司(tebu-bio)，法国leperray-en-yveline，1:500)。使用imagej软件(可从http://rsbweb.nih.gov/ij/免费下载)对western印迹检测的egfp、abca4和myo7a条带进行定量。对于体外和体内实验，将abca4和myo7a表达分别标准化至细丝蛋白a或营养障碍素。对于体外和体内实验，将egfp表达分别针对β微管蛋白或μg蛋白标准化。不同的蛋白质被用于标准化，这基于其分子量与不同转基因产物分子量的类似性。

眼底照相

通过使用一滴托品酰胺1％(维斯法玛公司(visufarma)，意大利罗马)使c57bl/6的眼膨胀并随后使用300w闪光刺激眼来进行眼底活体成像。使用与电荷耦合装置尼康d1h数码相机连接的topcontrc-50ix视网膜相机获取眼底相片(拓普康医疗系统公司(topconmedicalsystem)，美国新泽西州奥克兰)。

组织学，光和荧光显微分析

为评价组织切片中的egfp表达，在aav2/8注射后一个月对来自c57bl/6小鼠或大白猪(11)的眼进行去核。将小鼠眼在4％多聚甲醛中固定过夜并使用30％蔗糖浸润过夜；随后解剖角膜和晶状体并将洗眼杯包埋在最佳切片温度化合物中(o.c.t.基质，卡尔特克公司(kaltek)，意大利帕多瓦)。将猪眼在4％多聚甲醛中固定48小时，使用10％蔗糖浸润4小时，使用20％蔗糖浸润4小时，并最终使用30％蔗糖浸润过夜。随后，解剖角膜、晶状体和玻璃质体并将洗眼杯的egfp阳性部分包埋在最佳切片温度化合物中(o.c.t.基质，卡尔特克公司)。沿水平子午线切割连续冷冻切片(10μm厚)并进行性分布在载玻片上。使用zeissaxiocam(卡尔蔡司公司(carlzeiss)，德国上科亨)获取视网膜组织学照片。为分析色素化sh1小鼠的rpe中的黑素体定位，在aav注射后2个月对眼去核，在含2％戊二醛-2％多聚甲醛的0.1m磷酸盐缓冲液中固定过夜，使用0.1m磷酸盐缓冲液清洗，并在荧光显微镜下解剖。将洗眼杯的egfp阳性部分包埋在araldite502/embed812(货号13940，araldite502/embed812试剂盒，电子显微镜科学公司(electronmicroscopysciences)，美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德)中。在leicaultratomerm2235(莱卡微系统公司(leicamicrosystems)，美国伊利诺伊州班纳克伯恩)上横向切割半薄(0.5-μm)切片，安装在载玻片上，并使用epoxy组织染料染色(货号14950，电子显微镜科学公司)。通过掩蔽的操作器对黑素体进行计数，在100x放大倍数下在光学显微镜下分析10个不同视野/眼。使用zeissaxiocam(卡尔蔡司公司)获取视网膜照片。

电子显微术和免疫金标记

对于电子显微分析，分别在aav注射后3和2个月从abca4-/-或sh1小鼠收获眼。在含0.2％戊二醛-2％多聚甲醛的0.1mphem缓冲液ph6.9(240mmpipes，100mmhepes，8mmmgcl2，40mmegta)中将各眼固定2小时并随后在0.1mphem缓冲液中清洗。随后在光学或荧光显微镜下解剖眼以分别选择白化(abca4-/-和balb/c)和色素化sh1小鼠的洗眼杯的酪氨酸激酶或egfp阳性部分。随后将洗眼杯的经转导部分包埋在12％明胶中，使用2.3m蔗糖输注并在液氮中冷冻。使用leicaultramicrotomeemfc7(莱卡微系统公司)切割冷冻切片(50nm)并非常小心地排列纵向衔接纤毛的pr。使用item软件(奥林帕斯sys公司(olympussys)，德国汉堡)通过掩蔽的操作器(rp公司(romanpolishchuk))在abca4-/-眼中测量rpe厚度并对脂褐质颗粒进行计数。简言之，使用item软件的“arbitraryline”工具沿试样长度测量至少30个不同区域中的rpe厚度。使用item软件的“touchcount”模块来对rpe层上随机分布的25μm²区域中脂褐质颗粒数目进行计数。颗粒密度表示为颗粒数目/25μm²。该免疫金分析旨在测试通过使单克隆抗ha抗体(mms-101p-50，科文斯公司(covance)，1:50)、兔抗小鼠igg和10-nm金颗粒偶联的蛋白a与冷冻切片连续孵育来进行aav载体递送后abca4-/-样品中abca4-ha的表达。为量化视紫红质至sh1pr的衔接纤毛的定位，将sh1小鼠的冷冻切片与抗视紫红质抗体(1d4，ab5417，阿柏堪穆公司(abcam)，英国剑桥，1:100)、兔抗小鼠igg和10-nm金颗粒偶联的蛋白a连续孵育。使用item软件(奥林帕斯sys公司)通过掩蔽的操作器对衔接纤毛中视紫红质的金密度进行定量。简言之，使用item软件的“touchcount”模块对每个纤毛的金颗粒进行计数，其标准化至使用“closedpolygontool”测量的纤毛周长(nm)。金密度表示为金颗粒/nm。在配备有用于数码图像捕获的velettaccd相机的feitecnai-12(fei公司，荷兰埃因霍温)电子显微镜下分析免疫金标记的冷冻切片。

电生理学分析

为评估从光脱敏中的恢复，使用1cds/m2的3次闪光刺激眼，随后通过暴露于恒定光(300cd/m2)下3分钟来进行脱敏。随后，在脱敏后0、5、15、30、45和60分钟时使用脱敏前闪光(1cds/m2)随时间刺激眼。通过脱敏后(不同时间点)生成和脱敏前生产的b-波之间的比例来评估视杆活性的恢复。在治疗后6周时在2月龄的abca4-/-小鼠中评估从光脱敏的恢复(图13)。

统计分析

数据显示为平均值±该平均值的标准误(s.e.m.)。统计学p值小于0.05被认为具有显著性。使用事后多重比较检验进行单向anova以比较以下图中描述的数据：图2(panova:a.0.0002；b.0.0015；c.2x10^-7)；图8b(panova:0.076)；图11b(panova:0.5)。在对脂褐质颗粒(图7b)和黑素体(图10b)进行计数时，通过与负二项广义线性模型(61)的偏差来分析计数(图7b：偏差的p值分析0.03794；图10b：偏差的p值分析<<2x10^-10)。在附图中用星号标记通过事后多重比较检验确定的组间统计学显著的差异。

结果

正常尺寸、超大型和双重aav载体的生成。

发明人生成了超大型(oz)、双重aav反式剪接(ts)和杂合载体(其包含报告物egfp、治疗性abca4-3xflag或myo7a-ha编码序列)。发明人还生成了双重aav反式剪接(ts)和杂合载体，其包含在c端处带ha标签的治疗性cep290。包含在双重aav杂合载体中的重组发生序列基于先前报道的碱性磷酸酶转基因区域(ap，双重aav杂合ap)(39)或发明人在先前的实验中发现具有重组发生性的来自f1噬菌体基因组的77bp序列(ak，双重aav杂合ak)(colella和auricchio，未公开的数据)。发明人还生成了用于abca4、myo7a和cep290的双重aav重叠(ov)载体。发明人没有生成用于egfp的双重aavov载体，因为该方法的效率依赖于用于重建的转基因特异性重叠(38)并因此无法由一个基因外推至另一个。作为替代，对于egfp，发明人生成正常尺寸的单个aav载体(ns)以比较来自多种策略的转基因表达水平。用于生产本研究中使用的所有aav载体而生成的构建体列于表1，而多种方法的示意图示于图1。

发明人使用aav2/2载体用于体外实验，其具有遍在巨细胞病毒(cmv)或鸡β-肌动蛋白(cba)启动子，其有效地转导hek293细胞(40)。此外，由于使用来自aav血清型2和5的异源itr可提高双重aav载体的生产性重新组装(51)，发明人还生成了编码abca4和myo7a的具有异源itr的双重aavak载体(图17a)。具有异源itr的aav载体在来自血清型2的aav衣壳中包装并在体外测试。

在视网膜中体内进行的实验中，发明人使用aav2/8载体，其有效地转导rpe和pr(10-12)但较差地感染hek293细胞，且具有遍在cba和cmv启动子(11)，或rpe特异性卵黄状黄斑营养不良2(vmd2)(41)或pr特异性视紫红质(rho)和视紫红质激酶(rhok)启动子(10)(表1)。

双重aav载体允许体外高水平的转导。

发明人最初比较了多种oz、双重aavov、ts和杂合ap和ak策略的aav介导的体外大基因转导的效率，具体方法为使用具有遍在启动子(cmv用于egfp、abca4-3xflag和cep290-ha，且cba用于myo7a-ha)aav2/2载体感染hek293细胞(感染复数m.o.i.：各载体为10⁵个基因组拷贝(gc)/细胞)。

使用抗egfp(图2a)、抗3xflag(以检测abca4-3xflag，图2b)、抗myo7a(图2c)和抗ha(以检测cep290-ha)(图12a)抗体通过western印迹分析细胞裂解物。代表性western印迹示于图2a-c和12a。所有策略都导致预期大小的蛋白质的表达。如同预期的那样，仅使用双重aav载体之一进行感染时没有观察到预期大小的条带(图2a-c和12a)。转基因表达的定量(图2d-f)显示，双重aav杂合ap方法导致最低水平的转基因表达，而双重aavov、ts和杂合ak方法比aavoz方法更为有效。双重aavts和杂合ak方法确认了其在cep290的情况下也能有效表达大基因的能力(图12b)。此外，使用具有异源itr的双重aavak载体导致体外全长abca4和myo7a蛋白的表达(图17)。

双重aavts和杂合ak而非ov载体转导小鼠和猪感光细胞。

发明人随后评估了小鼠视网膜中各基于aav的系统的大基因转导。为测试双重aavov(其是转基因特异性的)，发明人使用治疗性abca4和myo7a基因(图3)。发明人使用egfp来评价aavoz和双重aavts、杂合ap和ak方法(图4)。在c57bl/6小鼠中视网膜下递送编码来自遍在cmv启动子的abca4-3xflag的双重aavov载体(各载体的剂量/眼：1.3x10⁹gc)后一个月，对视网膜裂解物的western印迹分析显示稳健的蛋白质表达(图3a)。为确定视网膜中何种细胞类型表达abca4，发明人使用了含有pr特异性rho和rhok或rpe特异性vmd2(各载体的剂量/眼：1x10⁹gc)启动子的双重aavov载体。发明人检测到了使用vmd2注射但不含rho和rhok启动子的视网膜中的abca4蛋白表达(图3a)这些结果也在大白猪视网膜中得到确认。猪视网膜是评价载体效率的极佳模型，原因在于其尺寸(类似于人)，还由于其富含浓缩于条纹状区域的视锥，其视锥密度与灵长类动物的黄斑相当(11)。发明人使用编码abca4-3xflag的双重aavov载体(各载体的剂量/眼：1x10¹⁰gc)视网膜下注射大白猪，且观察到具有cmv但不具有rho启动子的abca4蛋白表达(图3b)。类似地，视网膜下给予编码myo7a-ha的双重aavov载体导致在具有遍在cba的鼠视网膜中的弱myo7a蛋白表达(各载体的剂量/眼：2.5x10⁹gc)且在rho(各载体的剂量/眼：3.2x10⁹gc)启动子的情况下没有可检测的表达(图3c)。总之，这些数据表明，与向pr的大基因转移相比，双重aavov方法对向rpe的大基因转移更有效，其是ird(如stgd和ush1b)的基因治疗的主要靶标。

为寻找在pr中有效转导大基因的基于aav的策略，发明人评估了aavoz和双重aavts、杂合ap和ak方法的视网膜转导性质。发明人最开始使用egfp，其允许我们简单地定位多种视网膜细胞类型(包括pr)中的转基因表达以及正确比较基于aav的大转基因转导水平与单个aavns载体的水平。使用aavns、oz和双重aavts，和杂合ap和ak载体视网膜下注射c57bl/6小鼠(各载体的剂量/眼：1.7x10⁹gc)，所有都在cmv启动子的转录控制下编码egfp。一个月后，眼底相片显示使用aavns和双重aavts和杂合ak方法获得了最高水平的荧光(图15)。视网膜冷冻切片的荧光显微分析显示，可在77％(10/13)的使用aavns和oz载体注射的视网膜；92％(12/13)的使用双重aavts、杂合ap和ak载体注射的视网膜中观察到可检测水平的rpe或pr转导。图4显示各组中最佳转导的视网膜。使用aavns和双重aavts和杂合ak方法获得了最稳健的pr转导水平。

发明人随后在视网膜下给予双重aavts和杂合ak载体(其似乎对于pr中的大基因重建最具吸引力)以及aavns载体(用作比较)后在c57bl/6小鼠中评估pr特异性转导水平(各载体的剂量/眼：2.4x10⁹gc)。所有载体都在pr特异性rho启动子的转录控制下编码egfp。给药后一个月，对视网膜进行冷冻切片并在荧光显微镜下分析(图5a)。所有方法都导致高水平的pr转导，似乎使用单个aavns载体时更一致。发明人在100％(6/6)的使用aavns注射的视网膜；60％(9/15)的使用双重aavts注射的视网膜；71％(10/14)的使用双重aav杂合ak注射的视网膜中发现pr转导。图5a显示各组中最佳转导的视网膜。因此，发明人总结，双重aavts和杂合ak策略允许有效的pr转导，但转导水平低于使用nsaav获得的转导水平。发明人随后确认，视网膜下给予双重aavts和杂合ak载体(各载体的剂量/眼：1x10¹¹gc；全部经注射视网膜中的egfp阳性视网膜：2/2双重aavts；2/2双重aav杂合ak)转导了大白猪的pr(图5b)。

此外，向猪视网膜视网膜下递送双重aavts和杂合ak载体(各载体剂量/眼：1x10¹¹)导致全长abca4-3xflag特异性在pr中(图16a)且全长myo7a-ha在rpe和pr中(图16b)有效地表达。有趣地，与双重aavts载体相比，双重aav杂合ak载体导致pr中大abca4和myo7a蛋白更恒定地表达(图16)。

双重aav载体改善stgd和ush1b小鼠模型的视网膜表型

为理解使用双重aavts和杂合ak方法获得的pr转导水平是否可以是治疗相关的，发明人在两种小鼠ird模型的视网膜中对其进行研究，分别是由大abca4和myo7a基因中突变导致的stgd和ush1b。

虽然小鼠模型没有发生严重的pr变性(42)，但pr外节中不存在abca4编码的全反式视网膜转运蛋白(43-44)导致pr以及rpe中脂褐质的累积，这是rpe产生的pr吞噬作用的结果(45)。结果是，与对照小鼠相比，在abca4-/-小鼠中rpe中的脂褐质颗粒数目和rpe细胞的厚度较大(45)。此外，abca4-/-小鼠模型的特征是延迟的暗适应(57，62)。由于abca4在pr中特异性表达，发明人生成了rho启动子的转录控制下的编码abca4-3xflag的双重aavts和杂合ak载体。在野生型c57bl/6小鼠中视网膜下注射这些载体(各载体的剂量/眼：3-5x10⁹gc)并在一个月后裂解视网膜并使用抗3xflag抗体通过western印迹分析。两种方法都导致稳健但可变水平的abca4-3xflag表达。在使用双重aav杂合ak载体治疗的视网膜中，abca4-3xflag表达水平更一致(图6a)。这些结果在大白猪中得到确认(数据未显示)。此外，使用双重aav杂合akrho-abca4-ha载体(各载体的剂量/眼：1-3x10⁹gc)视网膜下注射一月龄的白化abca4-/-小鼠。三个月后，收获眼且对视网膜切片使用抗血凝素(ha)抗体进行免疫电子显微镜分析确认免疫金颗粒仅正确定位于使用5’和3’双重aav杂合ak载体的组合注射的动物的pr外节中(图6b)。为评估由双重载体表达的abca4蛋白的功能性，发明人还进行了扫描电镜以评估是否存在rpe脂褐质颗粒及其数目(图7)和rpe厚度(图8)。与野生型、年龄匹配的balb/c对照的视网膜中相比，两者在使用对照载体注射的abca4-/-小鼠视网膜中都较高，且都在使用治疗性双重aavts或杂合ak载体注射的眼中降低或标准化(图7b和8b)。此外，与对照视网膜相比，在使用治疗性载体治疗的视网膜中abca4-/-感光细胞从光脱敏中恢复的能力显著提高。

发明人随后测试了sh1小鼠(最常用的ush1b模型(23-24，46-48))的视网膜中双重aav介导的myo7a基因转移的pr转导水平和效力。在sh1小鼠中，马达蛋白myo7a的缺乏导致rpe黑素体的错误定位(47)，其不进入rpe微绒毛，以及pr衔接纤毛处视紫红质的累积(48)。由于myo7a表达于rpe和pr中(22-23)，发明人随后使用双重aavts和杂合ak载体，其在遍在cba启动子的转录控制下表达myo7a-ha。使用双重aav载体(各载体的剂量/眼：1.7x10⁹gc)注射一月龄的野生型c57bl/6小鼠并在一个月后使用抗ha抗体通过western印迹分析来评估洗眼杯裂解物。结果显示，在使用两种方法治疗的视网膜中都存在类似的稳健且恒定的myo7a表达水平(图9)。利用我们的抗myo7a抗体能够识别鼠和人myo7a，我们比较了向sh1-/-眼递送双重aav载体后的myo7a水平与sh1+/+眼中内源性表达的水平(图14)。我们使用cba(图14，左图，各载体的剂量/眼：1-6x10⁹gc)和rho启动子(图14，右图，各载体的剂量/眼：2x10⁹gc)以区分pr和rpe中实现的myo7a表达与仅pr中实现的myo7a表达：前者是约20％(图14，左图)而后者最高是内源性myo7a的约50％(图14，右图)。我们的分析还显示，双重aav杂合ak在pr中实现的myo7a表达水平高于使用双重aavts载体获得的表达水平，但转导的视网膜的数目是类似的(ts-myo7a：在8个注射的动物中有3个视网膜阳性；ak-myo7a：在8个治疗的动物中有4个视网膜阳性；图14，右图)。

为测试表达自双重aav载体的myo7a拯救sh1-/-视网膜缺陷的能力，发明人随后在一月龄的sh1小鼠中视网膜下注射cba组的双重aavts和杂合ak载体(各载体的剂量/眼：2.5x10⁹gc)。发明人分别通过分析半薄视网膜切片和免疫电子显微镜来评估rpe黑素体(图10)和视紫红质定位(图11)。不同于未受感染的sh1+/-，sh1-/-黑素体在递送对照载体(双重aav策略的各单个5’一半，图10)后不进入rpe微绒毛。递送编码myo7a的双重aavts或杂合ak载体后，在顶部正确定位的rpe黑素体数目显著增加(图10b)。显著地，发明人还发现，双重aavts和杂合ak载体介导的myo7a表达减少了sh1-/-pr衔接纤毛处的视紫红质累积(图11)。

讨论

虽然aav介导的基因治疗在动物模型和患有遗传性失明病症的患者中有效(5-9，49)，但其在影响视网膜和需要转移大于5kb的基因(称作大基因)的疾病中的应用受限于aav有限的装载能力。为解决该问题，发明人比较了多种用于大基因转导的基于aav的策略的效率，包括：aavoz和双重aavov，ts和杂合方法(体外和在小鼠和猪视网膜内)。在先前的实验中，发明人从f1噬菌体基因组中选择了77bp序列，发明人鉴定了其重组发生性质并用于双重杂合方法(ak，双重aav杂合ak)。

发明人的体外和体内结果显示，在转导水平上，双重aav杂合ak出乎意料地优于双重aav杂合ap且发明人测试的所有双重aav策略都优于aavoz载体(双重aav杂合ap除外)。这可以解释为与oz基因组相比双重aav基因组群体的均一大小，其可有利于生成转录活性的大转基因表达盒。

与ts或杂合ak方法相比时该双重aavov方法似乎特别有趣，因为双重aavov载体仅含有属于治疗性转基因表达盒的序列。然而，当发明人向成年小鼠和猪的视网膜下空间给予双重aavov载体时，发明人仅在使用遍在启动子或rpe特异性启动子而非pr特异性启动子时能够检测大abca4蛋白质的表达。这可能表明，与在pr中相比，双重aavov重建所需的同源重组在rpe中

双重aavts和杂合ak方法有效地转导小鼠和猪pr，不同于发明人使用双重aavov观察到的结果。这与以下认知一致：双重aavts和杂合ak方法介导的大基因重建的机制可以是通过itr介导的头对尾重新接合(32，35，51)而非同源重组。

与使用单一的ns载体相比，发明人使用双重aavts和杂合ak实现的小鼠pr转导水平较低且较不恒定。然而，双重aav可有效地治疗需要相对低水平转基因表达的遗传性失明病症，即以常染色体隐性方式遗传的疾病。实际上，发明人证明，双重aavts和杂合ak的视网膜下递送改善甚至正常化了两种遗传性视网膜疾病的动物模型(stgd和ush1b)的视网膜缺陷，这两种疾病是由于大基因中突变导致的并且是基因治疗的富有吸引力的靶标。

双重aav载体的基因组大小是均匀的，这表示涉及其应用的一致性和安全性问题应少于涉及aavoz载体的问题，其具有不均匀基因组大小。相反地，发明人在小鼠中未检测到erg或视网膜组织学异常，发明人在双重aav载体递送后追踪了长达1-2个月(数据未显示)。

总之，发明人鉴定了一种新的重组发生序列(ak)，其显著改善aav双重杂合载体系统的性能。事实上，其发现双重aav载体在体外和在体内视网膜中都有效。虽然双重aavov载体有效地转导rpe，其不转导pr，而双重aavts和杂合ak方法在两种细胞类型中都驱动有效的大基因重建。给予双重aavts和杂合ak方法改进了stgd和ush1b的小鼠模型的视网膜表型，提供这些策略用于针对这些和其他失明病症的基因治疗的效力的证据，所述病症需要向视网膜pr以及rpe进行大基因转移。这些发现将显著拓宽aav载体在基因治疗中的应用，不仅是应用于眼，还应用于肌肉以及其他器官和组织。大于5kb的缺陷基因导致的除ird以外的疾病包括以下非限制性示例：肌营养不良、营养障碍素缺陷(肢带型肌营养不良2b型和三好氏远端肌肉病变)、囊胞性纤维症、血友病。

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