阿尔兹海默症关键致病因子app的基因工程细胞株和药物筛选模型的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种阿尔兹海默症关键致病因子app的基因工程细胞株，该细胞株可用于阿尔兹海默症的诊断试剂盒开发和药物筛选。

背景技术：

阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease,AD)与肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿舞蹈症、帕金森症，并称为四大神经退行性疾病。AD病人在发病过程中逐渐丧失记忆及其它认知能力，由最初的记忆减退发展为重度痴呆，生活无法自理且死于并发症。该病进展缓慢，严重影响了患者的身心健康。AD疾病给患者、家庭及社会带来了巨大的精神和经济负担，目前世界上已经确诊的AD病例约为3600万，据推测，到2050年AD患者将为目前的3倍^[1]。迄今为止，人们仍然不了解AD的发病机理，缺乏有效的诊断、治疗方法。

神经元细胞外大量的β淀粉样蛋白(Amyloidβ，Aβ)沉积是AD主要病理特征^[2]，Aβ由前体APP经蛋白酶剪切形成^[3]。通过对APP功能研究，从而为揭示AD疾病致病机制、针对APP开发有效的药物及治疗方法提供重要的线索。

CRISPR/Cas技术是最近兴起的一项基因组编辑技术。CRISPR/Cas系统包含具有核酸酶活性的CRISPR相关(Cas)基因和crRNA和tracrRNA这两种决定切割位点特异性的非编码RNA^[4]。crRNA和tracrRNA相互碱基配对形成tracrRNA/crRNA复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。我们通过人工设计这两种RNA，改造形成具有引导作用的sgRNA(short guide RNA)，来实现Cas9蛋白对DNA的定点切割^[5‐6]。目前尚未见相关报道利用CRISPR/Cas技术实现对阿尔兹海默症app基因的敲除，以获得体外培养的人类细胞app基因缺失的细胞株。

参考文献

[1]Wimo,A.,and Prince,M.(2010).World Alzheimer Report 2010:The Global Economic Impact of Dementia(London:Alzheimer’s Disease International),pp.1–56.

[2]John Hardy,Dennis J.Selkoe.The Amyloid Hypothesis of Alzheimer's Disease:Progress and Problems on the Road to Therapeutics.Science 2002；297:353-356

[3]Clive Ballard,Serge Gauthier,Anne Corbett,Carol Brayne,Dag Aarsland,Emma Jones.Alzheimer’s disease.Lancet 2011；377:1019–31

[4]Cong L,Ran FA,Cox D,Lin S,Barretto R,Habib N,et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science 2013；339(6121):819-23.

[5]Jinek M,Chylinski K,Fonfara I,Hauer M,Doudna JA,Charpentier E.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 2012；337(6096):816-21.

[6]Mali P,Yang L,Esvelt KM,Aach J,Guell M,DiCarlo JE,et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science 2013；339(6121):823-6.

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种阿尔兹海默症致病基因app的基因工程细胞株及药物筛选模型，可用于阿尔兹海默症的诊断试剂盒开发和药物筛选。

进一步地，所述的质粒是指用于阿尔兹海默症致病基因app敲除的插入有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示碱基序列的Cas9敲除质粒。

进一步地，本发明基因工程细胞株是指app基因纯合缺失，杂合缺失的哺乳动物细胞。

本发明应用Cas9技术敲除app基因，采用DNA-Lipofectamine^TM 2000转染方法，实现了阿尔兹海默症app基因缺失细胞株的构建，可以应用在app基因在细胞中的相关功能及导致AD的分子机制的研究中。

本发明是通过以下技术方案实现的，具体步骤如下：

1、app基因敲除Cas9质粒的构建：

2、稳定转染：用DNA-Lipofectamine^TM 2000瞬时转染的方法将基因跨膜结构域编码区敲除的Cas9质粒转染进哺乳动物细胞，用抗生素进行筛选并用有限稀释法将细胞进行单克隆化。

所述的哺乳动物细胞为HeLa、K562、HEK293、A549、MCF-7、LNCap、N2a SH-SY5Y或者其它哺乳动物细胞中的任一种。

附图说明

图1 Cas9结合区域。

图2 Cas9质粒载体的图谱。

图3 Cas9蛋白表达质粒载体PX335结构示意图。

图4直接测序检测Cas9表达载体对app基因的敲除的有效性。

图5 Cas9敲除后的APP蛋白表达检测。

具体实施方式

下面对本发明的实施例结合附图作详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下实施，给出了具体实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。凡依照本发明公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

主要试剂及检测试剂盒：HeLa细胞，Cas9敲除载体质粒PX335，购自addgene公司；转染试剂lipofectin2000购自Invitrogen公司；DMEM、胎牛血清FBS购自Hyclone公司；APP抗体购于Sangon，二抗Anti-Rabbit IgG为美国GE公司产品；其他试剂均为进口和国产分析纯试剂。实施例中，酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

实施例1 app基因的敲除

一、Cas9技术敲除HeLa细胞app基因

本实施方式根据app基因的外显子序列设计并构建Cas9载体，如图1，选择的Cas9序列SEQ ID NO.1对应app基因的第2号外显子上。下划线的部分为Cas9的识别部位，小写部分是Cas9中的Cas9蛋白的切割位点。在选定Cas9以后对全基因组进行查重，确认本Cas9位点是唯一的，保证了基因敲除的可控性并降低了基因敲除脱靶率。

CCCACTGATGGTAATGCTGGCCTgctggctgaaCCCCAGATTGCCATGTTCTGTGG

SEQ ID NO.1

PX335质粒是一种Cas9蛋白表达载体，如图2所示。限制性内切酶BbsI酶切后会产生粘性末端GTGG和粘性末端GTTT。借助这一特性，我们设计产生sgRNA的引物两条链后面分别加上了CACC和CAAA，与BbsI消化后的PX335质粒产生的粘性末端碱基互补，如图3所示。具体为：

二、app基因Cas9敲除质粒的构建

将设计好的引物委托生物技术公司合成。引物合成后SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3退火反应，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5退火反应，使其分别成为带有粘性末端的双链DNA片段。退火程序如下：

95℃，5min；95℃-25℃梯度降温，-5℃/min；12℃，∞。利用BbsI酶切位点将双链DNA片段分别克隆到载体质粒PX335上。转化至DH10B中，37℃过夜扩增培养，得到含有完整Cas9质粒的转化子。提取质粒经测序正确，确认所得Cas9质粒为所设计的质粒。

二、编码序列Cas9敲除质粒转染

(1)接种细胞。转染前一天将HeLa细胞接种至六孔板内。细胞接种数量视其生长速度而定，一般为1×10⁶个细胞。转染时要求细胞汇合度为80～90％。

(2)将分别取实施例1中得到的Cas9敲除质粒载体DNA 4μg加至OPTI-MEM培养基使其终体积为250μl，混匀，得到DNA悬液。

(3)将Lipofectamine2000放置于4℃冰盒架子或者冰上，使用前低转速离心，取10μl的Lipofectamine2000加至另外240μl的OPTI-MEM中，轻轻混匀，此步骤操作要迅速以免脂质体在室温下暴露时间过长影响后面转染效率，而后将混合物室温静置5分钟。

(4)将DNA悬液(250μl)和Lipofectamine2000(250μl)悬液混合，总体积500μl，轻轻混匀，室温静置20分钟。

(5)将DNA和Lipofectamine2000混合液加至六孔板的孔内，前后左右晃动孔板混匀，置于培养箱中培养。

(6)转染4～6小时后细胞换液，换成含抗生素正常培养基，六孔板容量每孔2ml培养基。

(7)转染细胞48～72h后，收集5/6的细胞，用于基因敲除验证的基因组提取。剩余部分直接分散为细胞悬液，分入96孔板中分离单克隆。

实施例2 Cas9敲除app基因有效性的检测

针对Cas9特异敲除位点上下游设计引物，其序列为：

引物F 5’-GATAGTTATCCCTGTTCTTCCTCCA-3’ SEQ ID NO.6

引物R 5’-CATTTATATGTATATCATAGGGTAATGC-3’ SEQ ID NO.7

收集转染48～72小时的Hela细胞，提取到的转染细胞基因组，使用引物F和引物R引物进行PCR，其扩增条件为：

94℃5min；

94℃45s，56℃30s，72℃45s，(30～35个循环)；

72℃5min。

3％琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统检测，PCR扩增Cas9作用靶位点片段长度约为425bp，经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段连接T载体，转化感受态细胞E.coli.DH5α，12h后测定靶序列以统计PCR产物片段中的突变比例和突变类型。如附图4所示，片段测序出现套峰，认为Cas9在此过程中对靶基因产生切割作用，说明在靶向敲出区域存在着敲出后的移码突变修复。

再通过有限稀释法进行单克隆分离。

实施例3 Western blot检测APP蛋白表达

对于得到的实施例2中得到的单克隆细胞株待其在60mm细胞培养皿中长至80～90％时，胰酶消化，裂解细胞，提取蛋白，用酶标仪测定蛋白浓度，取45ug上样SDS-PAGE电泳，用10％分离胶，5％浓缩胶，PVDF膜湿转，转膜时间1h，Sangon#AB60097b孵育1h，Goat-Anti-rabbit二抗孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。如附图5所示，跟正常HeLa细胞比较，31^#，34^#，35^#细胞株中APP蛋白缺失。