一种针对PI3K的纳米抗体及其临床应用的制作方法

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及针对于PI3K的纳米抗体及其编码序列。

背景技术：

1993年比利时科学家Hamers.R在骆驼体内发现，与传统抗体相比，在骆驼血液中的抗体，有一半没有轻链，只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。克隆该重链抗体的可变区得到最小的抗原结合片段，即纳米抗体（Nanobody，Nb）。纳米抗体的单域性质使其较普通抗体具有以下独特性能：1）分子量小，可穿透血脑屏障，较易作用于病灶区；2）在原核或者真核系统中可高表达；3）特异性强、亲和力高；4）高耐热性和化学稳定性；5）对人的免疫原性弱。其在肿瘤、感染性疾病、肠炎、淀粉样变疾病、血栓以及动脉粥样硬化病变的诊断和治疗方面具有良好的应用效果，同时可以显著降低成本。纳米抗体的以上特性使其在诊断检测领域展现出广阔的应用前景。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有100多万妇女患有乳腺癌，平均每13分钟就有一位女性死于乳腺癌。平均每两分半钟即有一位女性被诊断为乳腺癌患者。我国女性乳腺癌发病率以每年3%-4%的速度递增，其死亡率排在女性癌症死亡率之首，患者明显趋向年轻化。调查显示，每8位女性中就有1位遭受乳腺癌的威胁。面对这一严峻形势，我国已将筛查乳腺癌疾病纳入全民公共卫生服务项目，以此来降低患病率及死亡率。在乳腺癌中PI3K-AKT通路的活化率高达70%，并且其在原发性和转移性乳腺癌中发生都比较频繁。目前常规检测是对患者的活检组织进行定性、半定量方法免疫组化（IHC），但此法耗时较长且操作繁琐。因此为了及时对乳腺癌PI3K表达的特异性检测过表达患者进行个体化、靶向性有效的治疗，制备乳腺癌PI3K的纳米抗体来进行疾病检测及治疗具有广阔的前景。

目前，也没有针对乳腺癌PI3K为靶标的特异性纳米抗体及临床检测试剂的研究报道。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种针对PI3K的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。

技术方案：本发明的技术方案为：

本发明的第一方面，提供了一种针对PI3K重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4。

所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

优选地，所述的PI3K纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

本发明第二方面，一种针对PI3K重链抗体VHH，此抗体特异性识别PI3K抗原，包括一条具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH链。

本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的PI3K重链抗体VHH。

优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：9。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明将血液中提取的PI3K免疫新疆单峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于PI3K的纳米抗体基因库，试验中将PI3K偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对PI3K特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

附图说明

图1是PI3K纳米抗体的基因电泳图；其中泳道1是DNA分子标准，泳道2是PCR扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，PCR产物条带约为700bp。

图2是PI3K纳米抗体的DNA琼脂糖凝胶电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为1000bp的分子标记，其余孔道为PCR扩增重链抗体可变区片段产物，PCR产物条带约为500bp；

图3是是构建的单域抗体文库的插入率检测结果，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为DNA分子标记，其余孔道为检测插入片段的PCR产物，经检测，该文库的插入率达到90％以上。

图4是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将PI3K蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液。

图5是表达的PI3K纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，其余泳道是 250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱下来的纳米抗体，结果显示PI3K纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95%以上。

图6是PI3K纳米抗体在不同环境温度下的耐受性检测。

具体实施方式

本发明首先将PI3K的可溶性蛋白作为抗原免疫一只新疆单峰驼，经过5次免疫之后提取该单峰驼外周血淋巴细胞并构建了PI3K特异的单域重链抗体文库。将PI3K偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得PI3K的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选PI3K免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

针对于PI3K的纳米抗体文库的构建：

（1）首先合成抗原PI3K，用于免疫所用的PI3K的浓度为500μg/mL，每次免疫将0.5mgPI3K与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫5次，除第一次使用完全的弗氏佐剂（购自sigma），剩余几次全部使用弗式不全佐剂（购自sigma），免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。（2）5次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取总RNA参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。（3）按照Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：

第一轮PCR：

上游引物GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC

下游:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，54℃退火，25个循环；结果如图1显示该片段的大小约为700bp，即从左到右的DNA条带分别是：第一为DNA的分子Marker，第二单域抗体基因电泳带约为700bp。

第二轮PCR：

以第一轮PCR产物作模板，

上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段（长片段和短片段），60℃退火，17个循环，回收目的片段，结果如图2显示，该片段的大小约为500bp，即从左到右的DNA条带分别是：第一为DNA分子Marker，第二纳米抗体基因电泳带约为500bp。（4）使用限制性的内切酶（购自NEB）PstI及NotI酶切20μg pComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μg VHH并用T4 DNA连接酶（购自TaKaRa公司）连接两个片段。（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1（北京神州红叶科技有限公司）中，构建PI3K的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为3.1×10⁸。与此同时，通过菌落PCR检测引物使用第二轮PCR引物，Tm55℃。文库构建完成后，为检测文库的插入率，随机选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示插入率已达到90%以上。

实施例2

针对PI3K的纳米抗体筛选过程：

（1）将溶解在PBS中的100μg/mL的PI3K包被在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。（2）第二天两个孔中分别加入200μL1%牛奶，室温封闭2小时。（3）2小时后，加入100μL噬菌体（8×10¹¹tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库），在室温下作用1小时。(4）用 PBST（PBS中含有0.05%吐温20）洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体。(5）用三乙基胺（100mM）将与PI3K特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复2轮。结果如图4显示：在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中PI3K特异抗体的目的。

实施例3

用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆：

该实验的原理模式图如图4所示，具体检测如下：

（1）从3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素的TB培养基(1L TB培养基中含有2.3g磷酸二氢钾，12.52g磷酸氢二钾，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1mmol的IPTG，28℃培养过夜。（2）利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。（7）将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mL的LB液体中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终得到氨基酸序列SEQ ID NO：8所示的纳米抗体

实施例4

纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：

（1）将前面测序分析所获得两种纳米抗体亚克隆至表达性的载体PET32a中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌DE3中，其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基的板上，37℃过夜。（2）挑选单个菌落接种在15mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。（3）接种1mL的过夜菌种至330mLLB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜。（4）第二天，离心收菌。（5）将菌体破碎以获得抗体粗提液。（6）经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液（50mmol）用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液（250mmol，500mmol）最终可制备纯度达90%以上的蛋白。图5所示从左到右的条带分别是：第一为标准蛋白分子，第二第三250mmol咪唑的洗脱液洗脱的蛋白样品；结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到95%以上。

实施例5

生物素化纳米抗体及其纯化方法：

（1）将针对PIK3的纳米抗体基因片段亚克隆至pBAD载体上，随后构建好的质粒pBAD与质粒BirA共转至大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37℃培养过夜；（2）挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；（3）接种1mL的过夜菌种至330mL含氨苄青霉素和氯霉素的TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.4-0.5时，加入330μl50mM的D-生物素（D-biotion）溶液，37℃慢摇1h；（4）加入终浓度为1mMIPTG，28℃摇床培养过夜；（4）离心，收菌；（5）利用渗透法，获得抗体粗提液；（6）使用链霉亲和素磁珠纯化偶联生物素的纳米抗体。

实施例6

PI3K纳米抗体温度耐受性检测：

（1）将PI3K纳米抗体分别放置于不同温度条件下：25℃ 24h，30℃ 24h，37℃ 24h，45℃ 24h，75℃ 1h，95℃ 1h；（2）将PI3K蛋白经碳酸盐透析后包被在酶标板上，同时做空白孔对照（只包被NaHCO₃）；（3）将不同处理的PI3K纳米抗体分别转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1h；（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1h；（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1h；（6）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，放置于ELISA酶标仪上，在405nm波长读取吸光度值。结果如图6所示，PI3K纳米抗体有较好的温度耐受性，PI3K纳米抗体的耐高温特性也为我们之后结合光电化学免疫传感器进行高特异性和高灵敏度的检测提供了可能。

实施例7

利用电阻抗检测PIK3

(1)将玻碳电极先后用0.3和0.05μm的氧化铝打磨，超声，待用；(2)运用传统的三电极系统，首先将电极放置在0.5M的H2SO4中反应，使之修饰带有羧基官能团；之后用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)处理电极表面，使其在电极表面形成酰胺键。(3)在电极上滴加20μL溶解在pH7.4PBS中(100μg/mL)链霉亲和素，室温放置1h，在电 极上修饰链霉亲和素。(4)在电极上孵育0.5％的BSA，室温放置0.5h。(5)在电极表面修饰20μL上述添加生物素的纳米抗体(100μg/mL)，室温放置1h。(6)在不同电极上分别滴加20μL梯度稀释的PIK3(抗原浓度为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、100ng/mL、5ng/mL、10ng/mL)，室温孵育1小时；(6)通过电化学工作站，测量不同浓度抗原所对应的循环伏安(CV)和电阻抗值(EIS)。对电阻抗数据进行拟合，得到PIK3的检测线性。基于本实验，本发明所制备的纳米抗体可以应用于制备医学检测和诊断试剂用于定性或定量的检测PIK3含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

本发明提供一个PI3K纳米抗体，每个纳米抗体提供骨架区和互补决定区，其中所述的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4和互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸和氨基酸序列分别为：

PI3K纳米抗体

骨架区和互补决定区的核苷酸序列：

FR1:CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT

FR2: TGGTTCCGACAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTGGGTCGCAGGT

FR3:TGCAGTGCCGCCTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTTCCAAGACGTCGCCAAGAACACGGTGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCGTATACTACTGT

FR4: TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

CDR1: GGATACACCTCCAGTAGCAACTACATGGGA

CDR2: ATTGAAGCTCGTGCTGGTGGCACA

CDR3:GCGGCAGATTGGGTCCGGGGTGATTTTTGCTCAGGCGATGTTGACTTTCGTTAT

骨架区和互补决定区的氨基酸序列：

FR1: QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAAS

FR2: WFRQAPGKQREWVAG

FR3: CSAASVKGRFTIFQDVAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC

FR4: WGQGTQVTVSS

CDR1: GYTSSSNYMG

CDR2: IEARAGGT

CDR3: AADWVRGDFCSGDVDFRY

整体核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCTCCAGTAGCAACTACATGGGATGGTTCCGACAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTGGGTCGCAGGTATTGAAGCTCGTGCTGGTGGCACATGCAGTGCCGCCTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTTCCAAGACGTCGCCAAGAACACGGTGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCGTATACTACTGTGCGGCAGATTGGGTCCGGGGTGATTTTTGCTCAGGCGATGTTGACTTTCGTTATTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

整体氨基酸序列： QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTSSSNYMGWFRQAPGKQREWVAGIEARAGGTCSAASVKGRFTIFQDVAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC AADWVRGDFCSGDVDFRY WGQGTQVTVSS