抗CD30蛋白单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合CD30蛋白的单克隆抗体UMAB256、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术：

CD30是肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)成员之一，双名TNFRSF8，是一种分子量为120kDa的细胞表面I型跨膜糖蛋白。CD30广泛分布于活化T细胞、B细胞、传染性单核细胞症的异型淋巴细胞、未分化大细胞等，参与细胞活化和分化。通过参与NF-κB等活化信号的传导，调节细胞免疫的激活过程中。CD30可与CD153(CD30L)结合，限制自身反应性CD8+T细胞增殖，保护机体免遭自身免疫。

在多项淋巴瘤发病过程的研究中发现，CD30的表达可显著升高于霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)和间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphomas，ALCL)，而低表达于非病理状态下活化的T细胞、B细胞表面。正常细胞不表达白细胞分化抗原30(CD30)。近年来针对CD30的靶向治疗已成为一个潜在的治疗措施，研究较多的是CD30抗体及其相关药物的开发。使其成为一个颇具潜力的淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点。目前临床上常用免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而IHC实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对CD30蛋白的单克隆抗体对IHC检测CD30表达水平具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的CD30蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测CD30蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2016年11月22日，保藏编号为CGMCC No.13287。

本发明还提供了一种特异性结合CD30蛋白的单克隆抗体UMAB256，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据CD30ORF核苷酸序列(CD30ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，1788bp；CD30氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)

设计引物PCR扩增CD30ORF第1222bp位到第1785bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pET23a-N-His，构建CD30氨基酸序列第408位到第595位的重组表达质粒pET23a-N-His-rCD30；上游扩增引物序列，SEQ ID NO.3:CACGCGATCGCCCACCGGAGGGCCTGCAGG下游扩增引物序列SEQ ID NO.4:ACCGACGCGTCTACTTTCCAGAGGCAGCTGT

(2)CD30重组蛋白的表达与纯化：将CD30重组表达质粒转化E.coli细胞，裂解离心获得上清，镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的CD30重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的CD30重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗CD30特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为UMAB256，亚型鉴定为IgG1；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得CD30单克隆抗体UMAB256。分别通过Western Blot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

进一步采用OriGene高密度蛋白芯片对上述单克隆抗体的特异性进行验证：OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。

本发明将所述单克隆抗体UMAB256与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示本发明所述单克隆抗体UMAB256特异性结合CD30蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。

本发明还提供了单克隆抗体UMAB256在制备用于检测CD30蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体UMAB256，可检测组织细胞中CD30的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与CD30的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.13287)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体UMAB256。本发明还提供了单克隆抗体UMAB256在制备用于检测CD30蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体UMAB256的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体UMAB256在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与CD30蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了CD30蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤组织中CD30蛋白表达水平，可应用于间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株UMAB256的分类命名为：CD30鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年11月22日；

保藏编号：CGMCC No.13287。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为ORF区；

图2示实施例2重组CD30蛋白Western blot检测结果图，以anti-HIS检测重组CD30蛋白在E.coli细胞中的表达，其中左侧泳道为转染空载体的E.Coli细胞裂解液为抗原的检测结果、右侧泳道为转染pET23a-N-His-rCD30质粒的E.coli细胞裂解液抗原的检测结果；

图3示实施例2重组CD30蛋白SDS-PAGE结果图，用镍柱亲和层析柱纯化重组CD30蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色；

图4示实施例3以单克隆抗体UMAB256识别完整的CD30(Full length CD30,CD30-FL)蛋白的Western blot检测结果图。泳道1为转染pCMV6-Entry的细胞裂解液；泳道2为转染pCMV6-CD30-FL的细胞裂解液；

图5示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人淋巴瘤组织免疫组化结果图(一抗为CD30单克隆抗体UMAB256)；

图6示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的正常人扁桃体组织免疫组化结果图(一抗为CD30单克隆抗体UMAB256)；

图7示实施例5OriGene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为CD30单抗UMAB256，1:100；二抗为DyLight649-conjugated AffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，1:400)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、CD30重组表达质粒的构建

以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒RC219819(含CD30 ORF 1788bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆入表达载体pET23a-N-His，建立CD30重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。

实施例2、CD30重组蛋白的表达与纯化

1、转化E.coli细胞：将100ul感受态细胞置于冰上融化后加入质粒DNA轻混匀，冰浴30min后42℃热激90s，然后将其继续冰浴1-2min。在超净台内加入500ul新鲜无抗LB培养基，于37℃摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

2、裂解细胞：挑取单克隆于新鲜培养基中，37℃、200rpm培养至OD值达到0.4～0.6时加入IPTG(终浓度1mM)诱导培养7h。离心收集菌体，然后用裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎20min后于4℃下12000rpm离心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-His抗体做WB鉴定，见图2。

3、镍柱亲和层析柱纯化：用缓冲液平衡镍柱，将上清用0.45μm滤膜过滤后上样并收集流出，用缓冲液淋洗去除未结合的蛋白，最后用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱，分别收集后进行SDS-PAGE鉴定，将符合要求的洗脱蛋白合并并加入10％甘油，纯化后的重组CD30蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图3。

由图2结果可见，转染pET23a-N-His-rCD30质粒的E.coli细胞裂解液中WB检测后在～25kD处有明显的特异条带，与CD30蛋白氨基酸第408到595位的实际分子量基本相符。表明细胞中重组CD30蛋白特异表达。

由图3结果可见，纯化的蛋白在PAGE胶～25kD处有明显的特异条带，与CD30蛋白氨基酸第408到595位的实际分子量基本相符。表明已获得了纯度较好的CD30重组蛋白。

实施例3、CD30单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的CD30蛋白片段用于对Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的CD30抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄Balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用Balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用CD30纯化重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为UMAB256。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1mL注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株UMAB256产生的单抗为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、WB检测、分装、冻存在-20℃。其中WB检测结果见图4。

由图4结果可见，泳道2在分子量约100kD处有特异的条带，表明单克隆抗体UMAB256能特异地Western blot检测完整的全长CD30蛋白。

实施例4、单克隆抗体UMAB256为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、取福尔马林固定的人淋巴瘤组织和正常人的扁桃体组织块进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(0.01M，pH6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入CD30单抗(UMAB256)，稀释比：1:150，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。PBST(0.02％Tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加Polink-试剂盒2(Catlog No.D37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Polink-2试剂盒(Catlog No.D37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。

8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min x 3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图5-6。

(2)、实验结果：

由图5-6结果可见，在人淋巴瘤组织和正常人的扁桃体组织中可见到特异性膜染色。结果与CD30在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体UMAB256可用于免疫组织化学检测CD30蛋白的水平。

实施例5、单克隆抗体UMAB256的特异性检测

OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片进行UMAB256抗体鉴定实验的实验方法：

1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中，使用40mL去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。

2、向50mL离心管中加入40mL5％脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗UMAB256，稀释比列为1:100。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50mL离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mL PBST(0.1％Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗DyLight649-conjugated AffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，稀释比例为1:400。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accession number)，蛋白ID，蛋白大小等信息。

结果如图7所示，单抗UMAB256在OriGene蛋白芯片上能特异地识别CD30蛋白，表明单抗UMAB256的特异性较好。

SEQUENCE LISTING

<110>无锡傲锐东源生物科技有限公司

<120>抗CD30蛋白单克隆抗体及其用途

<210> 1

<211>1788

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

ORIGIN

//

1 ATGCGCGTCC TCCTCGCCGC GCTGGGACTG CTGTTCCTGG GGGCGCTACG AGCCTTCCCA

61 CAGGATCGAC CCTTCGAGGA CACCTGTCAT GGAAACCCCA GCCACTACTA TGACAAGGCT

121 GTCAGGAGGT GCTGTTACCG CTGCCCCATG GGGCTGTTCC CGACACAGCA GTGCCCACAG

181 AGGCCTACTG ACTGCAGGAA GCAGTGTGAG CCTGACTACT ACCTGGATGA GGCCGACCGC

241 TGTACAGCCT GCGTGACTTG TTCTCGAGAC GACCTCGTGG AGAAGACGCC GTGTGCATGG

301 AACTCCTCCC GTGTCTGCGA ATGTCGACCC GGCATGTTCT GTTCCACGTC TGCCGTCAAC

361 TCCTGTGCCC GCTGCTTCTT CCATTCTGTC TGTCCGGCAG GGATGATTGT CAAGTTCCCA

421 GGCACGGCGC AGAAGAACAC GGTCTGTGAG CCGGCTTCCC CAGGGGTCAG CCCTGCCTGT

481 GCCAGCCCAG AGAACTGCAA GGAACCCTCC AGTGGCACCA TCCCCCAGGC CAAGCCCACC

541 CCGGTGTCCC CAGCAACCTC CAGTGCCAGC ACCATGCCTG TAAGAGGGGG CACCCGCCTC

601 GCCCAGGAAG CTGCTTCTAA ACTGACGAGG GCTCCCGACT CTCCCTCCTC TGTGGGAAGG

661 CCTAGTTCAG ATCCAGGTCT GTCCCCAACA CAGCCATGCC CAGAGGGGTC TGGTGATTGC

721 AGAAAGCAGT GTGAGCCCGA CTACTACCTG GACGAGGCCG GCCGCTGCAC GGCCTGCGTG

781 AGCTGTTCTC GAGATGACCT TGTGGAGAAG ACGCCATGTG CATGGAACTC CTCCCGCACC

841 TGCGAATGTC GACCTGGCAT GATCTGTGCC ACATCAGCCA CCAACTCCTG TGCCCGCTGT

901 GTCCCCTACC CAATCTGTGC AGCAGAGACG GTCACCAAGC CCCAGGATAT GGCTGAGAAG

961 GACACCACCT TTGAGGCGCC ACCCCTGGGG ACCCAGCCGG ACTGCAACCC CACCCCAGAG

1021 AATGGCGAGG CGCCTGCCAG CACCAGCCCC ACTCAGAGCT TGCTGGTGGA CTCCCAGGCC

1081 AGTAAGACGC TGCCCATCCC AACCAGCGCT CCCGTCGCTC TCTCCTCCAC GGGGAAGCCC

1141 GTTCTGGATG CAGGGCCAGT GCTCTTCTGG GTGATCCTGG TGTTGGTTGT GGTGGTCGGC

1201 TCCAGCGCCT TCCTCCTGTG CCACCGGAGG GCCTGCAGGA AGCGAATTCG GCAGAAGCTC

1261 CACCTGTGCT ACCCGGTCCA GACCTCCCAG CCCAAGCTAG AGCTTGTGGA TTCCAGACCC

1321 AGGAGGAGCT CAACGCAGCT GAGGAGTGGT GCGTCGGTGA CAGAACCCGT CGCGGAAGAG

1381 CGAGGGTTAA TGAGCCAGCC ACTGATGGAG ACCTGCCACA GCGTGGGGGC AGCCTACCTG

1441 GAGAGCCTGC CGCTGCAGGA TGCCAGCCCG GCCGGGGGCC CCTCGTCCCC CAGGGACCTT

1501 CCTGAGCCCC GGGTGTCCAC GGAGCACACC AATAACAAGA TTGAGAAAAT CTACATCATG

1561 AAGGCTGACA CCGTGATCGT GGGGACCGTG AAGGCTGAGC TGCCGGAGGG CCGGGGCCTG

1621 GCGGGGCCAG CAGAGCCCGA GTTGGAGGAG GAGCTGGAGG CGGACCATAC CCCCCACTAC

1681 CCCGAGCAGG AGACAGAACC GCCTCTGGGC AGCTGCAGCG ATGTCATGCT CTCAGTGGAA

1741 GAGGAAGGGA AAGAAGACCC CTTGCCCACA GCTGCCTCTG GAAAGTAG

<210> 2

<211>595

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 2

ORIGIN

//

1 MRVLLAALGL LFLGALRAFP QDRPFEDTCH GNPSHYYDKA VRRCCYRCPM GLFPTQQCPQ

61 RPTDCRKQCE PDYYLDEADR CTACVTCSRD DLVEKTPCAW NSSRVCECRP GMFCSTSAVN

121 SCARCFFHSV CPAGMIVKFP GTAQKNTVCE PASPGVSPAC ASPENCKEPS SGTIPQAKPT

181 PVSPATSSAS TMPVRGGTRL AQEAASKLTR APDSPSSVGR PSSDPGLSPT QPCPEGSGDC

241 RKQCEPDYYL DEAGRCTACV SCSRDDLVEK TPCAWNSSRT CECRPGMICA TSATNSCARC

301 VPYPICAAET VTKPQDMAEK DTTFEAPPLG TQPDCNPTPE NGEAPASTSP TQSLLVDSQA

361 SKTLPIPTSA PVALSSTGKP VLDAGPVLFW VILVLVVVVG SSAFLLCHRR ACRKRIRQKL

421 HLCYPVQTSQ PKLELVDSRP RRSSTQLRSG ASVTEPVAEE RGLMSQPLME TCHSVGAAYL

481 ESLPLQDASP AGGPSSPRDL PEPRVSTEHT NNKIEKIYIM KADTVIVGTV KAELPEGRGL

541 AGPAEPELEE ELEADHTPHY PEQETEPPLG SCSDVMLSVE EEGKEDPLPT AASGK