功能蛋白POX08415及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及遗传工程领域，具体涉及一种功能蛋白POX08415及其编码基因与应用。
背景技术：
：丝状真菌可以将木质纤维素类物质转化为微生物可发酵的糖类，进一步发酵生产可增加附加值的生物液体燃料和生物基化学品。木质纤维素类物质是世界上含量最多，分布最广泛的可再生生物资源(Kuhad，RC.，Singh，A.，Eriksson，KEL.Microorganismsandenzymesinvolvedinthedegradationofplantfibercellwalls[M].Biotechnologyinthepulpandpaperindustry.SpringerBerlinHeidelberg1997，45-125)，一直被认为是最合适的解决能源危机的原料。天然丝状真菌产纤维素酶量非常低，是限制木质纤维素生物炼制产业化的最主要因素之一。遗传工程技术可以有效的提高丝状真菌的纤维素酶产量。对丝状真菌的纤维素酶基因的表达调控机理研究可为遗传工程技术改造丝状真菌以提高酶产量提供理论指导，具有潜在的应用价值。纤维素酶是一种将纤维素水解为葡萄糖的复合酶系，主要分为三类酶：内切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简写为EG)、外切葡聚糖酶[exo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91，又叫纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)，简写为CBH]和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21，简写为BGL)(Lynd，LR，Weimer，PJ，vanZyl，WH，Pretorius，IS.Microbialcelluloseutilization：fundamentalsandbiotechnology[J].MicrobiolMolBiolR2002，66(3)：506-577；Glass，NL.，Schmoll，M.，Cate，JH.，Coradetti，S.Plantcellwalldeconstructionbyascomycetefungi[J].AnnuRevMicrobiol2013，67：477-498)。EG作用于纤维素链分子内部，随机水解纤维素分子内的β-1，4-糖苷键，产生短的纤维素链或可溶性纤维寡糖，暴露出新的纤维素链末端。CBH沿着纤维素链末端由外向里水解β-1，4-糖苷键，释放纤维二糖。BGL将上述产生的纤维寡糖和纤维二糖水解成葡萄糖。通过这三种酶的协同作用，纤维素酶将纤维素转化为葡萄糖，葡萄糖可以被微生物利用产生生物化学品如被酿酒酵母发酵生产燃料酒精(Wang，J.，Quirk，A.，Lipkowski，J.，Dutcher，J.R.，Clarke，A.J.Directinsituobservationofsynergismbetweencellulolyticenzymesduringthebiodegradationofcrystallinecellulosefibers[J].Langmuir2013，29(48)：14997-15005；Zhang，Y.H.P.，Himmel，M.E.，Mielenz，J.R.Outlookforcellulaseimprovement：screeningandselectionstrategies[J].BiotechnolAdv2006，24(5)：452-481；Dashtban，M.，Schraft，H.，Qin，W.Fungalbioconversionoflignocellulosicresidues：opportunityandperspectives[J].IntJBiolSci2009，5(6)：578-595)。目前，一些丝状真菌纤维素酶和木聚糖酶基因的调控转录因子已被鉴定，主要集中在曲霉、木霉、青霉和粗糙脉胞菌中。例如，黑曲霉中的XlnR(Raulo，R.，Kokolski，M.，Archer，DB.TherolesofthezincfingertranscriptionfactorsXlnR，ClrAandClrBinthebreakdownoflignocellulosebyAspergillusniger.AMBexpress2016，6(1)：5)；里氏木霉中的Crel(Portnoy，T.，Margeot，A.，Linke，R.，Atanasova，L.，Fekete，E.，Sándor，E.，Hartl，L.，Karaffa，L.，Druzhinina，IS.，Seiboth，B.，LeCrom，S.，Kubicek，CP.TheCRE1carboncataboliterepressorofthefungusTrichodermareesei：amasterregulatorofcarbonassimilation[J].BMCgenomics，2011，12：269)、Xyr1(Lichius，A.，Bidard，F.，Buchholz，F.，LeCrom，S.，Martin，J.，Schackwitz，W.，Austerlitz，T.，Grigoriev，I.V.，Baker，S.E.，Margeot，A.，Seiboth，B.，Kubicek，C.P.GenomesequencingoftheTrichodermareeseiQM9136mutant1dentifiesatruncationofthetranscriptionalregulatorXYR1asthecauseforitscellulase-negativephenotype[J].BMCGenomics2015，16：326)和Acel(Saloheimo，A.，Aro，N.，Ilmén，M.，M.Isolationoftheace1geneencodingaCys2-His2transcriptionfactorinvolvedinregulationofactivityofthecellulasepromotorcbh1ofTrichodermareesei.JBioChem2000，275(8)：5817-5825)；粗糙脉胞菌中的Clr1和Clr2(Coradetti，ST.，Craig，J.P.，Xiong，Y.，Shock，T.，Tian，C.G.，Glass，N.L.Conservedandessentialtranscriptionfactorsforcellulasegeneexpressioninascomycetefungi[J].PNatlAcadSciUSA2012，109(19)：7397-7402)，以及草酸青霉中的ClrB和CreA(Li，H.，Yao，G.，Wu，R.，Gao，L.，Kan，Q.，Liu，M.，Yang，P.，Liu，G.，Qin，Y.，Song，X.，Zhong，Y.，Fang，X.，Qu，Y.Synergisticanddose-controlledregulationofcellulasegeneexpressioninPenicilliumoxalicum[J].PLoSGenet2015，11：el005509)。基于鉴定的真菌调控转录因子，构建的基因工程菌株比野生型菌株明显提高了纤维素酶的产量。例如，Yao等遗传改造草酸青霉菌株114-2，通过缺失creA和bgl2，过量表达clrB，构建突变株RE-10。菌株RE-10的纤维素酶产量比野生型的提高了20倍(Yao，G.，Li，Z.，Gao，L.，Wu，R.，Kan，Q.，Liu，G.，Qu，Y.RedesigningtheregulatorypathwaytoenhancecellulaseproductioninPenicilliumoxalicum[J].BiotechnolBiofuel2015，8：71)。但是，真菌纤维素酶的产量仍远远不能满足木质纤维素工业规模生物炼制的需求。近年来，研究发现草酸青霉可以产生完整的纤维素酶系及高活力的β-葡萄糖苷酶(Gusakov，AV.AlternativestoTrichodermareeseiinbiofuelproduction[J].TrendsBiotechnol2011，29(9)：419-425；Yao，G.S.，Li，Z.H.，Gao，L.W.，Wu，R.M.，Kan，Q.B.，Liu，G.D.，Qu，Y.B.RedesiginingtheregulatorypathwaytoenhancecellulaseproductioninPenicilliumoxalicum[J].BiotechnolBiofuel2015，8：71；Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，Xie，S.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，Feng，J.X.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP71anditscellulaseandxylanasehyperproducingmutantEU2106，andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression.BiotechnolBiofuel2016，9：203)，具有潜在的工业应用。因此，鉴定草酸青霉中更多的、新的关键纤维素酶和木聚糖酶基因的调控转录因子具有潜在的应用价值。技术实现要素：本发明的目的是提供一种功能蛋白POX08415及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，获自草酸青霉，命名为POX08415蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。序列1由494个氨基酸残基组成，自N端第33-309位氨基酸残基为GREB1功能域；第428-478位氨基酸残基为ZnF-GATA结合结构域，该结构域含有四个半胱氨酸残基，结合锌离子后，可与DNA结合。为了使(a1)中的POX08415蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPolv-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a2)中的POX08415蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的POX08415蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述POX08415蛋白的基因(POX08415基因)也属于本发明的保护范围。所述基因具体可为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；(2)序列表的序列3所示的DNA分子；(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码所述POX08415蛋白的DNA分子；(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述POX08415蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。序列表的序列2是POX08415基因的CDS序列，由1485个碱基组成。序列表的序列3是POX08415基因的基因组DNA序列，自5′端的第29-130位碱基为POX08415基因的第一个内含子，第1053-1349位碱基为POX08415基因的第二个内含子，第1670-1755位为POX08415基因的第三个内含子。含有所述POX08415基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。本发明还保护所述POX08415蛋白或POX08415基因的应用，为如下(b1)-(b14)中的至少一种：(b1)调控微生物纤维素酶产量；(b2)调控微生物半纤维素酶产量；(b3)调控微生物羧甲基纤维素酶产量；(b4)调控微生物外切纤维素酶产量；(b5)调控微生物木聚糖酶产量；(b6)调控微生物β-葡萄糖苷酶产量；(b7)调控微生物纤维素酶基因的表达量；(b8)调控微生物半纤维素酶基因的表达量；(b9)调控微生物内切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因的表达量；(b10)调控微生物纤维二糖水解酶基因的表达量；(b11)调控微生物β-葡萄糖苷酶基因的表达量；(b12)调控微生物木聚糖酶基因的表达量；(b13)调控微生物纤维素酶基因的调控转录因子的编码基因的表达量；(b14)调控微生物木聚糖酶基因的调控转录因子的编码基因的表达量。所述(b1)-(b5)中，所述调控为正向调控；所述(b6)中，所述调控为负向调控。所述纤维素酶基因具体可为POX05587、POX04786、POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983、POX07535或POX06835。所述纤维二糖水解酶基因具体可为POX05587或POX04786。所述内切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因具体可为POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983或POX07535。所述β-葡萄糖苷酶基因具体可为POX06835。所述半纤维素酶基因具体可为POX05916、POX06783或POX08484。所述木聚糖酶基因具体可为POX05916、POX06783或POX08484。所述纤维素酶基因的调控转录因子或所述木聚糖酶基因的调控转录因子具体可为PoxBrlA和PoxFlbD。本发明还保护一种抑制微生物生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力的方法，包括如下步骤：抑制所述微生物中POX08415基因的表达，得到生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力降低的微生物。本发明还保护一种抑制微生物生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力的方法，包括如下步骤：降低POX08415蛋白的表达量和/或活性，得到生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力降低的微生物。所述“抑制所述微生物中POX08415基因的表达”是通过向所述微生物中导入POX08415基因敲除盒实现的。本发明还保护一种制备重组微生物的方法，包括如下步骤：将抑制POX08415基因表达的物质导入出发微生物，得到生产纤维素酶和/或半纤维素酶的能力低于所述出发微生物的重组微生物。所述抑制POX08415基因表达的物质具体可为POX08415基因敲除盒。所述抑制POX08415基因表达的物质还可为干扰载体；所述干扰载体为含有POX08415基因敲除盒的重组载体。以上任一所述POX08415基因敲除盒具体为序列表的序列4所示的DNA分子。以上任一所述微生物或所述出发微生物可为青霉，具体可为草酸青霉，更具体可为草酸青霉HP7-1。以上任一所述微生物或所述出发微生物更具体可为以草酸青霉HP7-1为出发菌，敲除其Ku70基因得到的重组菌。以上任一所述微生物或所述出发微生物更具体可为草酸青霉Ku70基因敲除突变体ΔPoxKu70。本发明还保护采用以上任一所述方法制备得到的重组微生物。所述重组微生物具体可为实施例中的ΔPOX08415-1，又称为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)ΔPOXO8415，已于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNO.12966。本发明通过同源重组的方法敲除草酸青霉突变体ΔPoxKu70中的POX08415基因(将所有敲除POX08415基因的重组菌均命名为突变株ΔPOX08415)。突变株ΔPOX08415具有如下特点：(1)在葡萄糖培养条件下，突变株ΔPOX08415能够正常生长。(2)在Avicel诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX08415的滤纸酶活力、羧甲基纤维素酶活力、pNPC酶活力、木聚糖酶活力均显著降低。(3)在Avicel诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX08415的pNPG酶活力显著升高。(4)在Avicel诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX08415中纤维素酶基因和木聚糖酶基因的转录水平显著降低/升高。(5)在Avicel诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX08415中已知关键纤维素酶基因和木聚糖酶基因的调控转录因子的编码基因的转录水平显著升高。本发明提供了一种草酸青霉的功能蛋白POX08415，通过实验证明POX08415在调控纤维素酶和木聚糖酶基因的表达过程中起关键性作用，在提高纤维素酶产量中具有应用潜力。附图说明图1为构建POX08415基因敲除盒的PCR产物电泳图。图2为POX08415基因敲除盒的元件示意图。图3为突变株ΔPOX08415的PCR验证电泳图。图4为突变株ΔPOX08415的Southern杂交验证图。图5为突变株ΔPoxKu70和ΔPOX08415-1在葡萄糖培养条件下的生物量检测结果。图6为突变株ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9的滤纸酶产量检测结果。图7为突变株ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9的羧甲基纤维素酶产量检测结果。图8为突变株ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9的外切葡聚糖酶产量检测结果。图9为突变株ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9的木聚糖酶产量检测结果。图10为突变株ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9的β-葡萄糖苷酶产量检测结果。图11为突变株ΔPOX08415相对ΔPoxKu70在Avicel诱导条件下不同纤维素酶和木聚糖酶基因的RT-PCR检测结果。图12为突变株ΔPOX08415相对ΔPoxKu70在Avicel诱导条件下已知转录因子PoxFlrD和PoxBrlA编码基因的RT-PCR检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。质粒pCPXG418：参考文献：Chen，M.M.，JiangM.G.，Shang，J.J.，Lan，X.W.，YangF.，Huang，J.K.，Nuss，D.L.，Chen，B.S.CYP1，ahypovirus-regulatedcyclophilin，isrequiredforvirulenceinthechestnutblightfungus[J].MolPlantPathol2011，12(3)：239-246；质粒pCPXG418在文献中的名称为“transformationvectorpCPXG418”，公众可以从广西大学获得。DNA纯化试剂盒：天根生化科技有限公司，货号：DP214。溶菌酶：索莱宝公司，货号：L8120。蜗牛酶：索莱宝公司，货号：S8280。裂解酶：Sigma公司，货号：L1412-5G。PDA培养基：BD公司，货号：5056836。再生培养基：酸水解酪蛋白1.0g、酵母提取物1.0g、蔗糖342.0g、琼脂17.0g，蒸馏水定容至1L，115℃灭菌20分钟。基本培养基：KH2PO44.0g、(NH4)2SO44.0g、MgSO4·7H2O0.6g、CaCl20.6g、FeSO4·7H2O0.005g、MnSO40.0016g、ZnCl20.0017g、CoCl20.002g、Tween801.0g，蒸馏水定容至1L，pH5.5；115℃灭菌20分钟。葡萄糖液体培养基：在基本培养基中加入葡萄糖，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/L。Avicel诱导培养基：在基本培养基中加入微晶纤维素(Avicel)，Avicel在培养基中的终浓度为20g/L。CM培养基：20×硝酸盐50mL、微量元素混合液1mL、葡萄糖10.0g、蛋白胨2.0g、酵母提取物1.0g、酸水解酪蛋白1.0g，调pH至6.5；115℃灭菌20分钟。20×硝酸盐：NaNO3120g、KCl10.4g、MgSO4.7H2O10.4g、KH2PO430.4g，蒸馏水定容至1L；高压灭菌后室温保存。微量元素混合液：ZnSO4.7H2O2.2g、H3BO31.1g、MnCl2.4H2O0.5g、FeSO4.7H2O0.5g、CoCl2.6H2O0.17g、CuSO4.5H2O0.16g、Na2MoO4.2H2O0.15g、Na4EDTA5.0g，蒸馏水定容至100mL。酶解液：溶菌酶0.2g、蜗牛酶0.3g、裂解酶0.3g，溶于50mLOM溶液中；28℃，180rpm震荡30分钟后离心，将上清液过滤除菌，得到酶解液。OM溶液：MgSO4.7H2O73.92g、NaH2PO40.3g，溶于400mL去离子水；用1MNa2HPO4水溶液调节pH至5.8，蒸馏水定容至500mL。Trappingbuffer溶液：山梨醇36.4g、Tris6.05g，溶于400mL去离子水中，用稀HCl溶液调节pH至7.0，蒸馏水定容至500mL。STC溶液：山梨醇91g、Tris6g、CaCl25.55g，溶于400mL去离子水中，用稀HCl溶液调节pH至8.0，蒸馏水定容至500mL。PTC溶液：聚乙二醇335040g、Tris3g、CaCl22.25g，溶于200mL去离子水中，用稀HCl溶液调节pH至8.0，蒸馏水定容至250mL。0.1％吐温80溶液：由吐温80和水组成，吐温80的体积百分含量为0.1％。实施例1、草酸青霉中功能蛋白POX08415及其编码基因的发现经过对草酸青霉(Penicilliumoxalicum)菌株HP7-1的基因组及其在不同培养条件下的转录组进行大量分析和功能验证，发现了一个新蛋白及其编码基因。草酸青霉菌株HP7-1的基因组序列分析的文献如下：Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，XieS.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，Feng，J.X.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutantEU2106，andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[J].BiotechnolBiofuel2016，9：203；草酸青霉菌株HP7-1在文献中的名称为“PenicilliumoxalicumstrainHP7-1”。草酸青霉菌株HP7-1保藏号为：CGMCC10781，公众也可以从广西大学获得。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为POX08415，由494个氨基酸残基组成。将编码POX08415的基因命名为POX08415基因，POX08415基因的CDS序列如序列表的序列2所示。POX08415基因的基因组DNA如序列表的序列3所示。实施例2、POX08415基因敲除盒的构建1、提取草酸青霉菌株HP7-1的基因组DNA。2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物POX08415_left-arm-F和引物POX08415_left-arm-R组成的引物对进行PCR扩增，得到POX08415基因ORF上游的2850bpDNA片段(电泳结果见图1的泳道1)，称为POX08415左臂。POX08415_left-arm-F：5’-AGTGCCGATGTCGTCCTGTTCTC-3’；POX08415_left-arm-R：5’-GGTAATCCTTCTTTCTAGAATCGACGATCGGCGATTTGG-3’。3、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物POX08415_right-arm-F和引物POX08415_right-arm-R组成的引物对进行PCR扩增，得到POX08415基因ORF下游的3602bpDNA片段(电泳结果见图1的泳道2)，称为POX08415右臂。POX08415_right-arm-F：5’-CAATATCATCTTCTGTCGACTTTTGTCGATTTTGTTTCACTTTTCTTC-3’；POX08415_right-arm-R：5’-CTCGGATAGACAAGAAATAAGC-3’。4、以质粒pCPXG418为模板，采用引物G418-F和引物G418-R组成的引物对进行PCR扩增，得到抗生素G418抗性基因的编码序列(1890bp)(电泳结果见图1的泳道3)。G418-F：5’-TCTAGAAAGAAGGATTACCTCTAAA-3’；G418-R：5’-GTCGACAGAAGATGATATTGAAG-3’。5、将步骤2、步骤3和步骤4得到的三个PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化，然后按照摩尔比1∶1∶1混合后，进行融合PCR扩增，得到PCR混合产物。融合PCR反应条件：预变性98℃3min；98℃30s，58℃15s，72℃2min，一共进行15个循环反应；72℃10min。6、以步骤5得到的PCR混合产物为模板，采用引物POX08415_Nest-F和引物POX08415_Nest-R组成的引物对进行PCR扩增，得到5190bpPCR产物(电泳结果见图1的泳道4)。POX08415_Nest-F：5’-CCGCCGTCTCATCCTCA-3’；POX08415_Nest-R：5’-GACCCAAACATACTGCTTCCA-3’。经测序，得到的PCR产物如序列表的序列4所示。将序列表的序列4所示的DNA分子命名为POX08415基因敲除盒。序列4中，自5’端第1-1706位核苷酸为POX08415左臂区段，第1707-3596位核苷酸为G418抗性基因区段，第3597-5190位核苷酸为POX08415右臂区段。POX08415基因敲除盒的元件示意图见图2。实际应用中，也可以直接人工合成序列4所示DNA分子。实施例3、草酸青霉POX08415基因缺失突变株ΔPOX08415的构建与验证1、以草酸青霉菌株HP7-1为出发菌，敲除其Ku70基因，得到草酸青霉突变体ΔPoxKu70。记载草酸青霉突变体ΔPoxKu70，以及敲除Ku70基因的具体步骤的文献如下：Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，XieS.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，Feng，J.X.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutantEU2106，andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[J].BiotechnolBiofuel2016，9：203；草酸青霉突变体ΔPoxKu70在文献中的名称为“PenicilliumoxalicummutantΔPoxKu70”。草酸青霉突变体ΔPoxKu70保藏号为：CGMCC3.15650，公众也可从广西大学获得。2、制备草酸青霉突变体ΔPoxKu70的原生质体(1)将步骤1得到的草酸青霉突变体ΔPoxKu70接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/mL)。(2)取2mL步骤(1)的孢子悬浮液，接种至200mLCM培养基中，28℃、180rpm振荡培养8小时。(3)完成步骤(2)后，4℃、3500rpm离心，收集菌丝，用0.6MMgSO4水溶液洗涤2次。(4)取(3)得到的菌丝，用酶解液重悬，28℃、180rpm振荡反应2-3小时以进行酶解；用显微镜观察到大部分菌丝形成原生质体后，按每管12.5mL分装到50mL离心管中，加入2倍体积的Trappingbuffer溶液，4℃、3500rpm离心30分钟，观察到明显的分层现象。(5)用巴氏吸管小心地吸出步骤(4)中间层的原生质体至新的50mL离心管中，加入2倍体积1M山梨醇水溶液漂洗2次，4℃、3500rpm离心15分钟，再使用20mLSTC溶液漂洗2次后离心，弃上清，得到原生质体。3、草酸青霉突变株ΔPOX08415的构建及验证(1)将4体积份的STC溶液和1体积份的PTC溶液混合，得到混合液，用混合液重悬步骤2得到的原生质体，得到原生质体溶液(调整浓度为1×107个/mL)。(2)用实施例2得到的POX08415基因敲除盒DNA转化ΔPoxKu70原生质体(方法参照文献：Churchill，A.C.L.，Ciuffetti，L.M.，Hansen，D.R.，VanEtten，H.D.，VanAlfen，N.K.TransformationofthefungalpathogenCryphonectriaparasiticawithavarietyofheterologousplasmids[J].CurrGenetics1990，17：25-31)，具体步骤如下：①将5μgPOX08415敲除盒DNA和1μL100mM亚精胺溶液混合后加入到100μL步骤(1)制备的原生质体溶液中，混合均匀，冰上反应30分钟；②反应结束后向溶液中加入1mLPTC溶液，混合均匀，室温放置25分钟；③向混合液中加入2mLSTC溶液混合均匀，将混合液加入到30mL预热的再生培养基中，混合均匀，将上述混合液倒入到无菌培养皿中(按每个培养皿分别倒入2-5mL)；待完全凝固后，室温放置30分钟，加入40mL含有G418(800μg/mL)与潮霉素(250μg/mL)的PDA培养基，覆盖在再生培养基的表面，完全凝固后28℃倒置培养5天。④将步骤③的转化双层板的孢子用0.1％吐温80溶液冲洗，放入到新的离心管中，用无菌水梯度稀释孢子悬浮液，将每个稀释梯度的孢子悬浮液涂在两个含有G418(800μg/mL)与潮霉素(250μg/mL)的PDA平板上，28℃培养4天，挑选单菌落，随机选取三个候选突变株(Δ1、Δ5和Δ9)，提取各候选突变株基因组DNA，采用引物POX08415基因F和引物POX08415基因R、引物POX08415-left-arm-F和G418抗性基因交叉验证下游引物、G418抗性基因交叉验证上游引物和引物POX08415-right-arm-R进行PCR验证。POX08415基因F：5’-GCGTGTTCTGCGTGTCA-3’；POX08415基因R：5’-TTGCGAGTCAGTTTAGCG-3’G418抗性基因交叉验证上游引物：5’-CGCTACTGCTTACAAGTGGGCTGAT-3’；G418抗性基因交叉验证下游引物：5’-GTGAATGCTCCGTAACACCCAAT-3’。结果如图3所示。图3中，泳道M为1kbDNAMarker，泳道1为Δ1的鉴定结果，泳道2为Δ5的鉴定结果，泳道3为Δ9的鉴定结果，泳道4为突变体ΔPoxKu70对照，泳道5为ddH2O阴性对照。图3A为用引物POX08415基因F和引物POX08415基因R扩增得到的扩增产物；图3B为用引物POX08415-left-arm-F和G418抗性基因交叉验证下游引物扩增得到的扩增产物；图3C为用G418抗性基因交叉验证上游引物和引物POX08415-right-arm-R扩增得到的扩增产物。结果表明，Δ1、Δ5和Δ9不能扩增出POX08415基因片段，而突变体ΔPoxKu70可以扩增出727bp的POX08415基因片段(图3A)。同时，Δ1、Δ5和Δ9都扩增出2968bp的左臂DNA片段(图3B)和3775bp的右臂DNA片段(图3C)，而突变体ΔPoxKu70没有G418抗性基因的存在，不能扩增出左臂和右臂基因片段(图3B、图3C)。上述结果表明菌株Δ1、Δ5和Δ9中POX08415基因已被敲除。⑤提取三个候选突变株(Δ1、Δ5和Δ9)和突变体ΔPoxKu70的基因组DNA，将基因组DNA用EcoRI酶切后进行Southern杂交分析，结果如图4所示。图4中，泳道M为1kbDNAMarker，泳道1为突变体ΔPoxKu70的对照，泳道2为Δ1的鉴定结果，泳道3为Δ5的鉴定结果，泳道4为Δ9的鉴定结果。结果表明，Δ1、Δ5和Δ9均得到大小为3346bp的杂交带，突变体ΔPoxKu70得到1462bp的杂交带，与预计结果一致，表明Δ1、Δ5和Δ9中POX08415基因已被敲除。以上结果表明，将POX08415基因敲除盒导入草酸青霉突变体ΔPoxKu70得到的三个转化子(Δ1、Δ5和Δ9)均为POX08415基因被敲除的突变菌株，分别命名为ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9。将敲除POX08415基因的该3个突变菌株均命名为突变株ΔPOX08415。实施例4、草酸青霉突变株ΔPOX08415在葡萄糖液体培养基中生物量的测定待测菌株为：ΔPOX08415-1和ΔPoxKu70。1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将PDA平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/mL)。3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养60小时。分别于培养的第12小时、24小时、36小时、48小时和60小时收集培养体系中的所有菌丝体，50℃烘干至恒重，测定生物量(菌丝体干重)。结果如图5所示。结果表明，ΔPOX08415-1在葡萄糖液体培养基中的生物量与ΔPoxKu70菌株的生物量没有显著差异，表明菌株ΔPoxKu70中POX08415基因的敲除不影响草酸青霉的基本代谢，ΔPOX08415-1能利用葡萄糖正常生长。实施例5、草酸青霉突变株ΔPOX08415纤维素酶和木聚糖酶活力的测定待测菌株为：ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9。1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/mL)。3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养24小时，离心收集菌体，用无菌水洗涤2-3次。4、取步骤3得到的菌体(湿重为1g)，转接到100mLAvicel诱导培养基中，28℃、180rpm振荡培养4天。分别于培养的第2天、3天和第4天取样，8000rpm离心10min，收集上清液，即为粗酶液。5、检测步骤4得到的粗酶液的如下各项酶活：滤纸酶活力、羧甲基纤维素酶活力(CMC酶活力)、外切纤维素酶活力(pNPC酶活力)、β-葡萄糖苷酶活力(pNPG酶活力)和木聚糖酶活力。检测方法参照文献：Ghose，T.K.Measurementofcellulaseactivities[J].PureandAppliedChemistry1959，(59)：257-268；Gokhale，D.V.，Puntambekar，U.S.，Deobagkar，D.N.，Peberby，J.F.ProductionofcellulolyticenzymesbymutantsofAspergillusnigerNCIM1207[J].EnzymeMicrobialTechnol1988.10：442-445。6.提取步骤4得到的菌体中的胞内蛋白。方法参照以下步骤：①将步骤4得到菌体放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末。②将步骤①得到的粉末转移到50mL离心管中，加入15mL蛋白提取液，再加入5g直径为0.25mm以及1g直径为3mm的玻璃珠。③将步骤②的混合液在旋涡振荡器上振荡1min，再放置冰上30s。重复8-10次。④将步骤③得到的混合液在7000rpm，4℃，离心20min，收集上清液，即为菌体胞内蛋白。胞内蛋白浓度检测方法参照文献：Zor，T.，Selinger，Z.LinearizationoftheBradfordproteinassayincreaseitssensitivity：theoreticalandexperimentalstudies[J].AnalBiochem1996，236：302-308。草酸青霉菌株酶产量(U/g胞内蛋白)＝酶活力(U)/胞内蛋白(g)。结果如图6-图10所示。与ΔPoxKu70相比，三株突变株(ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9)的滤纸酶产量、羧甲基纤维素酶产量、外切纤维素酶产量和木聚糖酶产量均显著降低(图6-图9)，说明POX08415为菌株生产滤纸酶、羧甲基纤维素酶、外切纤维素酶和木聚糖酶的正调控蛋白；相反，与ΔPoxKu70相比，三株突变株β-葡萄糖苷酶产量显著升高(图10)，说明POX08415为菌株生产β-葡萄糖苷酶的负调控蛋白。实施例6、POX08415基因的缺失对草酸青霉纤维素酶基因和其它已知调控转录因子的编码基因转录水平的影响待测菌株为：ΔPOX08415-1和ΔPoxKu70。1、将待测菌株接种于无菌PDA培养基上，28℃恒温培养6天。2、用0.1％吐温80溶液将PDA平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液并将浓度调整到1×108个/mL。3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm培养24小时，收集菌丝体；将菌丝体转接至100mLAvicel诱导培养基，28℃、180rpm培养。分别收集、提取诱导培养第4小时、第12小时、第24小时、第48小时的待测菌株总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行定量RT-PCR检测，检测关键纤维素酶基因(2个CBH基因：POX05587和POX04786；7个EG基因：POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983和POX07535；1个BGL基因：POX06835)和木聚糖酶基因(3个XYN基因：POX05916、POX06783和POX08484)的表达情况。采用actin基因作为内参基因。qRT-PCR检测引物如下所示(5’→3’)：actin-F：CTCCATCCAGGCCGTTCTG；actin-R：CATGAGGTAGTCGGTCAAGTCAC；POX05587-F：GTACTTGCGATCCTGATGGG；POX05587-R：CCACGGTGAAGGGAGACTTG；POX04786-F：TACTACGCTTCCGAGGTTCAGAGPOX04786-R：GTGTCCAGCCAAACGAAGG；POX01166-F：CGATACTACGGCAACATCATCAC；POX01166-R：AGGCACCAGTCCACGAGTTT；POX07535-F：CGACTACTTGACCCAGCACCA；POX07535-R：CTAGTACACGCTCGCAGACCA；POX06983-F：GATCAACCACCAGGGTCTCAA；POX06983-R：CAAACAACAGCCACGGAGTAAG；POX06147-F：CACAATTACGCTCGCTGGAA；POX06147-R：GGCTCGTTCATCACACCAAA；POX02740-F：GTTCAGTTCCTGATGGAAAGATTG；POX02740-R：CATAACCGCCTGCTTGAGTG；POX0413_7-F：CGGCACTCTCGGCAAGGATTA；POX0413_7-R：CATCAGGAAGGGGACACGGAA；POX05571-F：AACCTGGAAGAACGGCACC；POX05571-R：CCTTGTCACAGTCATCGGAGC；POX06835-F：GTGCTGGATGGGAACAGGA；POX06835-R：TACGAACGCCGAGAGGAGA；POX08484-F：ACAAGCACACGCAGGTCAA；POX08484-R：CGCTGAAGTGGTTGGCAGT；POX06783-F：TGAGCCCAGGACCATCAACTT；POX06783-R：TACCCTTGCTTTTGCCGCC：POX05916-F：ATCGAGAATCAGGGCACAAAG；POX05916-R：ATCCGCCAACGAAGGTGT。结果如图11所示，其中差异表达量表示的是突变株ΔPOX08415-1中纤维素酶基因或木聚糖酶基因的转录水平减去ΔPoxKu70中同样基因的转录水平。结果表明，在Avicel诱导第4小时时，ΔPOX08415-1中1个EG基因(POX06983)与2个XYN基因(POX08484和POX05916)的转录水平相对于ΔPoxKu70中这些基因的转录水平显著上调，上调程度介于79.11％-489.71％之间，相反，其它大部分纤维素酶基因显著下调，下调程度介于40.90％-89.84％之间。在Avicel诱导培养第12小时、第24小时和第48小时时，ΔPOX08415-1中除了POX05196外几乎所有纤维素酶基因与木聚糖酶基因显著下调，下调程度介于37.46％-99.00％之间。进一步检测已知调控转录因子的编码基因PoxBrlA和PoxFlbD的相对表达水平。采用actin基因作为内参基因。qRT-PCR检测引物如下所示(5’→3’)：PoxBrlA-F：CCAGTTGCCTGTTTCGTCAG；PoxBrlA-R：GGTAAGGGAATGTCGGGTGTT；PoxFlbD-F：AACACATGCACTATCGCTCTCC；PoxFlbD-R：CTTGCCCATCTCATTCACCA；结果如图12所示，其中差异表达量表示的是突变株ΔPOX08415-1中已知调控转录因子的编码基因的转录水平减去ΔPoxKu70中这些基因的转录水平。结果表明，在Avicel为诱导碳源的培养条件下，相比ΔPoxKu70，ΔPOX08415-1中，除了PoxFlbD在诱导第12小时和PoxBrlA在诱导第4小时时没有显著性差异外，其余所有条件下的转录水平显著上调，上调程度介于75.72％-1519.44％之间。以上结果表明，转录因子POX08415在Avicel诱导培养条件下，对草酸青霉关键纤维素酶基因与木聚糖酶基因的表达，以及已知重要的纤维素酶基因和木聚糖酶基因的调控转录因子的编码基因的表达起关键调控作用。将上述实施例中的ΔPOX08415-1，又称为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)ΔPOXO8415，于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC_NO.12966。<110>广西大学<120>功能蛋白POX08415及其编码基因与应用<160>4<210>1<211>494<212>PRT<213>草酸青霉<400>1MetGlySerLeuGluAlaValSerArgHisArgAspProLeuProAla151015IleGlyPheLeuSerLysAspAsnLeuGlyGlyTyrThrSerLysHis202530SerSerHisAlaGlySerProAsnProSerGlnAlaSerSerAsnMet354045TyrThrSerGlnSerLeuSerTyrSerTyrAlaProThrThrSerAla505560ProSerGlnProGlyTyrLeuProProSerGluProArgArgLeuVal65707580AspAspAspLysAspLysSerAlaGlyArgGlnSerLeuProSerIle859095HisGluAlaLeuGlyAsnAspAsnHisLeuProTyrProSerSerAla100105110SerAlaProProSerGlnSerGlyHisSerAlaProProProProPro115120125GlnHisLeuLeuGlyArgAlaGlyValGluGlyProSerGlyProPro130135140AsnProPheSerAsnGlyAlaAlaSerThrSerLeuMetArgGluPro145150155160ThrTyrProSerHisProThrGlnLeuHisThrGluThrSerSerArg165170175ThrSerLeuProSerValAsnThrGlnAspSerArgAsnAlaSerLeu180185190GlnSerLeuSerThrGlyArgSerProThrGlnSerAlaLysThrAla195200205MetThrSerIleThrGlySerGlnAsnSerThrTyrAspTyrSerAla210215220ProProSerAlaGlySerIleAlaSerProValGlyHisGlyGlnPhe225230235240ProSerAsnTyrSerPheAsnProSerGlnGlnProHisProProPro245250255AlaHisLeuProAsnGlySerSerTyrHisProSerGlnTyrAspGly260265270ArgAlaTyrSerGlyValProArgMetAspAspGlyLysAsnGlyPhe275280285AlaSerArgProHisProProGlnProHisSerGluSerValLysArg290295300HisLeuAspIleTyrAspValGluThrSerLeuAsnGluIleSerGlu305310315320PheSerThrArgThrLeuAspPheSerArgArgTyrAlaAlaLeuAla325330335HisGlnThrGlnArgAlaGlyProLeuLeuGlySerLeuProThrLeu340345350AsnGluValGluGluIleLeuHisLeuGlnArgArgAsnGlnAspAla355360365LeuIleArgIleArgThrAlaIleValAsnGlnGluGlnAlaMetAla370375380GluGlnMetAlaGlnArgLysAlaTyrLysSerGlyAspAspAspHis385390395400MetAlaMetTyrGlnAspAspTyrLysGlySerGlyGlyPheAlaGly405410415GlyAspAlaLysLysArgArgGlyLysAlaAlaProProGlyArgCys420425430HisSerCysAsnArgAlaGluThrProGluTrpArgArgGlyProAsp435440445GlyAlaArgThrLeuCysAsnAlaCysGlyLeuHisTyrAlaLysLeu450455460ThrArgLysMetGlyAlaAsnLysAlaAlaThrMetGlySerAsnLeu465470475480LysProLysValAlaHisGluSerAlaSerProValThrArg485490<210>2<211>1485<212>DNA<213>草酸青霉<400>2atggggtctttggaagccgtgtcccggcacagagaccctttgcccgccatcggtttcctc60agcaaggacaacctgggaggatatacttccaaacactcctctcacgccggctcccccaat120ccttctcaagcgtccagcaacatgtacacctcccagtccctttcctattcttacgcgccg180accaccagtgcaccgtcacaaccgggctacctccctccctcagaaccacgtcggctcgtc240gacgatgacaaggacaaatcggccggtcgccaatccttgccctccatccacgaggctctc300ggtaacgacaatcatctgccatatccttcgtccgcgtctgcgccgccctcgcaatcagga360cattccgcaccaccccctcctccccaacacctcctcggccgggcgggtgtcgaagggcct420tccgggcctcccaatcccttctccaatggcgccgcttcaacctcactgatgcgggaaccg480acatatccttcgcatccgacccagcttcacaccgaaacctcctcgcggaccagtctcccc540tcggtcaatacgcaagactcccgcaacgcctctctgcaatcgctcagtaccggtcgatcg600ccgacccaaagtgcgaaaacggcaatgacatcgatcacagggtcacaaaactcgacctac660gattacagtgcgccgccgtccgccgggagcatcgcttcgcccgtgggccatggccagttc720ccatccaactactccttcaacccgtcgcaacaaccccatccaccaccagcgcatcttcca780aacggctcgtcctatcatccctctcaatatgacggtcgtgcatactcgggtgtaccccgg840atggacgatgggaaaaatggatttgccagccgaccacacccccctcaacctcattcagaa900tcggtgaagagacatcttgatatctacgatgtggagacatcactcaatgagatttctgaa960tttagcacccgcaccttggacttttcaagacgatatgctgcactcgcgcatcagacgcaa1020cgcgctggacctctgttggggtccttgcccactttgaacgaagtcgaagagatccttcac1080ctgcagcgtcgaaaccaagacgcgctgatccgaattcgaacagccatcgtcaatcaagag1140caggcaatggccgagcagatggcgcaacgaaaagcgtacaagtcgggggatgatgatcac1200atggccatgtatcaggacgactacaaagggtccggtggctttgccgggggtgatgctaaa1260aaacgacgaggaaaagcggctccccctggccgctgtcacagctgtaaccgtgccgaaact1320cccgagtggcggcgtggcccagatggtgctcgaacgctgtgcaacgcctgtgggctccat1380tacgctaaactgactcgcaaaatgggtgccaacaaagcagcaaccatgggatccaatctc1440aagcccaaggtggctcacgagtctgcctcgcctgtcacccgctaa1485<210>3<211>1968<212>DNA<213>草酸青霉<400>3atggggtctttggaagccgtgtcccggcacaggtaagctggtcgtcctcgtcctcatcat60cacccatcgtcaaacccgtgcggcgcaaccggtcccgatcacaatgctaaccttgcgctc120gccctcttccacagagaccctttgcccgccatcggtttcctcagcaaggacaacctggga180ggatatacttccaaacactcctctcacgccggctcccccaatccttctcaagcgtccagc240aacatgtacacctcccagtccctttcctattcttacgcgccgaccaccagtgcaccgtca300caaccgggctacctccctccctcagaaccacgtcggctcgtcgacgatgacaaggacaaa360tcggccggtcgccaatccttgccctccatccacgaggctctcggtaacgacaatcatctg420ccatatccttcgtccgcgtctgcgccgccctcgcaatcaggacattccgcaccaccccct480cctccccaacacctcctcggccgggcgggtgtcgaagggccttccgggcctcccaatccc540ttctccaatggcgccgcttcaacctcactgatgcgggaaccgacatatccttcgcatccg600acccagcttcacaccgaaacctcctcgcggaccagtctcccctcggtcaatacgcaagac660tcccgcaacgcctctctgcaatcgctcagtaccggtcgatcgccgacccaaagtgcgaaa720acggcaatgacatcgatcacagggtcacaaaactcgacctacgattacagtgcgccgccg780tccgccgggagcatcgcttcgcccgtgggccatggccagttcccatccaactactccttc840aacccgtcgcaacaaccccatccaccaccagcgcatcttccaaacggctcgtcctatcat900ccctctcaatatgacggtcgtgcatactcgggtgtaccccggatggacgatgggaaaaat960ggatttgccagccgaccacacccccctcaacctcattcagaatcggtgaagagacatctt1020gatatctacgatgtggagacatcactcaatgaggtaagcaccctgaatccctcctcggga1080gtcaccaccccctccccctccccctccacgttttactccccggattcttcgatccttcct1140ctctgtctatttgacgcgtgttctgcgtgtcatgctcacatcagtcaccacacaataccc1200gtgcattgggaccttgcgccggctcattggtgtggagactcgtggtgcgcagaattttca1260tgcgtccacccacgaggctgggacggatggagccacatcgacggggtacgagagtttcac1320agaactgacagttgtggtcgaccttccagatttctgaatttagcacccgcaccttggact1380tttcaagacgatatgctgcactcgcgcatcagacgcaacgcgctggacctctgttggggt1440ccttgcccactttgaacgaagtcgaagagatccttcacctgcagcgtcgaaaccaagacg1500cgctgatccgaattcgaacagccatcgtcaatcaagagcaggcaatggccgagcagatgg1560cgcaacgaaaagcgtacaagtcgggggatgatgatcacatggccatgtatcaggacgact1620acaaagggtccggtggctttgccgggggtgatgctaaaaaacgacgaggagtaagttttt1680tgttccacgagctttcatttcttccattgttaagacccacaccatggctaattgctcctt1740gtcgcgattttacagaaagcggctccccctggccgctgtcacagctgtaaccgtgccgaa1800actcccgagtggcggcgtggcccagatggtgctcgaacgctgtgcaacgcctgtgggctc1860cattacgctaaactgactcgcaaaatgggtgccaacaaagcagcaaccatgggatccaat1920ctcaagcccaaggtggctcacgagtctgcctcgcctgtcacccgctaa1968<210>4<211>5190<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4ccgccgtctcatcctcactgtcctagaatttgccagcattccccaagactgcctcattca60gcccttgtccattccctctttctcatctctttttccttttttttaattgtctccctgcta120tcaacacatttgaaatcgacgaggtcagcgttcgcttgtcacctgttggccacgcgagct180tgacttttttgcccgctcatcccacccttgtccacctgtccccatcccttgcgtgaccat240ttctccatgattcagtgtgctattcacatgcagacttaatctcggaaccagaaaatcgtg300aatcagatcgaaaaagaaaaaagaaaaagaaagaaaaacgggtcgggacccagaaagacg360aaaggagaccaaaaaaaagtggtaaaagaaaaaagaaaaaagaaaaaagagaaaaggaaa420aagagaaaaggaaaaagagaaaaagaagaggaaaaggaaaatagagaaaacccaaaaaac480cgccgaccaaaaaggtcagatcccctcggaccttcttctgatccatttgggttgaggctt540cgccagaccatattcgcgggtttccttctcaaatccaccccctcttctcacgattgtgtt600tccctgctttttctccacgacggcatgttgctgggcgtcggccatcaataaacctcccaa660cccatcccactcccttcttcctggtcggtcttttctcgtgtttgcttctactctgctacc720gacggcgcccacgctggtgtctacactggacagtcacccactctacaccactccatcgcc780aaccctggtccctgacaatccatcctggacactgtatgctgaacagtgaaaactctatac840tagtctaaaactctttgacaggcgtggcttcgtgtgggaaaccatctcccccagcgccag900gaccgaatcaattcccgtctcggccccgattgtgtcacatctcattcgtggtcttgacgc960cacccaatcttggtctttctgcccctcctctcagaaagccaaataaatcaaaacaaaaaa1020aaagaaccgatcttgggccggtggttgttggtcgcaggccatctagagtctctctaaact1080tgtgacggcatcgcagcccccccaaactcgccgccacacggggacccttttcgttgccgc1140cccccctccttctgcatcgcaatcgaacgctttcatccgtggtagacgacggtcgcacga1200gcacactcctgacggaattcttttgttttcccttcccttctcatttgatcacattttgct1260ttccttttgggactccttccatcttccatcgtgcaccactgatctcggactcggccaccc1320tgcaaatcaaatctgcgtgctgtcgttcttgttcacgatcttgcagcgacccgtcaccgg1380taggcggtcgaccattcaagtgccagtgcagctgaccgcgatctcgtcgggatcttgaat1440gcacgatcggatcggtgcccgcgctacgatctcaggtggatgaggtcaggaactttgtcg1500tgacttgacgccctctatcttccgaccgcctccatctcttggccactctagacttgcgcg1560gtctggttatcttaccaaccttgtcatcgtcgctttcttgttattcacccttgctctccc1620tctctccctctctctctgctccctccctctctgctccctccctctccctcctactttagt1680ccctccccaaatcgccgatcgtcgattctagaaagaaggattacctctaaacaagtgtac1740ctgtgcattctgggtaaacgactcataggagagttgtaaaaaagtttcggccggcgtatt1800gggtgttacggagcattcactaggcaaccatggttactattgtataccatcttagtagga1860atgatttcgaggtttatacctacgatgaatgtgtgtcctgtaggcttgagagttcaagga1920agaaacatgcaattatctttgcgaacccagggctggtgacggaattttcatagtcaagct1980atcagagtaaagaagaggagcatgtcaaagtacaattagagacaaatatatagtcgcgtg2040gagccaagagcggattcctcagtctcgtaggtctcttgacgaccgttgatctgcttgatc2100tcgtctcccgaaaatgaaaatagctctgctaagctattcttctcttcgccggagcctgaa2160ggcgttactaggttgcagtcaatgcattaatgcattgcagatgagctgtatctggaagag2220gtaaacccgaaaacgcgttttattcttgttgacatggagctattaaatcactagaaggca2280ctctttgctgcttggacaaatgaacgtatcttatcgagatcctgaacaccatttgtctca2340actccggagctgacatcgacaccaacgatcttatatccagattcgtcaagctgtttgatg2400atttcagtaacgttaagtggatggatccatctactctagaagaactcgtcaagaaggcga2460tagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtca2520gcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatag2580cggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccacc2640atgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatg2700cgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccaga2760tcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttc2820gcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatca2880gccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggc2940acttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcg3000caaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcagttcattc3060agggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccgg3120aacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctc3180tccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatatcgatgctt3240cggtagaataggtaagtcagattgaatctgaaataaagggaggaagggcgaacttaagaa3300ggtatgaccgggtcgttcacttaccttgcttgacaaacgcacaagttatcgtgcaccaag3360cagcagatgataataatgtcctcgttcctgtctgctaataagagtcacacttcgagcgcc3420gccgctactgcttacaagtgggctgatctgaccagttgcctaaatgaaccatcttgtcaa3480acgacacaaattttgtgatccgcctggacgactaaaccaaaatagcattgatgtgttgac3540ctccactagctccagccaagcccaaaaatgctccttcaatatcatcttctgtcgactttt3600gtcgattttgtttcacttttcttcttggcgttgcacagaaagattcaagcgaaaaggaca3660cacgggagggacacacacaccatatacggattcaaaaggagtttttgcgcttgactcatt3720cttatcccatcctgttcaaccttcacctatctcatgcccccccccccccccccgttgttc3780tttctgatgaatccccacccttgttgcttcttgctctcctcgtggacacgcgacgagtat3840ggaacctcgcttactccttccctgatggcataccacatctgaacagcagttctcgctcct3900ccagaggctgggcctgtttgctttcttcatcttggcgaccattcttataatacccttgca3960gctctggctatatcagctccaaagcgtagacattccttttgacaattccttggggctgat4020tgcaggtcactccagtcgaaggatatggctggcttacatgggctcgatctttttaccgaa4080tttacaaaagccggcatcgtcctcggttgctgttttttttctctatgtatcaactttgat4140gagatcttgctatgagagccatttcaattttccttttgatccgtgagaactacttttggc4200atgaaatggatgtgaaccatgacaacgttttcatcatgtaaccagagacgatttgaaatc4260acatttacactggctgtaccactgcgccgggacgaccgcgccttgcgtcatgtctctggg4320tcatggtccatcatacttcttgaaagcctacaatcatcaggagggaaaagggaacttttt4380ccagccgatccacacgacaagttaggtttactggaataccgcgtgctgattgcttggaaa4440tggcccccattgctgccacgtccctgaaagctgctcatacctgtctcgccatctggaaga4500gtccaaaactccttcctcgtgggtggcaacaccgtagaatttctcacatgcagcatgcta4560agcttggcaatgaattcatgatggaccacactaccttggtgattttccttcttccttttt4620ttttcaaagagaaactaaaagacaccgataatatttctcttcgaaagagggggtctccag4680tatgatctacgccgtactctatcgaagcagatggcagatctgtctgtgaattctgtccat4740ctctccacctcacaagatcgccactcccgacagtttgggaacattacaatagttgactgc4800aatggtcctagtcgcgcaacgtggcatgtgaggctgtccatctcccaaaaaaatataaca4860aaaaagagttttgatccgaccgaattggaaacgaatctcaagcacatccagattgaagga4920atggaagaccatcaaactttcgaggtttcccatccgtccacctccagtttcgagacatcc4980ggtccatcctggggacattacatacatagtaatagtagtactcggatcagctgcatacat5040tggggacagatgttctatgtatgcagctacagtagtatgtacagaacctctgtacgtccg5100tatgcacatccagagatcccgtcagacatggaccgaacccacccagagcccctttcacta5160tactcaaagtggaagcagtatgtttgggtc5190当前第1页1 2 3