本发明涉及药物化学领域，更具体地涉及式i化合物和其在抑制吲哚胺2,3-双加氧酶2方面的应用。
背景技术：
吲哚胺2，3-双加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1,ido1)是哺乳动物中催化色氨酸沿着犬尿氨酸途径(kynureninepathway)代谢的第一个限速酶。研究表明ido1在多种肿瘤组织中有高表达，可以通过降低肿瘤微环境中色氨酸浓度来抑制淋巴细胞的增殖，在肿瘤免疫逃逸中起到重要作用，因此,目前认为ido1的高表达是导致机体对肿瘤产生免疫耐受的重要因素之一。
ball等在2007年发现了一种在编码基因序列、分子结构及生物活性上与ido1都十分相似的酶，并命名为indol1(indoleamine2,3-dioxygenase-likeprotein)，即现在的吲哚胺2，3-双加氧酶2(indoleamine2,3-dioxygenase2,ido2)。ido2位于ido1基因的下游，在结构上ido2的序列和ido1的序列高度相似，位于人和小鼠的第八号染色体上，在小鼠的肾脏，生殖系统，肝脏中高表达。有研究发现在胃癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌的癌组织中也有ido2的表达。多项研究表明尽管活性比ido1低，且不起主导作用，但ido2也能催化色氨酸的降解。研究表明，ido2与ido1关系密切，两者可能共同作用参与肿瘤发生、肿瘤免疫耐受、炎症反应等重大疾病或生理活动，因此ido2有望成为继ido1之后治疗人类重大疾病的有效药物靶标。
ido1在肿瘤的免疫耐受中的重要作用已被人们所承认，并且在基因表达、信号转导、用于具有ido1介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病(包括癌症、艾滋病、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等重大疾病)的治疗等方面成为研究热点。目前关于ido2的生物学特征、功能与免疫耐受的研究还相对较少，本领域迫切需要开发高效的、选择性抑制ido2的抑制剂，从而为治疗ido2单独介导或ido1、ido2共同参与介导的人类重大疾病提供新的药物靶标和思路。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种抑制吲哚胺2，3-双加氧酶2(ido2)活性的化合物及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种式i化合物，或其药学上可接受的盐的用途，用于制备抑制吲哚胺2,3-双加氧酶2(ido2)活性的药物组合物或制剂，
式中，
r1为氢或氟；
r2为-r5-nr3r4；
所述的r5为取代的或未取代的c1-c3亚烷基、或无；
所述的r3、r4各自独立地选自下组：h、取代的或未取代的c1-c4烷基、取代的或未取代的c2-c4烯基、取代的或未取代的c2-c4炔基、取代的或未取代的c3-c6环烷基；
或r3、r4与相邻的氮原子共同构成取代或未取代的5-7元杂环，其中，所述的5-6元饱和环上具有1-2个氮原子，和0-2个选自下组的杂原子：o、s；
所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：c1-c4烷基、c1-c4卤代烷基、胺基保护基(优选叔丁氧羰基)、卤素。
在另一优选例中，所述的r5为亚甲基。
在另一优选例中，r1为f。
在另一优选例中，当所述的r3、r4与相邻的氮原子共同构成取代或未取代的5-6元饱和环时，环上的氮原子上可以任选地具有胺基保护基。
在另一优选例中，所述的5-7元杂环不是杂芳环。
在另一优选例中，所述的5-7元杂环为饱和杂环，优选5-6元饱和杂环。
在另一优选例中，所述的5-7元杂环仅含有一个或二个杂原子。
在另一优选例中，所述的5-7元杂环中所有的杂原子为n。
在另一优选例中，r3、r4各自独立地选自下组：c1-c4烷基；或r3、r4与 相邻的氮原子共同构成取代或未取代的5-6元饱和环，其中，所述的5-6元饱和环上具有1或2个氮原子，和任选的1个选自下组的杂原子：o。
在另一优选例中，r3、r4不同时为h。
在另一优选例中，所述的-nr3r4为环状亚胺。
在另一优选例中，所述的-nr3r4为取代或未取代的选自下组的基团：
其中，
所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：c1-c4烷基、卤素。
在另一优选例中，r1为f。
在另一优选例中，所述的式i化合物选自下组：
在另一优选例中，所述的式i化合物选自下组：化合物2、和化合物5。
在另一优选例中，所述的吲哚胺2,3-双加氧酶2为人的吲哚胺2,3-双加氧酶2。
在另一优选例中，所述的药物组合物或制剂还用于抑制吲哚胺2,3-双加氧酶1(ido1)的活性。
在另一优选例中，所述的药物组合物或制剂还用于预防或治疗与ido2相关的疾病。
在另一优选例中，所述的“与ido2相关的疾病”包括由ido2单独介导的疾病，或ido1、ido2共同参与介导的疾病。
在另一优选例中，所述的疾病包括色氨酸代谢异常疾病。
在另一优选例中，所述的疾病选自下组：肿瘤发生、肿瘤免疫耐受、癌症、艾滋病、阿尔茨海默病、抑郁症、和白内障。
在另一优选例中，所述的癌症选自下组：肝癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、黑色素瘤，胰腺癌，结肠癌，肾癌，前列腺癌等。
在另一优选例中，所述药物组合物中含有0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的式i化合物或其药学上可接受的盐，按组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、或注射剂型。
在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、颗粒剂等，还包括缓释型或非缓释型剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物还可含有其他药物活性成分。
在另一优选例中，所述的其他药物活性成分包括化合物、抗体、核酸分子、抗肿瘤的免疫细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的化合物包括治疗肿瘤的化疗药，如顺铂、紫杉醇。
在另一优选例中，所述的抗体包括抗肿瘤的抗体，如抗her2的抗体、抗vegf2的抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤的免疫细胞包括car-t细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种体外非治疗性的抑制吲哚胺2,3-双加氧酶2活性的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将吲哚胺2,3-双加氧酶2与本发明第一方面所述的式i化合物、或其药学上可接受的盐进行接触，从而抑制吲哚胺2,3-双加氧酶2的活性。
在另一优选例中，所述的吲哚胺2,3-双加氧酶2为游离状态，或表达于细胞中。
在另一优选例中，在步骤(a)中，将式i化合物、或其药学上可接受的盐添加到细胞培养体系中，从而使其与吲哚胺2,3-双加氧酶2进行接触。
在另一优选例中，所述的细胞为正常细胞或肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述的细胞为人细胞。
在本发明的第三方面，提供了一种抑制吲哚胺2,3-双加氧酶2或治疗与ido2相关的疾病的方法，所述的方法包括：(i)给需要的对象施用本发明第一方面所述的式i化合物体、或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明化合物对ido2活性的抑制情况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现了一类结构如式i所示化合物可以显著地抑制ido2的活性。实验表明，所述的式i化合物对ido2有较好的抑制效果，其抑制效果优于体内外实验通用的ido2抑制剂1-mt(1-甲基色氨酸)，并且所述式i化合物均为可逆抑制剂。本发明的式i化合物可用于治疗或预防由ido2单独介导的或ido1、ido2共同参与介导的包括癌症在内的人类重大疾病。在此基础上，完成了本发明。
术语
如本文所用，“本发明化合物”、“本发明的色胺酮及其衍生物”、或“式i化合物”可互换使用，指式i所示的化合物、或其消旋体、对应异构体、或其药学上可接受的盐。应理解，该术语还包括上述组分的混合物。
式中，各基团的定义如上所述。
本发明化合物不仅对ido2具有抑制作用，对ido1也有一定的抑制作用。
在本发明中，还包括式i化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
本发明的式i化合物可采用现有技术中本领域技术人员熟知的方法进行制备，对各个步骤的反应参数没有特别限制。
吲哚胺2，3-双加氧酶
吲哚胺2，3-双加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1,ido1)是哺乳动物中催化色氨酸沿着犬尿氨酸途径(kynureninepathway)代谢的第一个限速酶。研究表明ido1在多种肿瘤组织中有高表达，可以通过降低肿瘤微环境中色氨酸浓度 来抑制淋巴细胞的增殖，在肿瘤免疫逃逸中起到重要作用。
如本文所用，“吲哚胺2，3-双加氧酶2”，即indoleamine2,3-dioxygenase2(ido2)，是2007年发现的一种在编码基因序列、分子结构及生物活性上与ido1相似的酶。ido2位于ido1基因的下游，在氨基酸水平上，人ido1和ido2约有43％的同一性。此外，ido2还具有不同于ido1的表达特性，ido2主要在肾小管，肝脏和精子中表达，但ido1和ido2均通过抗原呈递树突状细胞进行表达。研究表明，ido1和ido2具有不同的表达模式和不同的动力学特性，因此，ido2可能具有不同于ido1的功能。有研究发现在胃癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌的癌组织中有ido2的表达。
sorensen的研究以及munn等用ido1阳性的树突状细胞和t淋巴细胞混合培养，用ido1、ido2特异性抑制剂d-1-甲基色氨酸(dextro-1-methyltryptophan，d-1mt)、l-1-甲基色氨酸(levo-1-methyltryptophan，l-1-mt)处理细胞后发现t细胞都有增殖的表现，说明抑制了ido1或ido2的活性后对淋巴细胞的增殖有促进作用。而hou等研究发现，在用黑色素瘤研究中，用ido2的特异性抑制剂d-1-mt和环磷酰胺连用有明显的缩小肿瘤的效果，比ido1的特异性抑制剂l-1-mt的效果明显。而且在d-1-mt组生存率也得到明显的延长。研究结果表明抑制ido2比抑制ido1在延缓肿瘤生长、减小肿瘤方面更有效果，推测其在免疫耐受中也起到重要作用。
merlo等研究发现与野生型类风湿性关节炎小鼠相比，ido2基因敲除的小鼠体内致病性自免疫抗体及抗体分泌细胞减少，关节炎症状减轻，而ido1基因敲除的小鼠则无此现象，表明ido2是自体抗体产生及炎症发生的重要介导分子。
抑制类型
本发明人研究发现，不同化合物对于ido2和/或ido1的抑制类型是不同。在本发明中，抑制类型主要包括：竞争性、反竞争、非竞争、和混合型竞争。
组合物和施用方法
本发明提供了一种用于抑制吲哚胺2,3-双加氧酶2的组合物。所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、膳食补充剂、饮料组合物等。
在本发明中，所述的药物组合物可直接用于疾病治疗，例如，用于抗肿瘤 方面的治疗。在使用本发明药物制剂时，还可同时使用其他治疗剂，如抗肿瘤的药物等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。
以药物组合物为例，本发明的组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的吲哚胺2,3-双加氧酶2抑制剂还可与其他治疗剂一起使用。
对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、雾化吸入等。
使用药物组合物时，是将安全有效量的药物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的式i化合物对ido2具有较好的抑制效果。
(b)本发明的式i化合物对对ido1也能起到抑制作用。
(c)本发明的式i化合物对于ido1或ido2介导的肿瘤免疫逃逸具有更好的治疗潜能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
通用材料
ido1和ido2的核苷酸序列均已公开，实施例中的活性ido1和ido2为来源于人的ido1和ido2，可通过常规分子克隆手段进行制备。
实施例中，待测抑制剂包括目前体内外实验通用的ido抑制剂l-1-mt和d-1-mt(l-1-甲基色氨酸，d-1-甲基色氨酸，均为市售)，以及选自下组的本发明化合物：
实施例1
酶水平ido2抑制剂的初步筛选
500μl的标准检测体系中，将50mmol/l磷酸钾缓冲液(ph7.5)、200μg/ml过氧化氢酶、40mmol/l抗坏血酸、20μmol/l亚甲基蓝、适宜浓度的底物l-色氨酸以及终浓度均为10μm的待测ido2抑制剂(包括本发明化合物、l-1-mt和d-1-mt)混合，混合液于37℃水浴5min后向上述混合液中加入ido2,37℃反应30min，酶促反应结束后加入200μl30％(w/v)三氯乙酸终止反应，然后在65℃水浴锅中加热15min，使反应产物完成从n-甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化。138000×g离心10min，吸取上清100μl与等体积的2‰(w/v)对二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液充分混匀，犬尿氨酸可与该溶液反应并使混合液变为黄色，使用酶标仪在492nm处检测其吸光度。
初筛结果如图1，在ph为7.5的条件下，本发明化合物对ido2的抑制率均显著高于l-1-mt和d-1-mt。本实施例化合物初筛结果为后续ic50值、ki值测定以及抑制类型判定提供了数据验证的基础。
实施例2
本发明化合物抑制类型及ki值测定
在实施例1所述的500μl检测体系中，分别加入不同浓度(20、30、40mm或20、25、35mm)的底物l-色氨酸，并在每一个底物浓度下，加入不同浓度梯度的待测抑制剂(包括本发明化合物、l-1-mt和d-1-mt)，对照组不加抑制剂，混合液于37℃水浴5min后加入10μlido2(约1μm),37℃反应30min，酶促反应结束后加入200μl30％(w/v)三氯乙酸终止反应，然后在65℃水浴锅中加热15min，使反应产物完成从n-甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化。138000×g离心10min，吸取上清100μl与等体积的2‰(w/v)对二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液充分混匀，犬尿氨酸可与该溶液反应并使混合液变为黄色，使用酶标仪在492nm处 检测其吸光度。以dixon作图法(1/v～[i])判定抑制剂类型；以[s]/v～[i]作图，可以得到抑制剂的ki值。
类似方法测定待测抑制剂对ido1的抑制类型及ki值。
结果如下表所示：本发明的化合物均为ido2的可逆抑制剂，其中，化合物2为非竞争性抑制剂，抑制ido2的ki值为1.96μm，仅为l-1-mt的0.46％，此外，化合物2对ido1也有较强的抑制作用，ki值为4.12，略高于抑制ido2的ki值。本发明的化合物对ido1或ido2都能起到抑制作用，因而对于ido1或ido2介导的肿瘤免疫逃逸具有更好的治疗潜能。
注：ni：没有抑制；nd：没有测出；—：没有测过。
实施例3
本发明化合物半数有效抑制浓度ic50值的测定
分别测定体外水平和细胞水平下本发明化合物抑制ido1和ido2的ic50值。
体外水平(酶水平)：在实施例1所述的500μl检测体系中，加入30mm的底物l-色氨酸及不同浓度梯度的抑制剂(包括本发明化合物、l-1-mt和d-1-mt)， 对照组不加抑制剂，其他处理与实施例1相同，反应结束后使用酶标仪在492nm处检测吸光度。以抑制率对抑制剂浓度作图，利用改良寇氏法计算ic50值。
细胞水平：u87mg细胞株(atccno.:htb-14)，采用含有10％胎牛血清的dmem高糖培养基于37℃、5％co2培养箱中培养。将细胞吹打均匀传代于6孔板里，待细胞生长至80％～90％融合时进行转染。按照lipofectamine2000的说明书进行操作，并稍作改良：吸弃含血清培养基并用pbs洗涤细胞2次，每孔加入1500μl无血清培养基。质粒和脂质体以1:2(每孔2.5ng质粒和5μl脂质体)的比例分别加入到预装有125μlopti-mem培养基的ep管中并轻轻混匀，5min后将两者混合，室温孵育20min后分别逐滴均匀的加到待转染细胞培养液中，37℃、5％co2培养箱培育6小时细胞贴壁后换成含10％血清的dmem培养基，培养18h后将细胞以2.5×104细胞/孔的密度接种于96孔板中，37℃、湿度95％、5％co2的培养箱中培养6h待细胞贴壁，加入不同浓度梯度的待测化合物(包括本发明化合物、l-1-mt和d-1-mt)，并用含l-色氨酸(终浓度200μm，过滤除菌)的细胞培养基补齐至每孔总体积200μl，孵育24h后，取140μl上清到另一96孔板中，加入10μl30％(w/v)三氯乙酸，65℃加热15min，13800×g离心5min。取100μl上清与等体积2‰(w/v)对-二氨基苯甲醛的冰乙酸溶液混合，充分混匀后采用酶标仪在492nm检测吸光值。实验分组为pcdna3.1(+)-ido2转染组(实验组)、pcdna3.1(+)转染组(空质粒对照组)和未转染组(空白对照组)，每组有三个复孔。以抑制率对抑制剂浓度作图，利用改良寇氏法计算ic50值
结果如下表所示，本发明的化合物均为ido2的有效抑制剂，同时对ido1也有较好的抑制效果。其中，化合物2对于ido1和ido2均有极好的抑制效果，化合物2的酶水平和细胞水平的ic50值均显著低于通用抑制剂l-1-mt和d-1-mt，其ido2抑制率分别为l-1-mt和d-1-mt抑制率的23.1倍和41.6倍(以细胞水平ic50值为例)。综上，本发明化合物在酶水平和细胞水平均有极好的ido2抑制效果。
注：ni：没有抑制；—：没有测过。
本发明中所有数据均为3次独立实验(每次实验同一化合物设定3个重复)的均值。每组实验数据经公式计算相对标准偏差rsd(相对偏差/平均值)均小于1.5％，表明我们的数据重复性、再现性较好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。