硼酸酯和其药物制剂的制作方法
本申请要求2014年2月3日提交的美国临时申请No.61/935,040和2014年8月13日提交的美国临时申请No.62/036,876的权益，所述美国临时申请的内容均以引用的方式整体并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号R01CA149623-01A1下通过政府支持进行。政府对本发明具有一定的权利。
背景
硼酸化合物显示各种药学上有用的生物活性。Shenvi等的美国专利No.4,499,082公开了肽硼酸是某些蛋白水解酶的抑制剂。Kettner和Shenvi的美国专利No.5,187,157、美国专利No.5,242,904和美国专利No.5,250,720公开了抑制胰蛋白酶样蛋白酶的一类肽硼酸。Kleeman等的美国专利No.5,169,841公开了抑制肾素作用的N-末端修饰的肽硼酸。Kinder等的美国专利No.5,106,948公开了抑制癌细胞生长的某些三肽硼酸化合物。
由于公开了硼酸酯和酸性化合物而通过引用整体并入本文的Adams等的美国专利No.5,780,454、美国专利No.6,066,730、美国专利No.6,083,903和美国专利No.6,297,217，公开了用作蛋白酶体抑制剂的肽硼酸酯和酸性化合物。所述引用也描述了使用硼酸酯和酸性化合物，以降低肌肉蛋白的降解速率，以降低细胞中NF-κB的活性，以降低细胞中p53蛋白的降解速率，以抑制细胞中细胞周期蛋白降解，以抑制癌细胞的生长，以抑制细胞中抗原呈递，以抑制NF-κB依赖性的细胞粘附，并且以抑制HIV复制。Brand等的WO 98/35691公开了蛋白酶抑制剂(包括硼酸化合物)可用于治疗梗塞，诸如那些在中风或心肌梗塞期间发生的梗塞。Elliott等的WO 99/15183公开了蛋白酶抑制剂可用于治疗炎性疾病和自身免疫疾病。
硼替佐米(BTZ)是目前由美国食品和药品管理局批准的用于治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的硼酸蛋白酶体抑制剂。BTZ在临床上通过皮下注射或静脉内注射施用。尽管用BTZ治疗是有效的，但游离BTZ的施用依然被高毒性、非特异性组织摄取、副作用和从循环中迅速清除所困扰。BTZ还拥有有限的稳定性(例如有限的储存期限)，使BTZ的治疗用途变得复杂。已经努力开发改进的BTZ制剂来解决这些不足。
脂质体是脂质双层(例如磷脂双层)制成的球状囊泡，其能够在它们的水性核心内包封亲水性药物，或在它们的脂质双层内包封疏水性药物。脂质体药物可以提供延长的全身循环时间、减少的药物毒性和增强的药物递送功效。例如，某些化疗剂的脂质体制剂，包括柔红霉素(由Gilead Sciences以名称DAUNOXOME出售)、多柔比星(由Ortho Biotech以名称DOXIL和由Schering-Plough以名称CAELYX出售)和长春新碱(由Spectrum Pharmaceuticals以名称MARQIBO出售)，已经被FDA批准，并且相对于这些化疗剂的替代制剂表现出延长的全身循环时间、减少的药物毒性和增强的药物递送功效。
制备硼酸和酯化合物的脂质体制剂(诸如BTZ)的努力迄今为止已经遭受了显著的缺点。被动包埋方法和远程装载方法都被用来制备BTZ的脂质体制剂。被动包埋方法提供非常低的包封效率，经常低于15％，这是有问题的。为了解决这个问题，开发了远程装载，其中BTZ在预成形的脂质体中的包埋由pH和化学梯度驱动。这个过程复杂并且需要过夜孵育。另外，所得到的脂质体的稳定性差，这就可以排除临床开发。
一直利用冻干来进一步增加脂质体的储存期限。但是，因为被动包埋和远程装载工艺都是将药物包埋在脂质体的水性核心中，脂质体的内容物即使在冻干保护剂存在下，在脱水和再水合过程期间也易于泄漏。
需要表现出改进的性质(诸如增强的稳定性)的新型硼酸活性剂的制剂(诸如BTZ)来解决这些不足。本文公开的组合物和方法解决了这些和其他需要。
概述
根据所公开的主题的目的，正如本文所体现和广泛描述的，在一方面，本公开涉及组合物以及制造和使用所述组合物的方法。在另外的实例中，本文公开的主题涉及硼酸治疗剂的硼酸酯。硼酸酯可以用于制备包含和/或释放具有改进的性质(诸如增强的稳定性)硼酸治疗剂的脂质体制剂。
例如，本文公开式I的化合物
其中
P1可以为氢或氨基基团保护部分；
R0可以为氢或烷基基团；
R1、R2和R3可以独立地为氢、烷基基团、环烷基基团、杂环基基团、芳基基团、杂芳基基团或-CH2-R4；
R4可以为芳基基团、烷基芳基基团、芳基烷基基团、环烷基基团、烷基环烷基基团、杂环基基团、烷基杂环基基团、杂芳基基团、烷基杂芳基基团、烷氧基基团或烷硫基基团；
m可以为0、1或2；
Z与O1和O2一起表示衍生自多元醇的部分；
L可以不存在或者为连接基团；并且
A可以为亲脂性部分。
在一些实例中，m为0。
在一些实例中，P1可以为氨基基团保护部分。例如，P1可以为R5-C(O)-、R5-S(O)2-、R5-NH-C(O)-或R5-O-C(O)-，其中R5为烷基基团、芳基基团、烷基芳基基团、芳基烷基基团、环烷基基团、烷基环烷基基团、杂环基基团、烷基杂环基基团、杂芳基基团或烷基杂芳基基团。在一些实例中，P1可以为R5-C(O)-、R5-S(O)2-、R5-NH-C(O)-或R5-O-C(O)-，并且R5为杂芳基基团。在某些实例中，P1可以为(2-吡嗪)羰基。
在某些实例中，R3为异丁基基团。
多元醇可为任何合适的多元醇。在一些实例中，多元醇可以包括糖(例如单糖诸如果糖)。在某些实例中，多元醇可以包括还原糖(例如糖醇诸如甘露醇、山梨醇或半乳糖醇)。在某些实例中，多元醇可以包括氨基糖(例如葡甲胺(meglumine)或还原葡糖胺(glucamine))。在某些实例中，多元醇可以为葡甲胺、还原葡糖胺、甘露醇、山梨醇或半乳糖醇。
A可以为任何合适的亲脂性部分。所述亲脂性部分可以衍生自脂质。在一些实例中，所述脂质可以包括脂肪酸、甘油酯、磷脂、鞘脂、固醇或异戊烯醇。
在一些实例中，A可以为C8-C40烷基基团、C8-C40烯基基团、C8-C40烷氧基基团、C8-C40烷硫基基团、C8-C40烷基亚磺酰基基团、C8-C40烷基磺酰基基团、C8-C40烷基氨基基团、C8-C40二烷基氨基基团、C8-C40烷基羰基基团、C8-C40烷氧基羰基基团、C8-C40烷基氨基羰基基团、C8-C40二烷基氨基羰基基团或由式定义的部分
其中
虚线指示单键或双键存在；
R6可以为烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、烷基芳基基团、芳基烷基基团、环烷基基团、烷基环烷基基团、杂环基基团、烷基杂环基基团、杂芳基基团、烷基杂芳基基团、烷氧基基团或烷硫基基团；并且
R7、R8、R9、R10和R11可以独立地为氢、羟基基团、氨基基团、烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、烷基芳基基团、芳基烷基基团、环烷基基团、烷基环烷基基团、杂环基基团、烷基杂环基基团、杂芳基基团、烷基杂芳基基团、烷氧基基团、烷硫基基团、烷基亚磺酰基基团、烷基磺酰基基团、烷基氨基基团、二烷基氨基基团、烷基羰基基团、烷氧基羰基基团、烷基氨基羰基基团或二烷基氨基羰基基团。
在某些实例中，所述化合物可以由式IA定义
其中Z、L和A可以是如上面关于式I所定义的。
在某些实例中，所述化合物由式II定义
其中
P1、R0、R1、R2、R3、R4、m、L和A可以是如上面关于式I所定义的，
X可以为-O-或-NR12-；并且
R12可以为氢或烷基基团。
在某些实例中，R12可以为氢。在其他实例中，R12为烷基基团。例如，R12可以为C1-C6烷基基团。在一些实例中，R12可以为C1-C4烷基基团。在某些实例中，R12可以为甲基或乙基。
在某些实例中，X可以为-O-。在其他实例中，X可以为-NH-或-N(CH3)-。
在某些实例中，所述化合物由式IIA定义
其中X、R12、L和A可以如上面关于式II所定义的。
在某些实施方案中，所述化合物可为以下中的一个：
在中性或碱性pH(例如，pH 8)时，本文所述的硼酸酯可以为阴离子。在这些情况下，附加的去质子化的羟基基团可以附接到本文所述的化合物的硼原子上，并且所述化合物可以以盐的形式存在。
还提供了包括由囊泡形成脂质形成的脂质体的药物制剂，并且本文所述的化合物被包埋在脂质体中。在一些实例中，可以冻干所述制剂。所述脂质体制剂可以在冻干期间维持稳定性，并且一旦冻干，当储存在室温下时，可以保持稳定长达六个月时间。在一些实例中，所述制剂还可以包括冻干保护剂，诸如蔗糖或海藻糖。
还提供了在受试者中治疗癌症的方法。方法可以包括给受试者施用治疗有效量的本文所述的化合物或制剂。
所公开主题的其他优点将部分在随后的描述和图中阐述，并且部分根据描述将是显而易见的，或可通过实践下述方面而了解。以下所描述的优点将借助在所附权利要求书中具体指出的要素和组合来实现和达到。应理解，前面的概述和下面的详述都仅仅是示例性和说明性的而不是限制性的。
附图简述
并入本说明书中并构成本说明书一部分的附图，示出了下述的若干方面。
图1是示出BTZ-OMG脂质体制剂的装载的Sepharose CL-4B色谱图。
图2是示出pH对BTZ-MEGA-12在脂质体中的装载效率的影响的图。
图3是示出BTZ-MEGA-12脂质体制剂的装载的Sepharose CL-4B色谱图。
图4是示出BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂的装载的Sepharose CL-4B色谱图。
图5是表示在28周时间内冻干的BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂的胶体稳定性的曲线图。
图6是冻干的脂质体包括BTZ-MEGA-CHOL的低温-TEM显微照片。
图7是表示BTZ和BTZ-MEGA-CHOL对SUB6白血病细胞的细胞毒性的图。
图8是表示BTZ和BTZ-MEGA-CHOL对K562白血病细胞的细胞毒性的图。
图9是评价MV4-11移植的NSG小鼠响应于BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂处理的存活的试验1的图。
图10是评价MV4-11移植的NSG小鼠响应于BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂处理的存活的试验2的图。
图11是评价MV4-11移植的NSG小鼠响应于BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂处理的存活的试验1和试验2的组合结果的图。
图12是示出用空脂质体(顶部显微照片)处理四周后和用BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂(底部显微照片)处理四周后MV4-11移植的NSG小鼠中白血病母细胞的浓度差异的显微照片。使用BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂处理4周后，从MV4-11移植的NSG小鼠中消除了白血病母细胞。
图13示出了与用空脂质体处理四周相比，用BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂治疗四周减少了MV4-11移植的NSG小鼠的脾尺寸。
图14是通过监测在37℃pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中随时间推移的脂质体内的药物含量来表示BTZ从脂质体中释放的速度的图。
图15是表示在静脉内施用单一剂量的游离BTZ和L-BTZ(1mg/kg)后小鼠中血浆药物浓度对时间的图。数据呈现为平均值±SD(n＝3)。
详述
通过参考公开主题的特定方面的以下详细描述和其中包括的实施例和图，可以更容易地理解本文中描述的材料、化合物、组合物、物品和方法。
在公开和描述本发明的材料、化合物、组合物和方法之前，应理解下述方面不限于特定的合成方法或特定的药剂，因此当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，且并不意图加以限制。
而且，贯穿本说明书参考了多种出版物。这些出版物的公开内容特此以引用的方式整体并入本申请以便更充分地描述所公开的主题涉及的领域的现状。对所公开的参考文献中包含并且在其引用的句子中讨论的材料还单独并具体地以引用的方式并入本文。
一般定义
在本说明书和随附权利要求书中，将会提及多个术语，这些术语应被定义为具有以下含义：
贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包括(comprise)”和所述词语的其他形式如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”意指包括但不限于并且不旨在排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。
除非上下文另外明确规定，否则在描述和随附的权利要求书中使用的单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括多个指示物。因此，例如，提及“一种组合物”包括两种或更多种这些组合物的混合物，提及“所述化合物”包括两种或更多种这些化合物的混合物，提及“一种药剂”包括两种或更多种这些药剂的混合物等。
“任选的”或“任选地”意指后面描述的事项或情形可能发生，或者可能不发生，并且所述描述包括所述事项或情形发生的情况和不发生的情况。
本文中使用的“受试者”表示个体。因此，“受试者”可以包括驯养的动物(例如，猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和禽类。“受试者”还可以包括哺乳动物，如灵长类动物或人。
“降低(reduce)”或所述词语的其他形式，如“降低(reducing)”或“降低(reduction)”意指事件或特征(例如，肿瘤生长)的减少。应当理解，这通常是相对于一些标准或预期值，换句话说，它是相对的，但是它对于待提及的标准或相对值来说并不总是必需的。例如，“降低肿瘤生长”意指相对于标准或对照降低肿瘤生长的速度。
“预防(prevent)”或所述词语的其他形式，如“预防(preventing)”或“预防(prevention)”意为终止具体的事件或特征，稳定或延迟具体事件或特征的发展或进展，或使具体事件或特征发生的机会最小化。预防不需要与对照比较，因为它通常比例如降低更绝对。如本文所用，某事可以被降低但不可被预防，但是被降低的某事也可以被预防。同样，某事可以被预防但是不可被降低，但是被预防的某事也可以被降低。应当理解，使用降低或预防时，除非特别指出，否则也明确地公开其他词语的使用。
“治疗(treat)”或所述词语的其他形式，如“经过治疗的(treated)”或“治疗(treatment)”意为为了降低、预防、抑制或消除具体的特征或事件(例如，肿瘤生长或存活)而施用组合物或执行方法。术语“控制”可与术语“治疗”同义使用。
术语“抗癌”是指以任何浓度治疗或控制细胞增殖和/或肿瘤生长的能力。
应当理解，贯穿本说明书，使用标识符“第一”和“第二”仅仅是为了帮助区分公开的主题的各种组分和步骤。标识符“第一”和“第二”不旨在暗示由这些术语修饰的组分或步骤的任何具体的顺序、量、优先性或重要性。
化学定义
除非另外指明本文所使用的术语将具有在本领域中它们惯用的含义。定义本文所述的一般式中的可变位置时提到的有机部分(例如，术语“卤素”)是所述有机部分涵盖的单个取代基的集合性术语。前缀Cn-Cm在每种情况下指示基团中的碳原子可能的数目。
如本文所用，术语“烷基”是指饱和的直链的、支链的、伯、仲或叔烃，包括具有1至20个原子的那些烃。在某些实例中，烷基基团将包括C1-C12、C1-C10、C1-C8、C1-C6、C1-C5、C1-C4、C1-C3或C1-C2烷基基团。C1-C10烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、庚基、辛基、2-乙基己基、壬基和癸基基团，以及其异构体。C1-C4-烷基基团的实例包括例如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基和1,1-二甲基乙基基团。
环状烷基基团或“环烷基”基团包括具有3至10个碳原子的环烷基。环烷基基团可以包括单环或多个稠环。在某些实例中，环烷基基团包括C3-C4、C4-C7、C5-C7、C4-C6或C5-C6环状烷基基团。环烷基基团的非限制性实例包括金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等等。
烷基和环烷基基团可以为未取代的或由选自以下的一个或多个部分取代的：烷基、卤基、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、酰氧基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基、酰胺基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、叠氮基、巯基、亚氨基、磺酸、硫酸根、磺酰基、硫烷基、亚磺酰基、氨磺酰基(sulfamonyl)、酯、膦酰基、氧膦基、磷酰基、膦、硫酯、硫醚、酰卤、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、磷酸、磷酸盐、膦酸盐，或不抑制本发明的化合物的生物活性的、未保护的或必要时保护的、如本领域技术人员的已知中、例如如在Greene等,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons,第三版,1999(以引用方式整体并入本文)中所述的任何其他可行的官能团。
包括术语“烷基”诸如“烷基氨基”或“二烷基氨基”的术语将被理解为包含如上所定义的偶联至另一官能团的烷基基团，如本领域的技术人员所理解，其中所述基团通过列出的最后一组偶联至化合物上。
如本文所用，术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链和支链碳链。在一些实例中，烯基基团可以包括C2-C20烯基基团。在其他实例中，烯基可以包括C2-C12、C2-C10、C2-C8、C2-C6或C2-C4烯基。在烯基的一个实施方案中，双键的数目为1-3，在烯基的另一个实施方案中，双键的数目是一或二。碳-碳双键和碳原子数的其他范围也考虑取决于烯基部分在分子上的位置。“C2-C10-烯基”基团可以在链中包括多于一个的双键。烯基基团中的一个或多个不饱和键可以位于化合价允许的碳链的任何位置。在一些实例中，当烯基基团被共价结合到一个或多个附加部分时，共价结合到一个或多个附加部分的烯基基团中的碳原子不是烯基基团内的碳-碳双键部分。烯基基团的实例包括但不限于，乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基-乙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、3-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基、1,2-二甲基-1-丙烯基、1,2-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊烯基、4-甲基-1-戊烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1,1-二甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-3-丁烯基、1,2-二甲基-1-丁烯基、1,2-二甲基-2-丁烯基、1,2-二甲基-3-丁烯基、1,3-二甲基-1-丁烯基、1,3-二甲基-2-丁烯基、1,3-二甲基-3-丁烯基、2,2-二甲基-3-丁烯基、2,3-二甲基-1-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-3-丁烯基、3,3-二甲基-1-丁烯基、3,3-二甲基-2-丁烯基、1-乙基-1-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1,1,2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-甲基-1-丙烯基和1-以及-2-甲基-2-丙烯基基团。
如本文所用，术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和直链和支链碳链。在炔基的一个实施方案中，三键的数目为1-3，在炔基的另一个实施方案中，三键的数目是一或二。在一些实例中，炔基基团包括C2-C20炔基基团。在其他实例中，炔基基团可以包括C2-C12、C2-C10、C2-C8、C2-C6或C2-C4炔基基团。碳-碳三键和碳原子数的其他范围也考虑取决于烯基部分在分子上的位置。例如，如本文所用，术语“C2-C10-炔基”是指具有2至10个碳原子并含有至少一个三键的直链或分支的不饱和烃基，诸如乙炔基、丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基、正丁-1-炔-1-基、正丁-1-炔-3-基、正丁-1-炔-4-基、正丁-2-炔-1-基、正戊-1-炔-1-基，正戊-1-炔-3-基，正戊-1-炔-4-基、正戊-1-炔-5-基、正戊-2-炔-1-基、正戊-2-炔-4-基、正戊-2-炔-5-基、3-甲基丁-1-炔-3-基、3-甲基丁-1-炔-4-基、正己-1-炔-1-基、正己-1-炔-3-基、正己-1-炔-4-基、正己-1-炔-5-基、正己-1-炔-6-基、正己-2-炔-1-基、正己-2-炔-4-基、正己-2-炔-5-基、正己-2-炔-6-基、正己-3-炔-1-基、正己-3-炔-2-基、3-甲基戊-1-炔-1-基、3-甲基戊-1-炔-3-基、3-甲基戊-1-炔-4-基、3-甲基戊-1-炔-5-基、4-甲基戊-1-炔-1-基、4-甲基戊-2-炔-4-基和4-甲基戊-2-炔-5-基基团。
烯基和炔基基团可以为未取代的或由选自以下的一个或多个部分取代的：烷基、卤基、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、酰氧基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基、酰胺基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、叠氮基、巯基、亚氨基、磺酸、硫酸根、磺酰基、硫烷基、亚磺酰基、氨磺酰基(sulfamonyl)、酯、膦酰基、氧膦基、磷酰基、膦、硫酯、硫醚、酰卤、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、磷酸、磷酸盐、膦酸盐，或不抑制本发明的化合物的生物活性的、未保护的或必要时保护的、如本领域技术人员的已知中、例如如在Greene等,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons,第三版,1999中所述的任何其他可行的官能团。
如本文所用，术语“芳基”是指6至14个碳原子的单价碳环基团。芳基基团可以包括单环或多个稠环。在一些实例中，芳基基团包括C6-C10芳基基团。芳基基团包括但不限于苯基、联苯基、萘基、四氢萘基、苯基环丙基和茚满基。芳基基团可以为未取代的或由选自以下的一个或多个部分取代的：卤基、氰基、硝基、羟基、巯基、氨基、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、卤代环烷基、卤代环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、卤代炔氧基、环烷氧基、环烯氧基、卤代环烷氧基、卤代环烯氧基、烷硫基、卤代烷硫基、环烷硫基、卤代环烷硫基、烷基亚磺酰基、烯基亚磺酰基、炔基-亚磺酰基、卤代烷基亚磺酰基、卤代烯基亚磺酰基、卤代炔基亚磺酰基、烷基磺酰基、烯基磺酰基、炔基磺酰基、卤代烷基-磺酰基、卤代烯基磺酰基、卤代炔基磺酰基、烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、二(烷基)氨基、二(烯基)-氨基、二(炔基)氨基或三烷基甲硅烷基。
如本文所用，术语“烷基芳基”是指通过二价亚烷基桥(-CH2-)n结合到母体化合物的芳基基团，其中n为1-12(例如，n为1至6)并且其中“芳基”如上所定义。如本文所用，术语“芳基烷基”是指被如上所定义的烷基基团取代的如上所定义的芳基基团。
如本文所用，术语“烷基环烷基”是指通过二价亚烷基桥(-CH2-)n结合到母体化合物的环烷基基团，其中n为1-12(例如，n为1至6)并且其中“环烷基”如上所定义。
如本文所用，术语“烷氧基”是指烷基-O-，其中烷基是指如上所定义的烷基基团。类似地，术语“烯氧基”、“炔氧基”和“环烷氧基”分别指的是烯基-O-、炔基-O-和环烷基-O-基团，其中烯基、炔基和环烷基如上所定义。C1-C6-烷氧基基团的实例包括但不限于，甲氧基、乙氧基、C2H5-CH2O-、(CH3)2CHO-、正丁氧基、C2H5-CH(CH3)O-、(CH3)2CH-CH2O-、(CH3)3CO-、正戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基、1,1-二甲基丙氧基、1,2-二甲基丙氧基、2,2-二甲基-丙氧基、1-乙基丙氧基、正己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1,1-二甲基丁氧基、1,2-二甲基丁氧基、1,3-二甲基丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、2,3-二甲基丁氧基、3,3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1,1,2-三甲基丙氧基、1,2,2-三甲基丙氧基、1-乙基-1-甲基丙氧基和1-乙基-2-甲基丙氧基。
如本文所用，术语“烷硫基”是指烷基-S-，其中烷基是指如上所定义的烷基基团。类似地，术语“环烷硫基”，是指环烷基-S-，其中环烷基如上所定义。
如本文所用，术语“烷基亚磺酰基”是指烷基-S(O)-，其中烷基是指如上所定义的烷基基团。
如本文所用，术语“烷基磺酰基”是指烷基-S(O)2-，其中烷基如上所定义。
如本文所用，术语“烷基氨基”和“二烷基氨基”是指烷基-NH-和(烷基)2N-基团，其中烷基如上所定义。
如本文所用，术语“烷基羰基”、“烷氧基羰基”、“烷基氨基羰基”和“二烷基氨基羰基”分别是指烷基-C(O)-、烷氧基-C(O)-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-，其中烷基、烷氧基、烷基氨基和二烷基氨基如上述定义。
如本文所用，术语“杂芳基”是指在环内具有一个或多个杂原子的1至15个碳原子(例如，1至10个碳原子、2至8个碳原子、3至6个碳原子或4至6个碳原子)的单价芳香基团。杂芳基基团可以包括1至4个杂原子、1至3个杂原子或1至2个杂原子。在一些实例中，并入环中的杂原子为氧、氮、硫或其组合。当存在时，氮和硫杂原子可任选地被氧化。杂芳基基团可以具有单环(例如，吡啶基或呋喃基)或多个稠环，条件是连接点是通过杂芳基环原子。优选的杂芳基包括吡啶基、哒嗪基、嘧啶基，吡嗪基、三嗪基、吡咯基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、呋喃基(furanyl)、噻吩基、呋喃基(furyl)、吡咯基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、吡唑苯并呋喃基和苯并噻吩基。杂芳环可以为未取代或被一个或多个如上对芳基所述的一个或多个部分取代。
如本文所用，术语“烷基杂芳基”是指通过二价亚烷基桥(-CH2-)n结合到母体化合物的杂芳基基团，其中n为1-12并且其中“杂芳基”如上所定义。
术语“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环的(heterocyclic)”和“杂环基(heterocyclo)”在本文中互换使用，并且是指完全饱和的或不饱和的环状基团，例如3至7元单环或4至7元单环、7至11元双环或10至15元三环环系，其中所述环内具有一个或多个杂原子。杂环基团可以包括1至4个杂原子、1至3个杂原子或1至2个杂原子。在一些实例中，并入环中的杂原子为氧、氮、硫或其组合。当存在时，所述氮和硫杂原子可任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。杂环基团可以附接在环或环系的任何杂原子或碳原子处，并且可以是未取代的或被如上文对芳基所述的一个或多个部分取代。
示例性单环杂环基团包括但不限于，吡咯烷基、吡咯基、吡唑基、氧杂环丁烷基、吡唑啉基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑烷基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、噁二唑基、哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代氮杂卓基、氮杂卓基、4-哌啶酮基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、四氢吡喃基、吗啉基、硫杂吗啉基、硫杂吗啉基亚砜、硫杂吗啉基砜、1,3-二氧戊环和四氢-1,1-二噁噻吩基、三唑基、三嗪基等。
示例性二环杂环基团包括但不限于，吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并噻吩基、奎宁环基、喹啉基、四-氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基(诸如呋喃并[2,3-c]吡啶基、呋喃并[3,2-b]吡啶基]或呋喃并[2,3-b]吡啶基)、二氢异吲哚基、二氢喹唑啉基(诸如3,4-二氢-4-氧代喹唑啉基)、四氢喹啉基等。
示例性三环杂环基团包括咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基、呫吨基等。
如本文所用，术语“烷基杂环基”是指通过二价亚烷基桥(-CH2-)n结合到母体化合物的杂环基基团，其中n为1-12并且其中“杂环基”如上所定义。如本文所用，术语“杂环基烷基”是指被如上所定义的烷基基团取代的如上所定义的杂环基基团。
杂环基和杂芳基基团可以为未取代的或由选自以下的一个或多个部分取代的：烷基、卤基、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、酰氧基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基、酰胺基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、叠氮基、巯基、亚氨基、磺酸、硫酸根、磺酰基、硫烷基、亚磺酰基、氨磺酰基(sulfamonyl)、酯、膦酰基、氧膦基、磷酰基、膦、硫酯、硫醚、酰卤、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、磷酸、磷酸盐、膦酸盐，或不抑制本发明的化合物的生物活性的、未保护的或必要时保护的、如本领域技术人员的已知中、例如如在Greene等,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons,第三版,1999中所述的任何其他可行的官能团。
如本文所用，术语“卤素”是氟、氯、溴和碘原子。前缀卤代-(例如，如术语卤代烷基所示)是指所有程度的卤素取代，从单个取代至全卤取代(例如甲基的氯甲基(-CH2Cl)、二氯甲基(-CHCl2)、三氯甲基(-CCl3))。
如本文所用，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。在广义方面，容许的取代基包括有机化合物的无环和环状的、支链或非支链的、碳环和杂环的、以及芳香族和非芳香族的取代基。说明性的取代基包括，例如以下所描述的那些。对于适当的有机化合物，容许的取代基可以是一种或多种以及相同或不同的。出于本公开的目的，杂原子(诸如氮)可具有氢取代基和/或满足杂原子的化合价的本文所述有机化合物的任何容许的取代基。本公开不旨在以任何方式受有机化合物的容许的取代基的限制。而且，术语“取代”或“被...取代”包括隐含条件，即这种取代符合被取代原子和取代基的容许化合价，并且取代产生稳定化合物，例如不会自发地如通过重排、环化、消除等进行转化的化合物。
除非相反规定，否则化学键只以实线示出而不是以楔形或虚线示出的式涵盖各种可能的异构体，例如各对映异构体、非对映异构体和内消旋化合物，以及异构体的混合物诸如外消旋或非外消旋的混合物。
现将详细参考公开的材料、化合物、组合物、物品和方法的特定方面，其实例在随附的实例和附图中说明。
化合物
本文公开了硼酸治疗剂的硼酸酯。所述硼酸酯可以充当硼酸治疗剂的前药。硼酸酯可以用于制备具有改进的性质(诸如增强的稳定性)的脂质体制剂。
在某些方面，本文公开了由以式I定义的化合物
其中
P1为氢或氨基基团保护部分；
R0为氢或烷基基团；
R1、R2和R3独立地为氢、烷基基团、环烷基基团、杂环基基团、芳基基团、杂芳基基团或-CH2-R4；
R4为芳基基团、烷基芳基基团、芳基烷基基团、环烷基基团、烷基环烷基基团、杂环基基团、烷基杂环基基团、杂芳基基团、烷基杂芳基基团、烷氧基基团或烷硫基基团；
m为0、1或2；
Z与O1和O2一起表示衍生自多元醇的部分；
L不存在或者为连接基团；并且
A为亲脂性部分。
在一些实例中，P1为氨基基团保护部分。氨基基团保护部分包括被用于衍生氨基基团(特别是肽或氨基酸的N-末端氨基基团)的基团。此类基团包括但不限于，烷基、酰基、烷氧基羰基、氨基羰基和磺酰基部分。然而，术语“氨基基团保护部分”不旨在被限定于在有机合成中常常采用的那些特定的保护基团，也不旨在被限定于易于裂解的基团。
在一些实例中，P1为R5-C(O)-、R5-S(O)2-、R5-NH-C(O)-或R5-O-C(O)-，其中R5为烷基基团、芳基基团、烷基芳基基团、芳基烷基基团、环烷基基团、烷基环烷基基团、杂环基基团、烷基杂环基基团、杂芳基基团或烷基杂芳基基团。在某些实例中，P1为R5-C(O)-、R5-S(O)2-、R5-NH-C(O)-或R5-O-C(O)-，并且R5为杂芳基基团。在某些实例中，P1为(2-吡嗪)羰基。
在一些实例中，R0为氢。在其他实例中，R0为烷基基团。例如，R0可以为C1-C6烷基基团。在一些实例中，R0可以为C1-C4烷基基团。在某些实例中，R0可以为甲基或乙基。
在一些实例中，R1、R2和R3各自独立地选自氢、C1-C8烷基、C3-C10环烷基、C6-C10芳基和—CH2—R4，如上所述其中R1、R2、R3和R4中的每个可以任选地被取代。在一些实例中，R1、R2和R3各自独立地选自C1-C4烷基和—CH2—R4，并且R4为环烷基、芳基、杂环基、杂芳基或烷氧基中的一个。在一些实例中，R1、R2和R3各自独立地选自C1-C4烷基和—CH2—R4，并且R4为C6-C10芳基、(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基、C3-C10环烷基、C1-C8烷氧基或C1-C8烷硫基、或5-至10-元杂芳环中的一个。在某些实例中，R3为异丁基。
m可以为0、1或2。当m为0时，括号内的残基不存在，并且硼酸酯化合物为二肽。类似地，当m为1时，括号内的残基存在，并且所述化合物为三肽。当m为2时，所述化合物为四肽。在某些实例中，m为0。如本文所用，术语“肽”、‘二肽”和“三肽”旨在涵盖包括天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基或天然和非天然氨基酸残基的组合的化合物。将显而易见的是，术语“肽”、“二肽”和“三肽”用于指本文中的化合物，其中C末端氨基酸残基的羧酸官能团由硼酸酯官能团替代。
如本文所用，术语“衍生自多元醇的部分”是指通过从多元醇的两个羟基基团中去除氢原子形成的部分(即，包括两个或更多个羟基基团的部分)。所述多元醇可以包括任何数目的羟基基团。例如，在一些实例中，多元醇可以包括2至8个羟基基团(例如，2至6个羟基基团)。在某些实例中，多元醇可以包括至少3个羟基基团(例如，3至8个羟基基团、3至6个羟基基团或3至5个羟基基团)。
衍生自多元醇的部分可通过所述多元醇的任何两个羟基基团附接到硼原子上，使得所得的硼酸酯形成5-、6-、7-、8-或9-元环。在一些实例中，所述硼酸酯形成5-或6-元环。在某些实例中，多元醇可以包括1,2-二醇或1,3-二醇官能团。
多元醇可为任何合适的多元醇。例如，多元醇可以为聚合多元醇(例如聚乙烯醇)、芳族多元醇(例如，儿茶酚或邻苯二酚衍生物)或糖(例如，单糖、二糖、寡糖或多糖)。在一些实施方案中，多元醇可以为非芳族多元醇(即，多元醇不包括芳族部分)。
在一些实例中，多元醇包括糖(例如单糖诸如果糖)。在某些实例中，多元醇可以包括还原糖(例如糖醇诸如甘露醇、山梨醇或半乳糖醇)。在某些实例中，多元醇可以包括氨基糖(例如葡甲胺或还原葡糖胺)。在某些实例中，多元醇为葡甲胺、还原葡糖胺、甘露醇、山梨醇或半乳糖醇。
在一些实例中，L不存在(即，Z直接结合到A上)。因而，本文预期了本文公开的式，其中-Z-L-A被表示为Z-A。在其他实例中，L存在并且为连接基团。所述连接基团可以是，例如，亚烷基、杂亚烷基、亚烯基、杂亚烯基、亚炔基、杂亚炔基、环亚烷基、烷基环亚烷基、环烷基亚烷基、杂亚环基、烷基杂亚环基、杂环亚烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷基氨基羧基、杂烷基氨基羧基、二烷基氨基羧基或杂二烷基氨基羧基基团，Z通过所述连接基团结合至A。任选地，此类连接基团还可以包括一个或多个官能团，诸如下面描述的连接部分。所述连接基团也可以是连接Z和A的连接部分。合适连接部分是本领域已知的，并且包括例如，仲酰胺(-CONH-)、叔酰胺(-CONR-)、仲氨基甲酸根(-OCONH-、-NHCOO-)、叔氨基甲酸根(-OCONR-、-NRCOO-)、脲(-NHCONH-、-NRCONH-、-NHCONR-、-NRCONR-)、甲醇(-CHOH-、-CROH-)、醚(-O-)和酯(-COO-、–CH2O2C-、CHRO2C-)、亚胺和二硫键，其中R是烷基基团、芳基基团或杂环基基团。
A可以为任何合适的亲脂性部分。所述亲脂性部分可以包括衍生自脂质的部分(例如，由脂质与Z或L(当存在时)共价反应形成的部分)。所述脂质可以为任何合适的天然存在的或合成的脂质。例如，所述脂质可以包括脂肪酸、甘油酯、磷脂、鞘脂、固醇或异戊烯醇。
在一些实例中，所述脂质可包括脂肪酸。脂肪酸包括以羧酸基团终止的烃链。在一些实例中，脂肪酸可以包含至少12个碳原子。所述脂肪酸可以为饱和的、单不饱和的或多不饱和的脂肪酸。在一些实例中，所述脂肪酸可以是人体内天然存在的脂肪酸。可以单独使用或作为较大脂质的一部分使用的合适的脂肪酸的实例，包括肉豆蔻酸(12:0，十四酸)、棕榈酸(16:0，十六酸)、硬脂酸(18:0，十八酸)、花生酸(20:0，二十酸)和二十二烷酸(22:0，二十二酸)的饱和脂肪酸；棕榈油酸(16:1(n-7)，顺式-9-十六酸)、岩芹酸(18:1(n-12)，顺式-6-十八酸)、油酸(18:1(n-9)，顺式-十八酸)、顺-异油酸(18:1(n-7)，顺式-11-十八酸)、芥酸(22:1(n-9)，顺-13-二十二酸)的单不饱和脂肪酸；和亚油酸(18:2(n-6)，9,12-十八碳二烯酸)、γ亚麻酸(18:3(n-6)，6,9,12-十八碳三烯酸)、α亚麻酸(18:3(n-3)，9,12,15-十八碳三烯酸)、花生四烯酸(20:4(n-6)，5,8,11,14,17-二十碳四烯酸)、EPA(20:5(n-3)，5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)和DHA(22:6(n-3)，4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)的多不饱和酸。
具有取代基或沿碳链分支的脂肪酸衍生物也可以在本发明中使用，条件是要维持所述衍生脂肪酸的脂质特征。例如，所述脂肪酸可以为拥有10-30个碳原子的支链的脂肪酸。分支可以包括一个或多个沿饱和的或不饱和的脂肪酸链的任何位置取代的甲基基团，或者涉及更大的烷基基团。其他可用的脂肪酸包括那些沿脂肪酸主链或在末端位置具有一个或多个脂环族环的脂肪酸。另外可用的脂肪酸也包括羟基脂肪酸，其中羟基基团在羧酸的两个碳原子之内(α-和β-羟基脂肪酸)。羟基脂肪酸的α-或β-羟基也可通过形成醚或酯进一步衍生以在脂质上添加第二条脂肪酸链，从而增加其亲脂性质。脂肪酸的前述讨论也适用于其在以下类型的脂质中的使用，其中所述脂质包括脂肪酸组分。
除了以其天然存在的形式被使用外，上述脂肪酸还可以被修饰，例如，通过将酸头基转化为醇或胺、可进一步衍生为离去基团的醇或离去基团，以更好地促进共价或非共价结合到由Z或L。还有，可以通过添加一个短间隔，例如，形成具有2-氨基乙醇、乙二醇或拥有所需官能团的其他乙醇衍生物的酯使所述脂肪酸衍生。制备此类修饰的脂肪酸所需的所有化学品被有机合成领域的化学技术人员认为是常规和公知的。
在一些实例中，所述脂质包括脂肪酰胺。脂肪酰胺是脂肪酸的酰胺类似物。合适的脂肪酰胺包括那些其中的脂肪酸，如上所述通过例如，用2-氨基乙醇处理转换为酰胺，从而提供可被进一步修饰(如果需要)的醇的脂肪酰胺。类似地，脂肪酰胺可以使用二胺(诸如1,2-乙二胺)形成，从而提供用于促进连接至Z或L的伯胺。合适的脂肪酰胺也可以使用脂肪酸和氨基酸形成，然后其可以进一步衍生(如果需要)。脂肪酰胺实例包括花生四烯乙醇酰胺(anandamide)、N-花生四烯酰甘氨酸(N-arachidonoylglycine)和N-棕榈酰乙醇胺(N-palmitoylethanolamide)。
在一些实例中，所述脂质包括甘油酯。如上所述，合适的甘油脂包括单酰甘油酯和二酰甘油酯(例如，单酰基甘油和二酰基甘油和糖基甘油(glycosylglycerol))，其包括脂肪酸。
在一些实例中，所述脂质可包括磷脂。合适的磷脂的实例包括磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰-L-苏氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、双磷脂酰甘油(心磷脂)和磷酸糖脂(phosphoglycolipid)。其他合适的磷脂包括醚磷脂(例如，烷酰基磷脂和烯酰基磷脂)、溶血磷脂以及上述的任何磷脂，其中所述脂肪酸链中的一个已经被水解以得到单酰基、单烷基或单烯基磷酸酯。
在一些实例中，所述脂质可包括鞘脂。合适的鞘脂的实例包括鞘氨醇和其他类鞘氨醇碱(sphingoid base)、神经酰胺、神经酰胺磷脂和糖鞘脂。神经酰胺磷脂的实例包括除其中的神经酰胺结合到磷酸基团上的鞘磷脂(例如，鞘脂诸如神经酰胺磷酰基乙醇胺、神经酰胺磷酰基甘油和神经酰胺肌醇)之外的鞘脂。合适的类鞘氨醇碱可以包括具有不同碳链(长度、不饱和羟基化)的类鞘氨醇碱的类似物。在一些实例中，类鞘氨醇碱中的碳链可包括14-24个碳原子。合适的类鞘氨醇碱包括鞘氨醇(d18:1，d18:1Δ4t，4E-d18:1，或其顺式异构体：d18:1Δ4c，4Z-d18:1)、二氢鞘氨醇(d18:0，二氢鞘氨醇)、植物鞘氨醇(t18:0)和脱氢植物鞘氨醇(t18:1，t18:1Δ8t，8E-t18:1，或其顺式异构体：t18:1Δ8c，8Z-t18:1)和二十鞘氨醇(eicosasphingosine)(d20:1，4E-d20:1，d20:1Δ4t)。
在一些实例中，所述脂质可包括固醇。合适的固醇脂质包括固醇和氧固醇，所述氧固醇中胆固醇的A或B环被氧化，而不是烷基链被氧化，例如7β-羟基胆固醇或4β-羟基胆固醇。其他合适的氧固醇包括其中胆固醇的烷基侧链已被羟基化(并且任选地转化为胺)并且胆固醇骨架的A和B环处于还原形式(即，脱羟基)的氧固醇。其他合适的氧固醇包括拥有被氧化为羧酸的伯羟基基团的氧固醇，包括其中所述羧酸已经被酯化(例如，与2-氨基乙醇)的实例。
除了在哺乳动物中常见的固醇，合适的固醇可以包括来自其他来源诸如植物基固醇(植物固醇)的固醇。植物固醇实例包括但不限于菜油固醇、谷固醇、菜籽固醇、豆固醇、燕麦固醇。
其他合适的固醇包括衍生的固醇。固醇也可以通过向任何上述固醇或氧固醇的A环的3-羟基取代基或烷基侧链的羟基取代基加入，例如，2-氨基乙醇、肌醇、丝氨酸、糖苷、磷酰基乙醇胺、膦酰基乙醇胺、磷酰基丝氨酸、磷酰基肌醇、磷酰基糖苷或由2-氨基乙醇、丝氨酸、磷酰基乙醇胺或膦酰基乙醇胺衍生的糖苷来衍生。
在一些实例中，所述脂质可包括异戊烯醇。合适的异戊烯醇脂质可以包括脂溶性维生素(例如，维生素A、E和K)，以及其他异戊烯醇脂质，包括其他生育酚、生育三烯酚、视黄酸、多萜醇和聚异戊烯醇。其他合适的异戊烯醇包括异戊烯醇的二磷酸酯衍生物，诸如焦磷酸法尼酯和前角鲨烯二磷酸酯(presqualene diphosphate)。异戊烯醇脂质也可以通过，例如，向可用的羟基取代基添加2-氨基乙醇、肌醇、丝氨酸、糖苷、磷酰基乙醇胺、膦酰基乙醇胺、磷酰基丝氨酸、磷酰基肌醇、磷酰基糖苷、或由2-氨基乙醇、丝氨酸、磷酰基乙醇胺或膦酰基乙醇胺衍生的糖苷来进一步衍生。
在一些实例中，A为C8-C40烷基基团、C8-C40烯基基团、C8-C40烷氧基基团、C8-C40烷硫基基团、C8-C40烷基亚磺酰基基团、C8-C40烷基磺酰基基团、C8-C40烷基氨基基团、C8-C40二烷基氨基基团、C8-C40烷基羰基基团、C8-C40烷氧基羰基基团、C8-C40烷基氨基羰基基团、C8-C40二烷基氨基羰基基团或由下式定义的部分
其中
虚线指示单键或双键可以存在；
R6为烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、烷基芳基基团、芳基烷基基团、环烷基基团、烷基环烷基基团、杂环基基团、烷基杂环基基团、杂芳基基团、烷基杂芳基基团、烷氧基基团或烷硫基基团；并且
R7、R8、R9、R10和R11独立地为氢、羟基基团、氨基基团、烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、烷基芳基基团、芳基烷基基团、环烷基基团、烷基环烷基基团、杂环基基团、烷基杂环基基团、杂芳基基团、烷基杂芳基基团、烷氧基基团、烷硫基基团、烷基亚磺酰基基团、烷基磺酰基基团、烷基氨基基团、二烷基氨基基团、烷基羰基基团、烷氧基羰基基团、烷基氨基羰基基团或二烷基氨基羰基基团。
在某些实例中，A为下式定义的部分
其中虚线指示单键或双键可以存在；并且R6、R7、R8、R9、R10和R11如上所定义。在一个实例中，A为以下结构所定义。
在某些实例中，所述化合物可以由式IA定义
其中Z、L和A如上面关于式I所定义的。
在某些实例中，所述化合物由式II定义
其中
P1、R0、R1、R2、R3、R4、m、L和A如上面关于式I所定义的，
X为-O-或-NR12-；并且
R12为氢或烷基基团。
在某些实例中，R12为氢。在其他实例中，R12为烷基基团。例如，在一些实例中，R12可以为C1-C6烷基基团。在一些实例中，R12可以为C1-C4烷基基团。在某些实例中，R12可以为甲基或乙基。
在某些实例中，X为-O-。在其他实例中，X为-NH-或-N(CH3)-。
在某些实例中，所述化合物由式IIA定义
其中X、R12、L和A如上面关于式II所定义的。
在某些实施方案中，化合物可为以下中的一个。
药物制剂
也提供了包括本文所述的化合物的药物制剂。药物制剂可以包括治疗有效量的本文所述的化合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂的结合。代表性的赋形剂包括溶剂、稀释剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、悬浮剂、润湿剂、粘度调节剂、张力剂、稳定剂和其组合。合适的药学上可接受的赋形剂优选从由FDA通常公认为安全(GRAS)的材料中选择，并且可以在不引起不需要的生物副作用或不希望的相互作用下被施用至个体。
在某些实例中，药物制剂可以为脂质体制剂。例如，本文提供了包括由囊泡形成脂质形成的脂质体的药物制剂，并且本文所述的化合物被包埋在脂质体中。包埋在脂质体中的化合物可以被隔离在脂质体中心的水性区室中、脂质体脂质双层之间的水性空间中、或脂质体本身的双层内。
制剂中的脂质体可以主要由囊泡形成脂质构成。此类囊泡形成脂质是可以自发地在水中形成双层囊泡的脂质，如由磷脂所例证，其疏水部分与双层膜的内部的疏水区接触，并且其头基部分朝向膜的外部的极性表面定向。能够稳定并入脂质双层的脂质(诸如胆固醇和其各种类似物)也可以在脂质体中使用。所述囊泡形成脂质优选具有通常为酰基链的两个烃链和一个极性或非极性的头基的脂质。存在多种合成的囊泡形成脂质和天然存在的囊泡形成脂质，包括磷脂诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中两个烃链的长度约为14-22个碳原子之间，并且具有不同程度的不饱和。上述具有不同饱和度的脂质和磷脂的酰基链可以商购获得或根据公开的方法制备。其他合适的脂质包括糖脂、脑苷脂和固醇，诸如胆固醇。
囊泡形成脂质可以被选择以实现指定程度的流动性或刚性，以控制脂质体在血清中的稳定性，和/或以控制脂质体中的包埋剂的释放速率。具有更刚性的脂质双层或凝胶相双层的脂质体，通过相对刚性的脂质(例如具有相对高的相变温度，例如高达60℃的脂质)的并入来实现。刚性的，即饱和的脂质有助于提高脂质双层中的膜刚性。其他脂质组分，诸如胆固醇，也已知有助于脂质双层结构中的膜刚性。另一方面，脂质流动性由并入相对的液体脂质实现，通常是具有相对低的凝胶至液晶的相变温度(例如，在室温或低于室温)的脂质相的液体脂质。
脂质体可以任选地包括共价连接至亲水性聚合物的囊泡形成脂质。如已被描述的，例如在美国专利No.5,013,556中，包括在脂质体组合物中的此种聚合物衍生的脂质形成围绕所述脂质体的亲水性聚合物链的表面覆层。当与缺乏此种覆层的脂质体相比时，亲水性聚合物链的表面覆层能够有效地增加脂质体的体内的血液循环寿命。由甲氧基(聚乙二醇)(mPEG)和磷脂酰乙醇胺构成的聚合物衍生的脂质(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或二油酰磷脂酰乙醇胺)可自Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,Ala.)以各种mPEG分子量(350、550、750、1,000、2,000、3,000和5,000道尔顿)获得。mPEG-神经酰胺的脂质聚合物还可以从Avanti Polar Lipids,Inc购买。脂质-聚合物缀合物的制备也在文献中描述，参加美国专利No.5,631,018、6,586,001和5,013,556；Zalipsky,S.等,Bioconjugate Chem.8:111(1997)；Zalipsky,S.等,Meth.Enzymol.387:50(2004)。这些脂质聚合物可以如良好定义的具有最小的分子量分散度的高纯度的均质材料来制备(Zalipsky,S.等,Bioconjugate Chem.8:111(1997)；Wong,J.等,Science 275:820(1997))。所述脂质聚合物也可以是“中性的”脂质聚合物，诸如聚合物-二硬脂酰缀合物，如在美国专利No.6,586,001(其通过引用并入本文)中所述。
当脂质-聚合物缀合物被包含在脂质体中时，通常1-20摩尔百分比之间的脂质-聚合物缀合物被并入到总脂质混合物中(参见，例如，美国专利No.5,013,556)。
如果需要用于特定的应用中，脂质体可以包括配体，诸如缀合到脂质体的靶向配体。例如，脂质体可以任选地包括修饰以包括配体的脂质聚合物，形成脂质-聚合物-配体缀合物，在本文中也称为‘脂质聚合物-配体缀合物’。所述配体可以是治疗性分子，诸如在体内具有活性的药物或生物分子、诊断分子(诸如造影剂或生物分子)、或对于结合配偶体(优选细胞的表面上的结合配偶体)具有结合亲和力的靶向分子。例如，配体可以对细胞表面具有结合亲和力，以便促进脂质体通过内化进入细胞的细胞质中。存在于包括此种脂质聚合物-配体的脂质体中的配体是从脂质体表面向外定向，并因此可用于与它的同源受体相互作用。
用于将配体附接至脂质聚合物的方法是已知的，其中所述聚合物可以官能化用于随后与选择的配体反应。(美国专利No.6,180,134；Zalipsky,S.等,FEBS Lett.353:71(1994)；Zalipsky,S.等,Bioconjugate Chem.4:296(1993)；Zalipsky,S.等,J.Control.Rel.39:153(1996)；Zalipsky,S.等,Bioconjugate Chem.8(2):111(1997)；Zalipsky,S.等,Meth.Enzymol.387:50(2004))。官能化的聚合物-脂质缀合物也可商购获得，诸如末端官能化的PEG-脂质缀合物(Avanti Polar Lipids,Inc.)。配体和聚合物之间的键可以是稳定的共价键或响应于刺激(诸如pH的变化或还原剂的存在下)裂解的可释放的键。
所述配体可以是对于细胞受体或在血液中循环的病原体具有结合亲和力的分子。所述配体也可以是治疗剂或诊断分子，特别是当以游离形式施用时具有短的血液循环寿命的分子。在一个实施方案中，配体是生物配体，诸如对细胞受体具有结合亲和力的配体。生物配体实例包括对CD4、叶酸、胰岛素、LDL、维生素、转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白、选择蛋白(诸如E、L和P选择蛋白)、Flk-1,2、FGF、EGF、整联蛋白(α4β1αvβ3、αvβ1αvβ5、αvβ6整联蛋白)、HER2和其他的受体具有结合亲和力的分子。配体在本领域中是已知的，并且可以包括蛋白质和肽，其包括抗体和抗体片段，诸如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv(由重链和轻链的可变区组成的片段)和scFv(重组单链多肽分子，其中的轻链和重链可变区通过肽接头连接)等。配体也可以是小分子肽模拟物。应该理解，细胞表面受体或其片段可以充当配体。靶向配体其他实例包括但不限于，维生素分子(例如，生物素、叶酸、氰钴胺素)、寡肽、寡糖。其他的配体实例包括那些在美国专利No.6,214,388、6,316,024、6,056,973和6,043,094(其通过引用并入本文)中所述的配体。
包括本文所述的化合物的脂质体制剂可以使用用于制备和/或装载脂质体的任何合适的方法形成。例如，本文所述的化合物和一种或多种囊泡形成脂质可以溶解在合适的溶剂中，并且可以蒸发所述溶剂以形成脂质膜。所述脂质膜可与水溶液(例如，具有7-9的pH)水合，以形成包含包埋的化合物的脂质体。
脂质体形成后，脂质体可以被设定尺寸以获得具有基本上均匀的尺寸范围的一组脂质体，例如0.01至0.5微米的尺寸范围(例如，0.03-0.40微米)。脂质体可以通过任何合适的方法设定尺寸，诸如通过挤压穿过具有所选的一致的孔径尺寸的膜(例如，具有在0.03至0.2微米的范围内的所选的一致的孔径尺寸的聚碳酸酯膜)。所述膜的孔径尺寸大致对应于通过挤压穿过所述膜生产的脂质体的最大尺寸，尤其当挤压穿过同一膜两次或更多次制备时。均质化方法也可以用于制备具有100nm或更小的尺寸的脂质体(Martin,F.J.,Specialized Drug Delivery Systems—Manufacturing and Production Technology,P.Tyle,Ed.,Marcel Dekker,New York,267-316页(1990))。
在一些实施方案中，制剂中的脂质体可具有如通过动态光散射所测量的，50nm至250nm(例如，50nm至200nm、75nm至150nm、90nm至150nm、120nm至150nm、100nm至130nm或90nm至110nm)的平均颗粒尺寸。在一些实施方案中，制剂中的脂质体可以具有-50mV至0mV(例如，-25mV至0mV、-15mV至0mV或-10mV至0mV)的ζ电位。
设定尺寸后，可以通过合适的技术(诸如透析、离心、切向流渗滤、尺寸排阻色谱或离子交换)去除未包封的化合物，以实现具有高浓度的包埋在脂质体中的化合物并且在脂质体外的溶液中几乎没有化合物的脂质体悬浮液。脂质体形成后，也可以通过滴定、透析等调节所述脂质体的外相(如果需要)至适当的pH。
一旦形成，可使用本领域中已知的方法冻干脂质体悬浮液。所得的组合物可以是冻干粉末的形式。术语“冻干粉末”是指通过水性混合物的冻干获得的任何固体材料。在一些实例中，冻干保护剂诸如蔗糖或海藻糖，可以在冻干之前加入到脂质体制剂中。
可以在不同长度的储存时间后通过结块外观的目视检查、复溶时间和复溶的脂质体的性质来评估冻干制剂的稳定性。在定量标准方面，脂质体制剂可以由以下评估：通过目视检查微粒的外观或浊度、颜色变化、通过动态光散射在粒径分析仪上的平均粒径和多分散指数分析(例如，使用NICOMP370粒径系统)、ζ电位测量(例如，使用Malvern Instrument’s Zetasizer)、通过色谱法测量药物包封的百分比(例如，通过在Sepharose CL-4B柱上的尺寸排阻色谱)、通过HPLC和通过LC-MS测量药物物质和赋形剂的化学完整性和分解产物的外观。BTZ脂质体制剂优选的稳定范围为在4度储存6个月后相对于立即复溶的样品，其平均粒径和药物包封百分的变化比小于20％，药物产品的化学分解小于5％。
冻干制剂在施用之前通过加入水性溶剂可以很容易地复溶。复溶溶剂可以适用于药物施用(例如，肠胃外施用至受试者)。合适的复溶溶剂的实例包括但不限于，水、盐水和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
本文所述的脂质体制剂可以与其他抗癌剂结合使用，所述抗癌剂包括各种化疗剂，诸如阿糖胞苷、氟达拉滨、地西他滨、柔红霉素和治疗抗体，诸如利妥昔单抗、阿仑单抗、酪氨酸激酶抑制剂和具有抗癌活性的任何其他药剂。另外，抗癌剂可以在相同的脂质体制剂中作为硼酸剂共同配制。例如，柔红霉素或阿糖胞苷可以以限定的药物比率共同包封入脂质体硼替佐米中。此类型的结合的可以以产生最佳的治疗协同作用的比例介导治疗组合的共同递送。
使用方法
本文还提供了治疗癌症的方法。治疗癌症的方法可以包括给受试者施用治疗有效量的本文所述的化合物或制剂。本文所述的化合物可充当蛋白酶体抑制物。蛋白酶体抑制物通过它们抑制细胞蛋白酶体活性的能力诱导细胞凋亡。更具体地，在真核细胞中，泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质的蛋白降解的中心途径。蛋白质最初是通过附接至聚泛素链针对蛋白水解，并且然后被蛋白酶体迅速降解为小肽，并且释放和再循环泛素。此协同的蛋白水解途径依赖于泛素-缀合系统和26S蛋白酶体的协同活性。26S蛋白酶体是存在于真核生物的细胞核和细胞质中大的(1,500-2,000kDa)多亚基复合物。此复合物的催化核心(称为20S蛋白酶体)，是由含有α-和β-亚基的四个七聚环组成的圆柱形结构。所述蛋白酶体是苏氨酸蛋白酶体，提供亲核体的β-亚基的N-末端的苏氨酸攻击靶蛋白肽键的羰基。至少三个不同的蛋白水解活性与蛋白酶体相关：糜蛋白酶、胰蛋白酶和肽谷氨酰。识别和结合聚泛素化底物的能力是通过结合到所述20S蛋白酶体的每个端部的19S(PA700)亚基所赋予的。这些辅助亚基展开底物并将其送入20S催化复合物中，同时去除附着的泛素分子。26S蛋白酶体的组装和蛋白质底物的降解都是是ATP依赖性的(Almond,Leukemia 16:433(2002))。
泛素-蛋白酶体系统通过蛋白质的协同的和暂时的降解调节许多细胞过程。通过控制许多关键的细胞蛋白质的水平，蛋白酶体作为细胞生长和凋亡以及破坏其活性的调节器对细胞周期有深刻的影响。例如，缺陷的细胞凋亡涉及若干疾病的发病机制，所述疾病包括某些癌症诸如B细胞慢性淋巴细胞白血病，其中存在休眠肿瘤细胞的积累。
蛋白酶体抑制剂作为一类化合物一般通过抑制由蛋白酶体的蛋白降解起作用。此类化合物包括肽醛、肽乙烯砜，其通过结合并直接抑制蛋白酶体20S核心内的活性位点起作用。然而，肽醛和肽乙烯砜以不可逆的方式与20S核心颗粒结合，使得在去除它们时蛋白水解活性也不能被恢复。相比之下，肽硼酸化合物诸如如本文所述的那些，赋予蛋白酶体稳定的抑制作用，还可以从蛋白酶体缓慢地解离。所述肽硼酸化合物比它们的肽醛类似物更有效，更具体地在于，硼和硫之间的弱相互作用意味着肽硼酸盐不抑制巯基蛋白酶(Richardson,P.G.,等,Cancer Control.10(5):361,(2003))。
多种来自肿瘤的细胞系暴露于蛋白酶抑制剂会引发细胞凋亡，可能是由于若干途径(包括细胞周期调节蛋白、p53和核因子κB(NF-κB))的影响(Grimm,L.M.和Osborne,B.A.,Results Probl.Cell.Differ.23:209-28(1999)；Orlowski,R.Z.,Cell Death Differ.6(4):303-13(1999))。很多记录蛋白酶抑制剂介导的凋亡的最初的研究使用的是造血起源的细胞，包括原单核细胞(Imajoh-Ohmi,S.等,Biochem.Biophys.Res.Commun.217(3):1070-77(1995))、T细胞和淋巴细胞白血病细胞(Shinohara,K.等,Biochem.J.317(Pt 2):385-88,(1996))、淋巴瘤细胞(Tanimoto,Y.等,J.Biochem.(Tokyo)121(3):542-49(1997))和早幼粒细胞白血病细胞(Drexler,H.C.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(3):855-60(1997))。蛋白酶体抑制剂的体内抗肿瘤活性的首次证明使用的是人淋巴瘤异种移植模型(Orlowski,R.Z.等,Cancer Res 58(19):4342-48(1998))。此外，蛋白酶体抑制剂据报道优选诱导来自患者的淋巴瘤细胞(Orlowski,R.等Cancer.Res.,58:(19):4342(1998))和白血病细胞的凋亡(Masdehors,P.等,Br.J.Haematol.105(3):752-57(1999))，并且相对于备用的对照的非转化细胞，优选地抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖(Hideshima,T.等,Cancer Res.,61(7):3071-76(2001))。因此，蛋白酶体抑制剂作为治疗剂在患有难医治的血液恶性肿瘤的患者中特别有用。
在一个实施方案中，本文所述的化合物或制剂用于治疗癌症，并且更特别用于癌症患者中的肿瘤治疗。所述癌症可以是肿瘤。所述癌症也可以是胃癌、肾癌、骨癌、肝癌、脑癌、皮肤癌、口腔癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、肠癌、骨髓性白血病、黑色素瘤、神经胶质瘤、甲状腺滤泡癌、膀胱癌、骨髓增生异常综合征、乳腺癌、低级星形细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌或成神经母细胞瘤。
在某些实例中，所述癌症可以是多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤是无法治愈的恶性肿瘤，其每年在美国约15,000人中诊断出(Richardson,P.G.等,Cancer Control.10(5):361(2003))。它是血液恶性肿瘤，其特征通常在于骨髓中多个位点的无性系浆细胞的积累。多数患者响应于初始的化疗和放疗；然而，大多数由于抗性肿瘤细胞的增殖而最终复发。在一个实施方案中，提供了用于在受试者中治疗多发性骨髓瘤的方法，其包括施用包含本文所述的化合物的脂质体制剂。
在某些实例中，所述癌症可以是乳腺癌。本文所述的化合物和制剂可以通过帮助克服一些癌细胞抵抗化疗作用的主要途径而在乳腺癌的治疗中有效。例如，通过凋亡的调节子NF-kB和P44/42丝裂原活化蛋白激酶途径的信号可以抗凋亡。由于蛋白酶体抑制剂可以阻断这些途径，所述化合物就能够激活细胞凋亡。因此，在一个实施方案中，提供了用于在受试者中治疗乳腺癌的方法，其包括施用包含本文所述的化合物的脂质体制剂。此外，由于化疗剂诸如紫杉烷类和蒽环类已经显示出激活这些途径中的一个或两个，那么蛋白酶体抑制剂结合常规化疗剂的使用可以用来增强药物(诸如紫杉醇和多柔比星)的抗肿瘤活性。因此，在另一实施方案中，提供的是治疗癌症的方法，其中以游离形式或以脂质体包埋形式的化疗剂与本文所述的化合物或制剂结合施用。
对于本文所述的化合物和制剂的剂量和给药方案将取决于被治疗的癌症、癌症的阶段、患者的体重和健康以及其他对主治的医学护理人员显而易见的因素。可以使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米Pyz-Phe-boroLeu(PS-341)的临床研究来为选择合适的剂量和给药方案提供指导。例如，静脉内给药每周一次或两次，实体瘤患者的最大耐受剂量为1.3mg/m2(Orlowski,R.Z.等,Breast Cancer Res.5:1-7(2003))。在另一研究中，硼替佐米在3周周期内的1、4、8和11天以静脉内团注给药，建议的最大耐受剂量为1.56mg/m2(Vorhees,P.M.等,Clinical Cancer Res.9:6316(2003))。然而，由于脂质体BTZ比游离的BTZ毒性小，脂质体药物的最佳临床剂量可以高出数倍。
施用
本文所述的化合物和制剂可以胃肠外施用(例如，通过静脉内施用或皮下施用)。应当理解，所述制剂可以包括任何必要的或所需的药物赋形剂以促进递送。本文所述的化合物和制剂也可以通过经口途径施用，通过腹膜内注射(i.p.injection)、肌内注射、瘤内注射以及作为微粉化的固体或液体气雾剂通过气道施用。
关于本文所述的化合物的术语“施用”及其变体(例如“施用”化合物)意指将化合物或其制剂引入到需要治疗的受试者的系统中。当将本文所述的化合物或其制剂与一种或多种其他活性剂(例如，细胞毒性剂)结合提供时，“施用”及其变体应各自理解成包括所述化合物或其制剂与其他药剂的同时和/或相继引入。
公开的化合物和含有它们的制剂的体内应用可以通过本领域技术人员目前或预期已知的任何合适的方法和技术来完成。例如，所公开的化合物可以以生理上或药学上可接受的形式配制，并且可以通过本领域技术人员已知的任何合适的途径施用，例如口腔、鼻腔、直肠、局部和肠胃外施用途径。如本文所用，术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、肌内、腹膜内和胸骨内施用，诸如通过注射。所公开的化合物或制剂的施用可以是单次施用，或者在可由本领域技术人员容易地确定的连续的或不同的时间间隔施用。
本文所公开的化合物和包含它们的制剂，还可以利用脂质体技术、缓释胶囊、可植入泵和可生物降解的容器施用。这些递送方法可以有利地在较长一段的时间内提供一致的剂量。所述化合物也可以以它们的盐衍生物形式或晶态形式施用。
本文公开的化合物可以根据已知的用于制备药学上可接受的组合物的方法来配制。配方在领域技术人员熟知的并且容易得到多个来源中详细描述。例如，E.W.Martin(1995)的Remington’s Pharmaceutical Science描述了可以与所公开的方法结合使用的配方。一般来讲，可以配制本文所公开的化合物，使得有效量的所述化合物为了促进化合物的有效施用而与合适的载体结合。所用的制剂也可以呈多种形式。其包括例如，固体、半固体和液体剂型，诸如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液或悬浮液、栓剂、可注射的和可输注的溶液以及喷雾剂。优选形式取决于意图施用的模式和治疗应用。所述制剂也优选包括本领域技术人员已知的常规的药学上可接受的载体和稀释剂。与化合物一起使用的载体或稀释剂的实例包括乙醇、二甲基亚砜、甘油、氧化铝、淀粉、盐水和等效的载体和稀释剂。为了提供所需治疗性处理的施用剂量，本文所公开的组合物可以有利地包括按重量计基于包括载体或稀释剂的总制剂的重量的约0.1％和99％，并且尤其是1％和15％之间的一种或多种目标化合物的总量。
适用于施用的制剂包括例如，水性的无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包括助悬剂和增稠剂。制剂可被呈现于单剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)的条件下，仅需使用前的无菌液体载体(例如注射用水)条件。临时注射溶液和混悬液可由无菌粉末、颗粒和片剂等制备。应理解，除以上特别提到的成分之外，本文所述的组合物可以包括与所讨论制剂类型有关的本领域常见的其他药剂。
对于肿瘤病症的治疗，本文所公开的化合物可以与其他抗肿瘤或抗癌物质和/或放疗和/或光动力疗法和/或外科治疗结合施用至需要治疗的患者中以去除肿瘤。这些其他物质或治疗可以与本文所公开的化合物同时给予或在不同时间下给予。例如，本文所公开的化合物可以与有丝分裂抑制剂结合使用，诸如紫杉酚或长春碱，烷基化剂诸如环磷酰胺或异环磷酰胺，抗代谢物诸如5-氟尿嘧啶或羟基脲，DNA嵌入剂诸如多柔比星或博来霉素，拓扑异构酶抑制剂诸如依托泊苷或喜树碱，抗血管生成剂诸如血管抑素，抗雌激素诸如他莫昔芬，和/或其他抗癌药物或抗体诸如，分别例如GLEEVEC(Novartis Pharmaceuticals Corporation)和HERCEPTIN(Genentech,Inc.)。
许多肿瘤和癌症具有病毒基因组，存在于肿瘤或癌细胞中。例如，Epstein-Barr病毒(EBV)与多个哺乳动物恶性肿瘤相关。本文所公开的化合物也可以单独使用或与抗癌剂或抗病毒剂诸如更昔洛韦、齐多夫定(AZT)、拉米夫定(3TC)等结合使用以治疗感染会导致细胞转化的病毒的患者，和/或治疗具有与细胞中病毒基因组的存在相关的肿瘤或癌症的患者。本文所公开的化合物也可以结合肿瘤学疾病基于病毒的治疗使用。例如，所述化合物可以与突变型单纯疱疹病毒在非小细胞肺癌的治疗中使用(Toyoizumi,等,“Combined therapy with chemotherapeutic agents and herpes simplex virus type IICP34.5mutant(HSV-1716)in human non-small cell lung cancer,”Human Gene Therapy,1999,10(18):17)。
含有它们的化合物和制剂的治疗性应用可以通过本领域技术人员目前或预期已知的任何合适的方法和技术来完成。另外，本文所公开的化合物和组合物具有作为用于制备其他有用的化合物和组合物的起始原料或中间体的用途。
本文所公开的化合物和制剂可以在一个或多个解剖位点诸如不希望的细胞生长的位点局部施用(诸如肿瘤位点或良性皮肤生长，例如注射或局部施加至肿瘤或皮肤生长)，任选地与药学上可接受的载体诸如惰性稀释剂结合。本文所公开的化合物和制剂可以全身施用诸如静脉内或经口，任选地与药学上可接受的载体诸如惰性稀释剂或用于经口递送的可同化可食用的载体结合。它们可封闭在硬壳或软壳明胶胶囊中，可压制成片剂，或可直接与患者膳食的食物合并。对于经口的治疗性施用，活性化合物可与一种或多种赋形剂结合并且以可摄取片剂、经颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、粉片、喷雾剂等形式使用。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可含有以下：粘合剂，诸如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；以及甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜(aspartame)或可添加调味剂，诸如胡椒薄荷、冬青油或樱桃香精。当单位剂型是胶囊时，除以上类型的材料之外，它可以含有液体载体诸如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可作为包衣呈现或以其他方式修改固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用明胶、蜡、虫胶或糖等包覆。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂诸如樱桃或甜橙香精。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料都应为药学上可接受的并且在所用量下大致上无毒。另外，活性化合物可并入持续释放制剂和装置中。
本文所公开的化合物和制剂，包括药学上可接受的其盐、水合物或其类似物，可以通过静脉内、肌内或腹膜内输注或注射施用。活性化合物或其盐的溶液可以在水中制备，任选与无毒表面活性剂混合。还可以在甘油、液体聚乙二醇、三乙酸甘油酯和其混合物中以及油中制备分散液。在普通储存和使用条件下，这些制备可以含有防腐剂以预防微生物生长。
适用于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散液或任选地包封于脂质体中的包含活性成分的无菌粉末，所述活性成分适合于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液。最终剂型在制造和存储条件下应该是无菌的、液体的和稳定的。液体载体或媒介物可为溶剂或液体的分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适合的混合物。可例如通过形成脂质体、在分散液的情况下维持所需粒度或使用表面活性剂来维持适当的流动性。任选地，可以通过各种其他抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现对微生物活动的预防。在许多情况下，将优选的是包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可以通过使用延缓吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射的组合物的延长吸收。
通过将在适当的溶剂中的所需量的本问所公开的化合物和/或药剂与如上列举的各种其他成分(根据需要)合并，接着过滤灭菌来制备无菌注射液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术产生活性成分外加存在于先前无菌过滤溶液中的任何额外所需成分的粉末。
对于局部施用，本文所公开的化合物和药剂可以以液体或固体施加。然而，通常将需要的是将它们与皮肤病学上可接受的载体(可为固体或液体)结合作为制剂局部施用至皮肤。本文所公开的化合物和药剂和制剂可局部施加到受试者的皮肤以减少恶性或良性生长的大小(并且可以包括完全去除)，或治疗感染部位。本文所公开的化合物和药剂和制剂可直接施加到生长或感染部位。优选地，所述化合物和药剂以制剂形式(诸如软膏、乳膏、洗剂、溶液、酊剂等)被施加到生长或感染部位。也可以使用用于递送药物物质至真皮病变部位的药物递送系统，如在美国专利No.5,167,649中所述。
可用的固体载体包括精细分散的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。可用的液体载体包括水、醇或二醇或水-醇/二醇掺合物，其中所述化合物可任选地借助于无毒表面活性剂在有效水平下溶解或分散于所述载体中。可添加诸如芳香剂和额外抗微生物剂的佐剂以最优化给定用途的性质。所得的液体组合物可通过用于浸渍绷带和其他敷料的吸收垫施加，或使用例如泵型喷雾器或气雾剂喷雾器喷射于受影响的区域上。
诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯类、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物质的增稠剂也可与液态载体一起使用，以形成用于直接向使用者的皮肤应用的可涂抹的糊剂、凝胶剂、软膏剂、皂剂等。可用于递送化合物到皮肤的由于的皮肤病学组合物的实例在美国专利No.4,608,392、美国专利No.4,992,478、美国专利No.4,559,157和美国专利No.4,820,508中公开。
本文所公开的化合物和药剂和药物制剂的可用剂量可通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性来确定。用于将小鼠和其他动物中的有效剂量外推至人的方法为本领域所已知；例如参见美国专利No.4,938,949。
还公开了包含本文所公开的化合物与药学上可接受的载体结合的药物组合物。适合于经口、局部或肠胃外施用，包含一定量的化合物的药物组合物构成了优选的方面。施用给患者特别是人的剂量，应该足以实现在合理的时间框架内在患者中有治疗反应，无致死毒性，并且优选仅引起可接受水平的副作用或发病率。本领域技术人员将认识到，剂量将取决于多种因素，包括受试者的状况(健康)、受试者的体重、并行治疗的种类(如果有的话)、治疗的频率、治疗比以及病理病状的严重程度和阶段。
对于肿瘤病症的治疗，本文所公开的化合物和药剂和组合物可以在其他抗肿瘤剂或抗癌剂或物质(例如，化疗剂、免疫治疗剂、放疗剂、细胞毒性剂等)和/或与放射治疗和/或外科手术治疗之前、之后、或相结合施用至需要治疗的患者以去除肿瘤。例如，本文所公开的化合物和药剂和组合物可以在治疗癌症的方法中使用，其中患者需要、正在或已经使用有丝分裂抑制剂治疗，所述有丝分裂抑制剂诸如紫杉酚或长春碱，烷基化剂诸如环磷酰胺或异环磷酰胺，抗代谢物诸如5-氟尿嘧啶或羟基脲，DNA嵌入剂诸如多柔比星或博来霉素，拓扑异构酶抑制剂诸如依托泊苷或喜树碱，抗血管生成剂诸如血管抑素，抗雌激素诸如他莫昔芬，和/或其他抗癌药物或抗体诸如，分别例如GLEEVEC(Novartis Pharmaceuticals Corporation；East Hanover,NJ)和HERCEPTIN(Genentech,Inc.；South San Francisco,CA)。这些其他物质或放射治疗可以与本文所公开的化合物同时给予或在不同时间下给予。其他合适的化疗剂的实例包括但不限于，六甲蜜胺、博来霉素、硼替佐米(VELCADE)、白消安、亚叶酸钙、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、克立他酶(crisantaspase)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表多柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉非替尼(IRESSA)、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼(GLEEVEC)、伊立替康、脂质体多柔比星、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇，喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、链佐星、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、噻替派、硫鸟嘌呤(tioguanine/thioguanine)、拓扑替康、苏消安、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨。在例证的实施方案中，化疗剂为美法仑。合适的免疫治疗剂的实例包括但不限于，阿来组单抗、西妥昔单抗(ERBITUX)、吉妥珠单抗、碘131托西莫单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)。细胞毒性剂包括例如，放射性同位素(例如，I131、I125、Y90、P32等)和细菌、真菌、植物或动物来源的毒素(例如，蓖麻毒素、肉毒杆菌毒素、炭疽毒素、黄曲霉毒素、水母毒液(例如，箱水母等)也公开了用于治疗肿瘤病症的方法，其包括在施用化疗剂、免疫治疗剂、放疗剂或放疗之前、之后、或相结合施用有效量的本文所公开的化合物和/或试剂。
试剂盒
所公开的主题还涉及封装的剂量制剂，其在一个或多个容器中包含至少一种抑制剂化合物或本文所公开的组合物，例如，式I中的任何化合物。封装的剂量制剂可任选地在一个或多个容器中包含药学上可接受的载体或稀释剂。
取决于待治疗的病症或疾病情况的合适的剂量可以是将会减少靶细胞的增殖或生长的量。在癌症的情形下，合适的剂量是将会在癌组织诸如恶性肿瘤中导致活性剂的浓缩的量，已知所述癌组织可以实现所需的响应。优选的剂量是导致癌细胞生长的最大抑制且没有难以处理的副作用的量。如本领域普通技术人员可以确定的，化合物和/或药剂的施用可以是连续的或在不同的时间间隔施用。
为了提供所需治疗性处理的施用剂量，在一些实施方案中，本文所公开的药物组合物可以包括按重量计基于包括载体或稀释剂的总组合物的重量的约0.1％和45％，并且尤其是1％和15％之间的一种或多种所述化合物的总量。举例来说，所施用的活性成分的剂量水平可以是：静脉内，0.01至约20mg/kg；腹膜内，0.01至约100mg/kg；皮下，0.01至约100mg/kg；肌内，0.01至约100mg/kg；经口，0.01至约100mg/kg；动物(身体)的重量。在一些实施方案中，所施用的活性成分的剂量水平可以是：静脉内，0.01至约2.5mg/kg；腹膜内，0.01至约5mg/kg；皮下，0.01至约5mg/kg；肌内，0.01至约5mg/kg；经口，0.01至约5mg/kg；动物(身体)的重量。在一些实施方案中，所施用的活性成分的剂量水平可以是：静脉内，0.01至约1mg/kg；腹膜内，0.01至约5mg/kg；皮下，0.01至约5mg/kg；肌内，0.01至约5mg/kg；经口，0.01至约5mg/kg；动物(身体)的重量。在某些实施方案中，所施用的活性成分的剂量水平可以是：静脉内，0.01至约0.5mg/kg；腹膜内，0.01至约1mg/kg；皮下，0.01至约1mg/kg；肌内，0.01至约1mg/kg；经口，0.01至约1mg/kg；动物(身体)的重量。
也公开了包含在一个或多个容器包含本文所公开的化合物的组合物的试剂盒。所公开的试剂盒可任选地包括药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一个实施方案中，试剂盒包括如本文所述的一种或多种其他组分、助剂或佐剂。在其他实施方案中，试剂盒包括一种或多种抗癌剂，诸如本文所述的那些药剂。在一个实施方案中，试剂盒包括描述如何施用试剂盒的化合物或组合物的说明书或包装材料。试剂盒的容器可以是任何合适的材料，例如玻璃、塑料、金属等，并且可以是任何合适的尺寸、形状或构造。在一个实施方案中，本文所公开的化合物和/或药剂以固体诸如片剂、丸剂或粉末形式被提供在试剂盒中。在其他实施方案中，本文所公开的化合物和/或药剂以液体或溶液被提供在试剂盒中。在一个实施方案中，试剂盒包括含有本文所公开的以液体或溶液形式的化合物和/或药剂的安瓿或注射器。
通过非限制性说明的方式，本公开的某些实例的实例在下面给出。
实施例
以下实施例列出在下文中，以示出根据所公开主题的方法、组合物和结果。这些实施例并不意图包括本文所公开主题的所有方面，而是示出代表性方法、组合物和结果。这些实施例并不意图排除本发明的等效物和变体，这些对本领域技术人员而言显而易见。
已经努力确保关于数值(例如量、温度等)的准确性，但对一些误差和偏差应予以说明。除非另外指出，否则份数是重量份，温度是以℃为单位或环境温度，并且压力等于或接近大气压。反应条件有多个变化和组合，例如，组分浓度、温度、压力和可用于优化由所述的工艺获得的产物纯度和产率的其他反应范围和条件。优化这些处理条件仅仅需要合理和常规的实验。
实施例1.BTZ-OMG的制备、配方和评估
BTZ-油酰葡甲胺(BTZ-OMG)的亲脂性酯的合成
葡甲胺与油酰氯以1:1的摩尔比进行反应，产生N-甲基-N((4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟己基)油酰胺(OMG)(方案1)。然后将OMG偶联至BTZ以产生BTZ-OMG(方案1)。
BTZ-OMG脂质体制剂的制备
L-α-磷脂酰胆碱(卵PC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)缀合的聚乙二醇(PEG)(mPEG-DSPE)和BTZ-OMG以40:38:2:20的摩尔比溶解在氯仿中。施加旋转蒸发以形成干燥的脂质膜，然后用乙酸钙缓冲液在pH为8下水合。使用挤压以减少脂质体的尺寸至150nm或更小。然后通过在Sepharose CL-4B柱上的尺寸排阻色谱法去除任何剩余的未包封药物。最终，无菌过滤并冻干所述脂质体。
在一些实例中，脂质体在pH 8下制得，在10％蔗糖作为冻干保护剂的存在下冻干，并且在使用前不久复溶。
方案1.BTZ-OMG的结构和合成。
BTZ-OMG脂质体制剂的表征
通过动态光散射在NICOMP亚微米粒径仪模型370上确定脂质体的粒径分布。用1:9甲醇萃取Sepharose CL-4B柱的级分后，包封效率通过UV-可见分光光度计检测为在270nm处的OD(图1)。取450nm处未经甲醇萃取的OD为参考测量值(图1)。然后，计算在脂质体级分中药物含量的总量与总药物级分的比。在本实施例中，获得了41％的药物包埋。
另外，冻干一批未去除游离药物的所述脂质体。再水合后取装载效率，并且冻干和未冻干的装载结果似乎相同。这表明，BTZ-OMG的脂质体制剂在冻干过程中保持稳定。
实施例2.BTZ-OGA的制备
制备BTZ-OGA所使用的合成方法学在方案2中描述。简单来说，油葡糖胺(OGA)由葡萄糖、油胺和氰基硼氢化钠使用Borch型还原性胺化合成。然后将OGA偶联至BTZ，得到BTZ-OGA(方案2)。D-葡萄糖和油胺以1:1的摩尔比在叔丁醇中共溶解并搅拌24小时。接着，在冰浴中将混合物冷却到0℃，并且加入等摩尔的NaCNBH4并连续搅拌直到氢气逸出消失。通过滴加浓HCl将混合物酸化至pH为2-3。通过离心分离以HCl盐形式沉淀的产物，并且用冰水洗涤。
BTZ-OGA脂质体制剂的制备
卵L-α-磷脂酰胆碱(卵PC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)缀合的聚乙二醇(PEG)(mPEG-DSPE)和BTZ-OGA以40:36:4:20的摩尔比溶解在氯仿中。施加旋转蒸发以形成干燥的脂质膜，然后用50mM的乙酸钙缓冲液和10％的乳糖在pH为8.5下水合。使用挤压以减少脂质体的尺寸至150nm或更小。然后通过在Sepharose CL-4B柱上的尺寸排阻色谱法去除任何剩余的未包封药物。最终，无菌过滤并冻干所述脂质体。
BTZ-OGA脂质体制剂的表征
通过动态光散射在NICOMP亚微米粒径仪模型370上确定脂质体的粒径分布。用1:9甲醇溶解从Sepharose CL-4B柱收集的级分后，包封效率通过UV-vis分光光度计检测为在270nm处的OD值。也取在450nm处未经甲醇溶解的OD为参考测量。然后，计算在脂质体级分中药物含量的总量与总药物级分的比。在本实施例中，获得了131.5nm的脂质体粒径和61％的药物包埋。
方案2.BTZ-OGA的结构和合成。
实施例3.BTZ-MEGA-12的制备、配方和评估
也研究了基于MEGA-12的脂质体制剂。MEGA-12和BTZ-MEGA-12的结构，以及制备BTZ-MEGA-12的策略示于方案3中。
BTZ-MEGA-12的合成
MEGA-12和BTZ以2:1的摩尔比在叔丁醇中共溶解。通过在室温下连续搅拌过夜实现反应。
BTZ-MEGA-12脂质体制剂的制备
卵L-α-磷脂酰胆碱(卵PC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)缀合的聚乙二醇(PEG)(mPEG-DSPE)和BTZ-MEGA-12以40:38:2:20的摩尔比溶解在氯仿中。施加旋转蒸发以形成干燥的脂质膜，然后用50mM的乙酸钙缓冲液和具有10％乳糖的5mM的磷酸钠缓冲液在pH为8下水合。使用挤压以减少脂质体的尺寸至150nm或更小。然后通过在Sepharose CL-4B柱上的尺寸排阻色谱法去除任何剩余的未包封药物。最终，无菌过滤并冻干所述脂质体。
脂质体装载的优化
使用50mM乙酸钠和5mM磷酸钠作为水合缓冲液从pH 6至pH 10检测水合pH对MEGA-12脂质体制剂装载效率的影响。结果在图2中绘出。本研究证明药物装载在pH 8时最大。然而，pH的依赖性有限，其中在所有测试的pH下装载效率始终在78％-82％的范围内，在pH 8下81.6％是最高装载。
根据上述的方法，通过UV-vis研究脂质体制剂中的BTZ-MEGA-12的包封效率。结果表明，获得了～81.6％的药物包埋。
方案3.BTZ-MEGA-12的结构和合成。
脂质体装载的优化
使用50mM乙酸钠和5mM磷酸钠作为水合缓冲液从pH 6至pH 10检测水合pH对MEGA-12脂质体制剂装载效率的影响。结果在图2中绘出。本研究证明药物装载在pH 8下最大。然而，pH的依赖性有限，其中在所有测试的pH下装载效率始终在78％-82％的范围内，伴随在pH 8下的81.6％是最高装载。
根据上述的方法，通过UV-vis研究脂质体制剂中的BTZ-MEGA-12的包封效率。结果表明，获得了高达81.6％的药物包埋(图3)。
实施例4.BTZ-葡糖醇-DPPE的制备
葡糖醇-DPPE和BTZ-葡糖醇-DPPE的结构，以及制备BTZ-葡糖醇-DPPE的策略示于方案4中。
BTZ-葡糖醇-DPPE的合成
葡糖醇-DPPE和BTZ以2:1的摩尔比在氯仿/叔丁醇/H2O(5:4:1)中搅拌。通过在室温下连续搅拌过夜实现反应。
BTZ-葡糖醇-DPPE脂质体制剂的制备
卵PC、胆固醇、mPEG-DSPE和BTZ-葡糖醇-DPPE以40:38:2:20的摩尔比溶解在氯仿中。施加旋转蒸发以形成干燥的脂质膜，然后用50mM的乙酸钠缓冲液和具有10％乳糖的10mM甘氨酸在pH为8.5下水合。使用挤压以减少脂质体的尺寸至150nm或更小。然后通过在Sepharose CL-4B柱上的尺寸排阻色谱法去除任何剩余的未包封药物。最终，无菌过滤并冻干所述脂质体。
脂质体制剂的表征
通过动态光散射在NICOMP亚微米粒径仪模型370上测定脂质体粒径分布。用1:9甲醇溶解Sepharose CL-4B柱的级分后，包封效率通过UV-vis分光光度计检测为在270nm下的OD。取在450nm处未经甲醇萃取的OD为参考测量值。然后，计算在脂质体级分中药物含量的总量与总药物级分的比。在本实施例中，获得了97.3nm的脂质体粒径。
方案4.BTZ-葡糖醇-DPPE的结构和合成。
实施例5.BTZ-MEGA-CHOL的制备、配方和评估
3β-[N-(甲葡糖胺)氨基甲酰]胆固醇(MEGA-CHOL)和BTZ-MEGA-CHOL的结构，以及制备BTZ-MEGA-CHOL的策略示于方案5中。
MEGA-CHOL的制备
将氯甲酸胆固醇酯(Cholesteryl chloroformate)(2.70g)和9mL CHCl3加入到25mL圆底烧瓶中。接着，加入于8mL DMSO中的葡甲胺(1.74g)和三乙胺(240μm)。将混合物在室温下搅拌12小时。通过TLC和HPLC监测反应。然后将混合物倒入水中。将沉淀物过滤并用水洗涤以得到呈无色固体的粗MEGA-CHOL。通过在硅胶上的柱色谱法使用甲醇和氯仿(1:2v/v)纯化粗产物。产物通过薄层色谱法分析并且具有0.50的Rf(甲醇:氯仿，1:2，v/v)。另外，通过1H NMR(CDCl3)表征所述产物，并且显示出下列峰：0.68(s,2H,HC)；0.88-1.12(m,12H,-CH3)；1.27(s,1H,HC(环))；1.63(m,12H,-CH2(侧链))；1.88-2.01(m,3H,HC(环))；2.35(m,2H,HC(环))；2.62(s,7H,葡甲胺H)；2.97(s,2H,CH2),3.82(m,6H,葡甲胺H)；4.48(s,1H,H-C-C-O)；5.39(s,1H,,H-C＝C)。最终，也通过HPLC(使用Thermo Finnigan Surveyor HPLC系统)分析所述产物。
方案5.BTZ-MEGA-CHOL的结构和合成。
BTZ-MEGA-CHOL的制备
通过将BTZ与MEGA-CHOL在叔丁醇中在室温下合并，并冻干混合物制备BTZ-MEGA-CHOL。1H NMR(CDCl3)：0.68(s,6H,HC)；0.88-1.12(m,30H,-CH3)；1.26-1.48(s,14H(烷基BTZ))；1.61(m,10H,-CH2(侧链))；1.84-2.43(m,10H,HC(环))；2.62(s,7H,葡甲胺H)；2.97(s,4H,CH2)，3.20(s,2H,BTZ苯环缀合的CH2)，3.80-3.96(m,10H,葡甲胺H)；4.45(s,1H,H-C-C-O)；5.37(s,1H,,H-C＝C)，7.20(m,5H,苯环，被CHCl3溶剂峰重叠)；8.54-9.35(s,3H,BTZ吡嗪环)。
另选地，BTZ-MEGA-CHOL在氯仿中使用2x过量的MEGA-CHOL在室温下合成，并且以连续工艺掺入脂质体中。对于所述连续工艺，BTZ和MEGA-CHOL以1:2的摩尔比溶解在氯仿中并在室温下孵育过夜。所得复合物BTZ-MEGA-CHOL以50mg/ml溶解在氯仿中，所述氯仿具有氢化L-α-磷脂酰胆碱(大豆PC；HSPC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)缀合的聚乙二醇(PEG2000)(PEG2000-DSPE)(摩尔比20:40:36:4)。使用旋转蒸发在圆底烧瓶中形成干燥的脂质膜，然后另外通过真空干燥2小时。使用含有50mM乙酸钠和10mM甘氨酸的缓冲液在pH 8下以50mg/ml的脂质浓度水合所述膜。然后施加超声处理以减少粒径至200nm或更小。接着，将样品装载到Sepharose CL-4B柱上以去除游离BTZ。收集含有L-BTZ的级分，并加入10％蔗糖。随后将所述产物通过0.22μm膜过滤器过滤并冻干。
如上所述，通过UV-vis研究药物的包封效率。具体地，将冻干的前药BTZ-MEGA-CHOL在ddH2O中复溶并装载到Sepharose CL-4B柱上，并且以每级分1mL收集洗脱液。通过UV-vis分光光度法分析每种级分。图4显示了BTZ-MEGA-CHOL的归一化结果(例如，Y轴是减去对照的吸光度值后每个级分的吸光度)。获得了80.11％的药物包埋效率。
冻干的BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂的评估
评估冻干的BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂的胶体稳定性。将冻干的BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂储存在室温下并且随时间监测。在28周期间以不同的时间间隔，将冻干的BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂重新水合，并且如上所述测量粒径。结果在图5中绘出。所示的结果为3个独立实验的平均值，并且误差条代表标准偏差。
也通过低温透射电子显微术(Cryo-TEM)评价冻干的BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂。将含有冻干的包括BTZ-MEGA-CHOL的脂质体的一滴样品在恒定的湿度和25℃的温度下加入到受控环境玻璃化系统中的每个辉光放电多孔碳/弗姆瓦膜包覆的网格中。将样品吸干后，并且通过立即浸入到液体乙烷浆浴中将样品玻璃化。制备的网格储存在液氮温度下直到转移至在-172℃下操作的Gatan低温支架(cryo-holder)，并且以低剂量模式使用配备有bioTWIN光学器件的FEI Tecnai G2Spirit TEM在120kV下操作成像。使用配备有后置的柱状Gatan能量滤镜(GIF)的Gatan CeD相机以(0)角度记录图像。冻干的包括BTZ-MEGA-CHOL的脂质体的低温TEM显微照片示于图6。如可看到的，所述脂质体具有球形结构并且大多数是单层的。另外，所述脂质体的粒径大多小于100nm。
BTZ-MEGA-CHOL的细胞毒性
细胞存活力研究在SUB6细胞(图7)和K562细胞(图8)上使用BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂执行。白血病SUB6和K562细胞使用稀浓度的BTZ(VELCADE)或BTZ-MEGA-CHOL脂质体制剂在0.05-5000nM范围下处理48小时。使用MTS测定测量细胞毒性。图7和8所示的结果为4个重复的平均值，并且误差条代表标准偏差。结果表明，脂质体BTZ针对白血病细胞有活性，但是比BTZ游离药物的细胞毒性更小。这正是预期的，因为BTZ由于细胞吸收需要从脂质体中释放出来。由于它们长得多的循环半衰期，脂质体在体内预期会比游离药物更有活性。
BTZ-MEGA-CHOL的活性的体内研究
也使用动物研究研究BTZ-MEGA-CHOL的治疗活性。使用5x 105MV4-11AML细胞注射NSG小鼠。将小鼠分成两组，每组10只(试验I)，并且用空脂质体或BTZ-MEGA-CHOL的脂质体制剂以1mg/kg通过尾静脉注射处理小鼠，每周两次。以每组5只小鼠重复一次研究(试验II)。试验I中处理4周后处死每组的三只小鼠用于进一步分析。
两个试验均显示小鼠存活显著增加。对于试验I，p值为0.0007(图9)。对于试验II，p值为0.0019(图10)。当数据集被视为组合时，p值<0.0001并且对于空脂质体处理组(对照)的小鼠的中位存活期为28天，并且对于BTZ-MEGA-CHOL处理组的小鼠的中位存活期为39天(图11)。这些数据共同指示BTZ-MEGA-CHOL的强效治疗活性。
向6-8周龄的NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ,The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)中通过尾静脉静脉内(i.v.)注射0.3X 106适应的MV4-11细胞。给予4周的空脂质体和L-BTZ，然后处死。在本研究中，分析每组3只小鼠。通过组织染色分析两组小鼠的外周血中的白血病母细胞。另外，评估小鼠的脾尺寸和重量。使用Wright-Giemsa染色两组的血液涂片，并且在显微镜下可以观察到白血病母细胞。L-BTZ处理组的脾尺寸有显著的不同(图12)。与空脂质体处理组相比，有极少的母细胞并且脾较小(图13)。
药物释放研究
通过在37℃下在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中监测脂质体中药物含量随时间的变化来确定BTZ从BTZ前药中释放的速率。由18mL的PBS在37℃下连续搅拌稀释L-BTZ(2ml)。以不同的时间间隔，取出1mL样品用于分析。通过将1mL L-BTZ混合物装载穿过10mLSepharose CL-4B柱(以每级分1mL用水平衡)，来完成L-BTZ从游离BTZ中的分离。然后用9x甲醇萃取每种级分。适当的混合后，在UV分光光度计下在OD 270nm下测量每种级分的BTZ的浓度。在实验开始时L-BTZ已经释放了20％的BTZ。数据(图14)表明，在pH 7.4和37℃下，BTZ缓慢从脂质体中释放，并且在测试条件下在40％的游离BTZ下达到新的平衡。因此可以得出结论，L-BTZ应该在pH 8下在水中复溶用于注射，并且在复溶8小时内使用并储存在环境温度或4℃下。
药代动力学研究
L-BTZ的药代动力学在ICR小鼠中进行了研究(Charles River Lab,Wilmington,MA)。也确定了游离BTZ的PK特征。经由尾静脉给予小鼠1.0mg/kg体重的游离BTZ或L-BTZ的静脉内注射液。以选定的时间间隔，使用含肝素的管从每只小鼠中收集最少100μL血浆。然后通过以3000x g离心5分钟分离血浆。通过使用电感耦合等离子体-发射光谱仪(ICP-OES)测量硼浓度来确定血浆中的药物浓度。硼萃取和样品制备先前已经描述。血浆浓度相对于时间的曲线图示于图15中。使用WinNonlin软件和二室模型计算游离BTZ和L-BTZ的药代动力学参数，并示于表1中。
表1.i.v.施用后血浆中游离BTZ和L-BTZ的药代动力学参数。数值呈现为平均值±SD(n＝3)。
a相对于游离BTZ有统计显著性(p<0.05)。
鲎变形细胞裂解物(LAL)测定
使用标准LAL测定评估L-BTZ。LAL测定的结果包括在下表2中。
表2.LAL测定的结果。
由琼脂平板测试未检测到微生物污染。测量的内毒素水平超出合适的内毒素极限30-60倍。
流体动力学尺寸和ζ电位
在使用两种不同的分散介质(10mM NaCl和PBS缓冲液)100和1000倍稀释后使用动态光散射(低体积石英比色皿，b＝10mm，25℃，633nm激光，173°散射角)测量L-BTZ制剂中的脂质体的流体动力学尺寸。结果在以下表3中示出。
表3.在使用两种不同的分散介质(10mM NaCl和PBS缓冲液)100和1000倍稀释后动态光散射分析L-BTZ制剂。结果基于12次测量的平均值。
这些发现表明，脂质体的粒径基于稀释或分散介质没有显著变化。
也测量了L-BTZ制剂中的脂质体的ζ电位。将L-BTZ的样品用10mMNaCl稀释100倍。然后在25℃和pH 7.5下测量表观ζ电位。脂质体具有-16.1±0.3mV的负ζ电位值。
实施例6.BTZ-MEGA-CHOL(50mg API BTZ)的中等规模制备方案
开发了简单的方案以在更大规模上(例如，在50mg API BTZ规模上)制备BTZ-MEGA-CHOL。
胆固醇-葡甲胺缀合物(MEGA-CHOL)的合成
在25mL圆底烧瓶中，将氯甲酸胆固醇酯(351mg)溶解在9mL CHCl3中。接着，加入8mL DMSO中的葡甲胺(102mg)和三乙胺(73μl)。将混合物在室温下搅拌12小时。通过TLC和HPLC监测反应。将混合物倒入纯水中。通过0.1N HCl洗涤沉淀物以得到白色粗产物。通过在硅胶上的柱色谱法使用甲醇和氯仿(1:2v/v)纯化该粗产物。Rf0.50(甲醇/氯仿，1:2，v/v)。
脂质-药物异丙醇溶液的制备
将BTZ和MEGA-CHOL(摩尔比1:2)溶解在异丙醇中并反应两小时。然后向溶液中加入DSPC、胆固醇和PEG-DSPE直到它们完全溶解。然后将该溶液稀释进10体积的20mM磷酸盐缓冲液(pH＝8)中以形成L-BTZ脂质体。
均质化工艺
将上述的L-BTZ悬浮液在高压均质器(Avestin Emulsiflex C5)上在10,000psi下连续工艺处理，以将平均粒径降至低于100nm。然后将L-BTZ通过0.45μm过滤器过滤以在切向流渗滤(TFF)之前去除任何不溶性的微粒。
TFF工艺
将过滤的L-BTZ加入到TFF系统(具有Midikros中空纤维滤筒的Millipore Labscale TFF泵系统)，并且使用5mM磷酸盐缓冲液(pH＝8)以5体积置换洗涤L-BTZ，以去除异丙醇和游离BTZ药物并浓缩L-BTZ产物。
最终脂质体制剂的制备
TFF后向脂质体中加入10％的蔗糖(冷冻保护剂)。在生物安全柜中将L-BTZ终产物通过0.22μm PES膜过滤，并转移至高压消毒的玻璃小瓶和盖子中。随后将所述产物储存于-70℃下直至使用。
随附权利要求书的材料和方法的范围不受限于本文中描述的特定材料和方法，所述材料和方法意图作为权利要求书的几个方面的说明，并且功能等效的任何材料和方法都在本公开的范围内。除了本文中示出和描述的材料和方法之外，材料和方法的各种修改意在落入随附权利要求书的范围内。此外，虽然仅特定描述了某些代表性材料、方法以及这些材料和方法的方面，但是其他材料和方法以及材料和方法的各种特征的组合意在落入随附权利要求书的范围内，即使不特定地叙述也是如此。因此，本文中可以明确地提到步骤、要素、组分或成分的组合；然而，即使不明确说明，也包括步骤、要素、组分和成分的所有其他组合。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！