一种地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及酶工程和基因工程领域，具体是一种地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶突变体。

背景技术：

地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）耐高温α-淀粉酶BLA耐高温、活力高，能随机水解淀粉、糖原及其降解物内部的α-1.4葡萄糖苷健使得胶状淀粉溶液的粘度迅速下降，在喷射液化工艺中瞬间温度达105-110℃，仍能有效水解淀粉且液化淀粉完全获得的液化糖浆品质优，被广泛应用于酒精、啤酒、有机酸及淀粉制糖等食品发酵工业的淀粉液化工艺中，也是目前使用最广泛的高温α-淀粉酶。但其缺点也比较明显，虽然能快速水解淀粉浆使其粘度迅速下降，但是水解产物主要是可溶性糊精和寡聚糖，虽然过度水解可以产生葡萄糖和麦芽糖，但是含量较少，过度水解产生的葡萄糖大约为30%左右，所以在葡萄糖生产过程中使用高温α-淀粉酶液化淀粉后还要使用糖化酶来进一步水解获得更多的葡萄糖。

目前，酒精、啤酒，淀粉糖等工业都需要大量使用耐高温α-淀粉酶对淀粉原料进行液化，然后再用来自真菌的糖化酶进行糖化以提高葡萄糖的含量，得到糖浆然后用于后面的发酵或者制糖。生产不同的产品对糖浆成分的组成及其含量要求也不同，例如，酒精发酵工业是使用酵母对糖浆进行发酵，酵母通过无氧呼吸途径利用葡萄糖生产酒精，所以糖浆中葡萄糖的含量高相对的发酵效果越好。淀粉制糖工业对糖浆组分的要求更加严格，生产葡萄糖和果糖要求糖浆中葡萄糖含量达到90%以上，所以，低成本生产各式糖浆以满足制糖工业的需求对制糖工业贡献是巨大的。

目前，工业上生产高转化葡萄糖浆采用的是双酶法，用耐高温α-淀粉酶将淀粉浆液化获得低DE值得糖浆后再添加大量的糖化酶糖化。由于耐高温α-淀粉酶液化淀粉得到的糖浆中主要成分是糊精和寡聚糖，葡萄糖含量通常只有30％，所以，在制糖生产中淀粉用耐高温α-淀粉酶液化后还需加大量的糖化酶并延长糖化时间才能获得高转化葡萄糖浆，这就使得生产成本增加，效益降低。用于葡萄糖生产的耐高温α-淀粉酶希望是水解淀粉的产物中大分子量寡糖少，葡萄糖含量多，这样可以减少糖化酶的使用，所以寻找新型的淀粉酶开发更低成本的葡萄糖生产工艺，特别是寻找到能直接水解淀粉产生大量葡萄糖的淀粉酶是本领域的研究热点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶突变体的基因及其应用。

本发明人在对地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶研究中，通过对其蛋白结晶三维结构的比较分析，选择BLA的底物结合位点进行饱和定点突变获得大量的突变酶，然后对这些突变酶在水解淀粉的特性方面进行比较分析，筛选得到能水解淀粉产生高葡萄糖含量水解产物的新型耐高温α-淀粉酶。

本发明的技术方案是：一种地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）高温α-淀粉酶突变体E189I基因，其突变前的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）高温α-淀粉酶突变体E189I基因，该突变体基因所编码的α-淀粉酶蛋白质，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

所述的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）高温α-淀粉酶突变体E189I基因所编码的α-淀粉酶蛋白质在水解淀粉中的应用。

本发明与现有技术相比，具有实质性特点和显著的优势：

1．和目前使用最广泛的耐高温α-淀粉酶BLA相比，BLA水解淀粉的产物主要极限糊

精和寡糖，要想获得更高含量的葡萄糖水解产物需要用来自真菌的糖化酶进一步糖化水解糊精和寡糖来获得葡萄糖，而糖化酶的价格远高于来自细菌的高温α-淀粉酶BLA，这就增加了淀粉水解糖化的生产成本，而本发明的高温α-淀粉酶能够水解淀粉就获得更高含量的葡萄糖，可达到72％的葡萄糖含量，同时麦芽糖等寡糖含量更少，因而在水解淀粉生产葡萄糖中具有一定优势，可以减少糖化酶的使用，从而降低生产成本。

2．和原始酶BLA相比，本发明的高温α-淀粉酶仍然保留耐高温的酶学特性，因而能够直接应用于现有淀粉生产葡萄糖的液化工艺，其水解淀粉12小时后水解产物中的葡萄糖含量达到72％以上，高于原始酶的33％，从而能够减少糖化酶的使用。

附图说明

图1 是温度对酶水解淀粉活力的影响的曲线图。

图2 是pH对酶水解淀粉活力的影响的曲线图。

图3 是酶水解淀粉DE变化曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

1．突变酶的构建

通过对地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶BLA蛋白质的3D结构分析，确定其底物结合位点，然后利用PCR定点饱和突变技术来研究该位点不同氨基酸残基对酶水解淀粉的影响，从而筛选得到水解淀粉葡萄糖含量高的突变酶。本发明是经过对许多位点的预测分析，并对获得的多个候选位点进行突变研究和筛选比较才获得的，本发明所述的实施方法仅仅是对获得本发明突变酶实验过程的描述，而不包括对其它候选位点的突变实验过程的陈述。PCR定点饱和突变技术、基因表达技术和重组蛋白质的纯化技术，本实施方案中未作详细说明的分子生物学实验方法均为分子生物学专业人员熟悉的常规实验方法。

2．基因表达及酶制备

将突变酶的重组载体转化进大肠杆菌菌株中进行诱导表达，经镍柱纯化得到目的重组蛋白，经SDS-PAGE电泳得到单一目的条带后就可以进行酶学性质分析。

3．酶的最适反应温度分析

取10 μL适当稀释的纯酶加入190 μL的1%可溶性淀粉溶液（pH7.0）分别在50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃、95℃温度下进行酶活力测定，以反应结果中最高酶活力为100%绘制温度对酶活力的影响曲线，结果如图1。结果表明突变体E189I和原始酶BLA最适温度为都是90℃，在40℃到90℃之间，酶活随着温度的增加而增加，95℃后酶活开始下降但是仍然有80%以上的活力，两者没有明显的差异，突变体E189I仍保留了耐高温的特性。

4．用不同的pH缓冲液稀释纯化的酶液，从pH4.0-8.0，进行酶活测定，取10 μL适当稀释的纯酶液加入190 μL 1%可溶性淀粉溶液在90℃最适温度下测定酶活力，以反应结果中最高酶活力为100%绘制pH对酶活力的影响曲线，结果如图2。图2结果表明突变体E189I和原始酶BLA的最适反应pH都是6.5，pH5.0~pH8.0具有60%以上的酶活，两者没有明显的差异。

5．水解淀粉产物成分的比较分析

还原糖（以葡萄糖计）占糖浆干物质的百分比(Dextrose Equivalent)即DE值，工业上用DE值（也称葡萄糖值）表示淀粉的水解程度或糖化程度。在90℃水浴条件下，分别加入总酶活力一致的突变体E189I和原始酶BLA纯酶液于已预热的5 ml 2%可溶性淀粉中。每隔5 min取反应液10 μl，补足灭菌水至200 μl，加入400 μl DNS试剂后煮沸。测定反应液中还原糖含量，计算得到产物中总还原糖量占底物干重百分比（DE值），水解曲线如图3所示，从两个淀粉酶的曲线呈上升趋势表明突变体E189I的水解淀粉能力明显高于野生酶。

6．为了比较突变体E189I和原始酶BLA水解淀粉的能力和水解产物组成，将相同蛋白含量的突变体E189I和原始酶BLA加入含有2%（w/v）可溶性淀粉底物的MOPS-NaOH缓冲液（pH7.0, 1 mM CaCl2）中，70℃水浴反应12 h和36 h后，通过HPLC检测反应产物。其水解淀粉的产物百分比见表1，结果表明反应12h后突变体E189I水解淀粉产物中葡萄糖含量就能够达到最大值了，葡萄糖含量达到72%以上，高于原始酶BLA，随着反应时间的增加到36h，原始酶BLA葡萄糖含量提高到44%以上，但仍然低于突变体E189I的葡萄糖含量，这进一步说明突变体E189I水解淀粉产物中葡萄糖含量高于BLA。

表1 突变酶E189I和原始酶BLA水解淀粉产物比较