聚合物微球功能化氧化石墨烯的合成方法及其催化降解有机磷的应用与流程

本发明属于有机磷化合物的降解技术领域，具体涉及一种聚合物微球功能化氧化石墨烯的合成方法及其催化降解有机磷的应用。

背景技术：

有机磷酸酯化合物常被广泛的应用于杀虫剂、增塑剂、石油添加剂和化学战争毒剂，尤其是有机磷酸三酯，如对氧磷、对硫磷、马拉硫磷等，通常作为农作物保护剂应用于农业领域。但是这些物质具有潜在的毒性，可引起神经性休克、麻痹、休克和死亡。在化学战争中用作神经毒气的化合物，如沙林、塔崩和梭曼，也属于有机磷酸酯。这些化合物抑制参与神经信号的关键酶——乙酰胆碱酯酶，进而引起神经性疾病。因此，这些有机磷酸酯化合物的降解在世界范围内是一个重要的挑战，并且许多研究已在努力解决这一重要的问题。

目前，研究较为广泛的降解有机磷酸酯的方法为酶促水解。尽管天然有机磷水解酶能高效降解有机磷，但是其稳定性较差，并且不易制备，应用受到很大的限制。因此，依据天然有机磷水解酶的结构及其降解有机磷机理，设计合成稳定、高效、价廉的有机磷水解模拟酶是科研工作者的不懈追求。

天然分离得到的有机磷水解酶是二聚体，每个单体C末端有相同的活性位点，每个活性中心含有2个Zn²⁺(α和β)，两个锌离子之间的距离为一个Zn²⁺(α)与两个组氨酸及天冬氨酸的残基配位，另一个Zn²⁺(β)与两个组氨酸的残基配位，一个羧化的赖氨酸和水分子(或氢氧根离子)将两个锌离子桥连在一起，Zn²⁺(α)与OH^-的距离为Zn²⁺(β)与OH^-的距离为

依据天然有机磷水解模拟酶的活性中心及水解机理，发明人所在的研究小组以1-乙烯基咪唑(1-VI)为功能单体，甲基丙烯酸(MAA)为辅助功能单体，对氧磷的过渡态类似物4-硝基苄基(D4NP)为模板分子，通过分子印迹技术设计合成了具有有机磷水解模拟酶活性分子印迹聚合物微球。该方法制备的分子印迹聚合物微球的对氧磷水解酶活性与对氧磷自发水解相比，水解效率最大可提高188倍，但该方法制备过程复杂，且反应完后需要去除模板分子。

技术实现要素：

本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种操作简单，能够高效降解有机磷的聚合物微球功能化氧化石墨烯的合成方法。

本发明所要解决的另一个技术问题在于为上述方法合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯提供一种新的应用。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、氧化石墨烯接枝甲基丙烯酸羟乙酯

将氧化石墨烯酰氯化后超声分散于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入甲基丙烯酸羟乙酯，在氮气保护下滴加无水三乙胺，回流反应12～24小时，产物经甲醇离心洗涤、真空干燥，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯。

2、合成聚合物微球功能化氧化石墨烯

将乙烯基功能化的氧化石墨烯加入到乙腈与甲醇的体积比为9:1的混合液中，室温超声分散均匀，加入ZnCl₂、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、二乙烯基苯，在氮气保护下加入偶氮二异丁腈，然后在氮气保护、室温条件下，用波长为365nm的紫外光照射48～72小时，并且照射过程中间歇搅拌；照射完后离心分离，所得固体经甲醇洗涤、离心后，用ZnCl₂的甲醇溶液孵育20～40分钟，所得产物经离心分离、真空干燥，得到聚合物微球功能化氧化石墨烯。

上述步骤1中，所述氧化石墨烯与甲基丙烯酸羟乙酯、无水三乙胺的质量比为1:5～10:1.5～3，优选氧化石墨烯与甲基丙烯酸羟乙酯、无水三乙胺的质量比为1:8:2。

上述步骤2中，所述乙烯基功能化的氧化石墨烯、ZnCl₂、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、二乙烯基苯、偶氮二异丁腈的质量比为1:0.75～3:0.5～2:4～17:8.5～34:4～16，优选乙烯基功能化的氧化石墨烯、ZnCl₂、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、二乙烯基苯、偶氮二异丁腈的质量比为1:1.5:1.0:8.5:17:8。

上述聚合物微球功能化氧化石墨烯在催化降解有机磷中的应用，具体使用方法为：将聚合物微球功能化氧化石墨烯加入到待水解的有机磷溶液中，室温振荡即可催化有机磷水解，其中聚合物微球功能化氧化石墨烯的加入量根据有机磷的含量和水解量调整。

本发明以氧化石墨烯作为有机磷水解模拟酶的基质，首先将氧化石墨烯接枝甲基丙烯酸羟乙酯，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯，然后通过聚合的方法，用交联剂二乙烯基苯将1-乙烯基咪唑与乙烯基功能化的氧化石墨烯共同聚合，在聚合过程中加入ZnCl₂与1-乙烯基咪唑配位，将1-乙烯基咪唑共价接枝在乙烯基功能化的氧化石墨烯表面，得到新型有机磷水解模拟酶——聚合物微球功能化氧化石墨烯。

本发明所采用的氧化石墨烯具有稳定的机械性能、优良的亲水性、大的比表面积，最重要的是其表面及边缘含有较多含氧基团，如羟基、羧基和环氧基，可进一步功能化，并且由于氧化石墨烯富含含氧官能团，具有过氧化氢水解酶的催化活性，可以共同参与构建酶活性中心，协同1-乙烯基咪唑催化水解对氧磷。实验结果表明，在相同条件下，本发明聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基对氧磷的初速度相对于空白对照提高了230倍，其催化乙基对氧磷水解反应的最大初速度V_max为0.014mmol/L·min、米氏常数K_m为13.4mmol/L，且具有较好的重复利用率，在重复使用5次后水解活性仅下降约5.2％。本发明聚合物微球功能化氧化石墨烯在降解有机磷毒物和检测有机磷类仿生传感器的构建方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是实施例1得到的乙烯基功能化的氧化石墨烯的扫描电镜图。

图2是实施例1得到的聚合物微球功能化氧化石墨烯的扫描电镜图。

图3是对比例1得到的组氨酸功能化氧化石墨烯的扫描电镜图。

图4是氧化石墨烯(a)、组氨酸功能化氧化石墨烯(b)、乙烯基功能化的氧化石墨烯(c)、聚合物微球功能化氧化石墨烯(d)的红外光谱图。

图5是氧化石墨烯(a)、组氨酸功能化氧化石墨烯(b)、羧基化的氧化石墨烯(c)、乙烯基功能化的氧化石墨烯(d)、聚合物微球功能化氧化石墨烯(e)的拉曼光谱图。

图6是实施例1得到的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基对氧磷生成的对硝基苯酚在400nm处的紫外吸收光谱图。

图7是实施例1～3得到的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基对氧磷的动力学曲线图。

图8是空白对照组、实验组及对比组催化降解乙基对氧磷的动力学曲线图。

图9是实施例1得到的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基对氧磷的Lineweaver-Burk图。

图10是实施例1得到的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基对氧磷的重复使用效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、氧化石墨烯接枝甲基丙烯酸羟乙酯

称取200mg氧化石墨烯(购自中国科学院成都有机化学有限公司)加入100mL去离子水中，超声分散1小时，再加入12g NaOH，超声分散30分钟，然后加入10g氯乙酸，超声分散2小时，离心分离，将离心所得固体用甲醇洗涤离心3次后，在55℃下真空干燥12小时，得到羧基化的氧化石墨烯；将羧基化的氧化石墨烯加入20mL N,N-二甲基甲酰胺中，超声分散30分钟，然后加入40mL氯化亚砜，回流反应24小时，所得产物经离心分离、无水四氢呋喃洗涤3次、55℃真空干燥12小时，得到酰氯化的氧化石墨烯；将酰氯化的氧化石墨烯超声分散于20mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入1.6g甲基丙烯酸羟乙酯，在氮气保护下缓慢滴加0.4g无水三乙胺，回流反应24小时，产物经甲醇离心洗涤、55℃真空干燥12小时，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯(见图1)。

2、合成聚合物微球功能化氧化石墨烯

将50mg乙烯基功能化的氧化石墨烯加入到40mL乙腈与甲醇的体积比为9:1的混合液中，室温超声1小时，再加入0.075g ZnCl₂、0.050g甲基丙烯酸、0.425g1-乙烯基咪唑、0.850g二乙烯基苯，在氮气保护下，加入0.400g偶氮二异丁腈，然后在氮气保护、室温条件下，用波长为365nm的紫外光照射48小时，并且照射过程中间歇搅拌，照射完后离心分离，所得固体经甲醇洗涤3次后离心分离，再用8mL 100mmol/L ZnCl₂的甲醇溶液孵育30分钟，离心分离，45℃真空干燥12小时，得到聚合物微球功能化氧化石墨烯(见图2)。

对比例1

将0.1550g组氨酸溶解在5mL去离子水中，加入0.0225g ZnCl₂，室温搅拌30分钟后加入50mg氧化石墨烯，超声分散1小时，加入5mL 200mmol/L NaOH水溶液，室温搅拌反应24小时，离心分离，将离心所得固体用乙醇洗涤至溶液呈中性，然后用100mmol/L ZnCl₂的甲醇溶液孵育30分钟，离心分离，50℃真空干燥12小时，得到组氨酸功能化氧化石墨烯(见图3)。

由图1～3可见，氧化石墨烯接枝甲基丙烯酸羟乙酯后，光滑、平整的表面呈现出稠密和高度交联的形态，表明甲基丙烯酸羟乙酯有效接枝到了酰氯化的氧化石墨烯表面，进一步通过聚合的方法，用二乙烯基苯将1-乙烯基咪唑与乙烯基功能化的氧化石墨烯共同聚合，在氧化石墨烯表面形成了粒径为2～3μm的微球，并且微球分布均匀，即得到了聚合物微球功能化氧化石墨烯；而对比例1中接枝组氨酸的氧化石墨烯只是表面变得粗糙、不平整，并且厚度增加，未形成微球。

由图4可见，曲线c在1707cm^-1处的吸收峰是由于C＝C的伸缩振动引起的，而曲线d在1707cm^-1处没有峰，说明乙烯基功能化的氧化石墨烯通过双键共价接枝了1-乙烯基咪唑。同时，曲线b和曲线d在1370cm^-1处的弱吸收峰是由于C-N的伸缩振动峰。综上所述，成功合成了组氨酸功能化氧化石墨烯和聚合物微球功能化氧化石墨烯。

由图5可见，在1348cm^-1和1594cm^-1处明显有两个吸收峰，分别是D峰和G峰，D峰是由无序的sp³杂化的碳结构引起的，G峰是由sp²杂化的碳产生的有序的结晶石墨状结构引起的。氧化石墨烯、组氨酸功能化氧化石墨烯、羧基化的氧化石墨烯、乙烯基功能化的氧化石墨烯和聚合物微球功能化氧化石墨烯的拉曼光谱峰强度比例I_(D)/I_(G)分别为0.593、0.602、0.709、0.925、0.729。一般而言，碳材料的无序程度即sp³杂化的碳随I_(D)/I_(G)增加而增加，这进一步说明了成功合成了乙烯基功能化的氧化石墨烯，而聚合物微球功能化氧化石墨烯的I_(D)/I_(G)反而降低，是由于聚合物均匀接枝在氧化石墨烯表面，遮盖了碳信号。

实施例2

在实施例1的步骤2中，将乙烯基功能化的氧化石墨烯用量减少至25mg，其他步骤与实施例1相同，得到聚合物微球功能化氧化石墨烯。

实施例3

在实施例1的步骤2中，将乙烯基功能化的氧化石墨烯用量增加至100mg，其他步骤与实施例1相同，得到聚合物微球功能化氧化石墨烯。

实施例4

实施例1～3合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯在催化降解乙基对氧磷中的应用

将2mg聚合物微球功能化氧化石墨烯分散在100μL乙腈中，加入875μL20mmol/L pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液，超声分散30分钟，然后加入25μL100mmol/L乙基对氧磷乙腈溶液，在30℃振荡，分别在不同的时刻取50μL反应液，用450μL去离子水稀释，离心，取上清液450μL，用紫外可见分光光度计检测400nm处对硝基酚的吸收峰。实验结果见图6和7。

由图6和7可见，实施例1～3合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解的活性均较高，随着时间的延长，乙基对氧磷的水解量在快速增加，表明本发明聚合物微球功能化氧化石墨烯能够有效地催化乙基对氧磷水解反应，其中实施例1合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯的活性最高。

为了证明本发明的有益效果，发明人按照实施例4的方法，将实施例1合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯(实验组)与对比例1得到的组氨酸功能化氧化石墨烯(对比组)催化降解乙基对氧磷的活性进行比较，同时做空白对照试验，结果见图8。由图可见，在相同条件下，对比例1得到的组氨酸功能化氧化石墨烯催化降解乙基对氧磷的活性很差，与空白对照组相差不大，而实施例1合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基对氧磷的初速度相对于空白对照组提高了230倍。说明本发明合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯能够高效催化降解有机磷。

为了研究聚合物微球功能化氧化石墨烯水解乙基对氧磷的动力学参数，发明人将2.0mg聚合物微球功能化氧化石墨烯分散到20mmol/L pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液中，然后加入不同体积的100mmol/L乙基对氧磷乙腈溶液，使反应体系的总体积为1mL，乙基对氧磷的最终浓度分别为1.0、1.25、1.65、2.5、5.0和7.5mmol/L，在30℃下振荡，分别在0.5、2.5、5、7.5、10、15、20、30、40、50、60分钟时取50μL混合液，用450μL水将之稀释，离心(10000rpm，1min)，取450μL上清液于比色皿中，然后测定对硝基苯酚在400nm处的吸光度。

以Michaelis-Menten酶动力学模型来评价聚合物的催化水解活性。米氏动力学方程式：V₀＝V_max[S]/(K_m+[S])，V₀表示反应的初速度，V_max表示反应的最大初速度，[S]表示底物浓度，K_m是米氏常数，表示底物与酶的亲和力，K_m值越小，亲和力越高，反之，K_m值越大，亲和力越低。为了测定V_max与K_m的值，乙基对氧磷的浓度范围被确定为1.0～7.5mmol/L。在pH＝9.0，聚合物微球功能化氧化石墨烯浓度为2.0mg/mL条件下，测定聚合物微球功能化氧化石墨烯对不同浓度乙基对氧磷催化水解的紫外可见吸收光谱，从而可得乙基对氧磷水解反应的初始速度V₀，以反应初速度的倒数1/V₀和底物浓度的倒数1/[S]作图，可得Lineweaver-Burk曲线，如图9。从图9中曲线的截距和斜率可得V_max为0.014mmol/L·min，K_m为13.4mmol/L。

为了研究聚合物微球功能化氧化石墨烯水解乙基对氧磷的重复使用效果，发明人将2mg聚合物微球功能化氧化石墨烯分散在100μL乙腈中，加入875μL20mmol/LpH＝9.0的Tris-HCl缓冲液，超声分散30分钟，然后加入25μL100mmol/L乙基对氧磷乙腈溶液，在30℃振荡，反应5小时后取50μL反应液，用450μL去离子水稀释，离心，取上清液450μL，用紫外可见分光光度计检测400nm处对硝基酚的吸收峰。并将离心所得固体用乙腈和乙醇分别洗涤后，在100mmol/L ZnCl₂甲醇溶液中孵育30分钟，离心分离，45℃真空干燥12小时，所得固体再重复使用，共重复5次。重复使用效果见图10。由图可见，本发明合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯在重复使用时依旧保持较好的降解催化乙基对氧磷活性，使用第5次后降解催化活性仅下降约5.2％，说明本发明合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯可以再生，并且仍保持较好的对氧磷的降解催化活性。