多肽和植物乳杆菌胞外代谢产物及它们的应用及诱导植物乳杆菌产细菌素的方法和鉴定方法与流程

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种多肽、一种植物乳杆菌的胞外代谢产物，所述多肽和/或所述植物乳杆菌的胞外代谢产物在诱导植物乳杆菌产生细菌素中的应用，以及一种诱导植物乳杆菌产生细菌素的方法。
背景技术：
：近几十年来，随着抗生素药物的广泛使用，引起机体内越来越多的常规微生物有机转变为条件致病菌，引起人们多种不必要的疾病，于是，人们迫切需要一种新型的、天然的物质成为抑菌药物或者化学防腐的替代品。细菌素作为一种天然、无副作用、强效的抑菌类物质，被广泛关注，并被认为是一种有潜力的抗菌类药物与防腐剂的替代品。目前研究比较深入的细菌素的防腐剂有乳酸链球菌素(Nisin)、纳他霉素、溶菌酶等。乳酸菌是一类能够发酵糖类，且乳酸是主要或唯一发酵产物的革兰氏阳性无芽孢细菌的总称。大量研究结果表明，乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、抑制肠道致病菌定植、提高机体免疫力、改善机体营养状况等作用，因而在多个领域被广泛应用。乳酸菌素是乳酸菌的次级代谢产物，被检测认定为一类对动物无毒性、无抗原性、热稳定性好的多肽类物质，能够被人体消化道中的蛋白酶所降解，不会引起不良反应，是一类天然安全的防腐剂。由于Ⅱa类乳酸菌素对致病菌有高效的抑菌活性的特性，研究工作者认为细菌素以及产细菌素的菌株有望成为潜在的食品天然防腐剂。然而受细菌素自身特性的限制，使得这些菌株以及所产细菌素在工业应用以及在食品加工过程中条件都受到较多的置疑。基于此，天然细菌素的应用一直处于原地。另一方面细菌素合成的影响受许多因素的影响，其中认为最重要的是pH、培养温度、培养基的体系成分等，而且有时最适合细胞生长的条件并不总是产生最多的细菌素。有许多的研究表明最高细菌素的获得常常是在低于最适菌株生长条件的pH值与生长温度。在一些情况，培养基中的高浓度NaCl，以及某些应急反应都会刺激产生细菌素。因此，亟需寻找一种能够高效诱导乳酸菌产生细菌素的物质以及方法。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术中的以上缺陷，提供一种能够诱导植物乳杆菌产生细菌素的多肽和/或植物乳杆菌的胞外代谢产物，所述多肽和/或植物乳杆菌的胞外代谢产物在诱导植物乳杆菌产生细菌素中的应用，以及一种诱导植物乳杆菌产生细菌素的方法。为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1(KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC)所示。第二方面，本发明提供了一种植物乳杆菌的胞外代谢产物，其中，所述植物乳杆菌的胞外代谢产物含有如上所述的多肽。第三方面，本发明还提供了如上所述的植物乳杆菌的胞外代谢产物的制备方法，该方法包括：(1)将植物乳杆菌的发酵产物进行固液分离，得到发酵上清液；(2)在所述发酵上清液中加入硫酸铵进行盐析，得到沉淀物，并将得到的沉淀物溶于水中；(3)对步骤(2)得到的溶液依次进行透析、离子交换以及萃取，从而得到所述植物乳杆菌的胞外代谢产物。优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)，更优选为保藏号CGMCCNo.6936的植物乳杆菌植物亚种。优选的，步骤(3)中，所述透析的条件包括：截留分子量为3000-4000Da，温度为2-6℃，时间为8-15小时。优选的，步骤(3)中，使用阳离子交换树脂进行所述离子交换层析，所述离子交换层析的条件包括：平衡缓冲液为含有3-4g/L柠檬酸和1-2g/L柠檬酸钠(例如，柠檬酸三钠)的混合溶液；洗脱液为1.5-2.5mol/L的氯化钠溶液，0-100体积％的所述洗脱液的梯度洗脱；洗脱流速为0.8-1.2mL/min，洗脱时间为30-130min。优选的，步骤(3)中，所述萃取通过C18柱进行，所述萃取的步骤包括：先通过超纯水将样品载入C18柱中，然后通过65-75体积％的乙腈收集样品。第四方面，本发明还提供了如上所述的多肽和/或如上所述的植物乳杆菌的胞外代谢产物在诱导植物乳杆菌产生细菌素中的应用。第五方面，本发明还提供了一种诱导植物乳杆菌产生细菌素的方法，该方法包括：在对所述植物乳杆菌进行培养的过程中，优选在所述植物乳杆菌培养的对数期，向培养液中加入如上所述的多肽和/或如上所述的植物乳杆菌的胞外代谢产物。第六方面，本发明还提供了脱脂乳培养基在鉴定产生细菌素的植物乳杆菌中的应用。通过上述技术方案，将如上所述的多肽和/或如上所述的植物乳杆菌的胞外代谢产物用在培养所述植物乳杆菌的过程中，尤其是对数期，特别是在对数前期，能够有效诱导植物乳杆菌表达细菌素，并且如测试例3中所示的，植物乳杆菌基因中的papA、papB、papC、papD四个与细菌素产生相关的基因的表达水平分别上调了9.41倍，6.75倍，7.94倍及6.63倍。这说明添加如上所述的多肽和/或如上所述的植物乳杆菌的胞外代谢产物能够诱导植物乳杆菌菌株基因中相关基因的表达，从而提高细菌素的产生。本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物菌种公开信息本发明使用的保藏号CGMCCNo.6936的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL已于2012年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。并于2014年12月25日进行了专利申请，2015年4月29日公开，专利申请号为201410816266.3。在此通过全文援引的方式将该专利申请的内容合并于此。附图说明附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为经和未经植物乳杆菌CGMCCNo.6936的胞外代谢产物诱导的植物乳杆菌CGMCCNo.6936发酵上清液的抑菌实验结果(抑菌圈)。其中，图1A为添加了植物乳杆菌CGMCCNo.6936的胞外代谢产物的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果；图1B为添加了本发明的多肽的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果；图1C为未添加植物乳杆菌CGMCCNo.6936的胞外代谢产物的液体脱脂乳培养基的培养物的抑菌效果。图2为经和未经植物乳杆菌CGMCCNo.6936的胞外代谢产物诱导的植物乳杆菌CGMCCNo.6936发酵上清液的抑菌实验结果(生长曲线)。其中，图1A为添加了植物乳杆菌CGMCCNo.6936的胞外代谢产物的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果；图1B为添加了本发明的多肽的液体脱脂乳培养基培养物的抑菌效果。图3为植物乳杆菌CGMCCNo.6936的胞外代谢产物诱导CGMCCNo.6936菌株相关基因表达量变化图，其中A为添加了植物乳杆菌CGMCCNo.6936的胞外代谢产物的液体脱脂乳培养基培养物的基因相对表达变化量；B为未添加植物乳杆菌CGMCCNo.6936的胞外代谢产物的液体脱脂乳培养基的培养物的基因相对表达变化量。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。第一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。根据本发明，如上所述的多肽可以通过任意的方法获得，例如，可以委托生物公司进行合成，也可以自行合成，还可以通过特定的手段进行分离，或根据其氨基酸序列从包括有所述多肽序列的较长氨基酸序列中进行截取。第二方面，本发明公开了一种植物乳杆菌的胞外代谢产物，其中，所述植物乳杆菌的胞外代谢产物含有如上所述的多肽。根据本发明，含有如上所述多肽的植物乳杆菌的胞外代谢产物可以为将植入乳杆菌的发酵产物进行固液分离后的上清液，也可以为通过一定的纯化手段进行纯化后的产物。本申请所述的植物乳杆菌的胞外代谢产物优选为经过纯化后的产物。由此，第三方面，本发明还提供了一种含有如上所述多肽的植物乳杆菌的胞外代谢产物的制备方法，该方法包括：(1)将植物乳杆菌的发酵产物进行固液分离，得到发酵上清液；(2)在所述发酵上清液中加入硫酸铵进行盐析，得到沉淀物，并将得到的沉淀物溶于水中；(3)对步骤(2)得到的溶液依次进行透析、离子交换以及萃取，从而得到所述植物乳杆菌的胞外代谢产物。根据本发明，步骤(1)中，所述植物乳杆菌的培养方法可以采用本领域常规的乳酸菌培养方法，例如，可以在MRS培养基中于33-40℃下进行厌氧培养，也可以具体参照专利申请201410816266.3中的培养方法，本发明对此并没有过多的限制。根据本发明，所述植物乳杆菌优选为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)，更优选为保藏号CGMCCNo.6936的植物乳杆菌植物亚种。当采用保藏号CGMCCNo.6936的植物乳杆菌植物亚种时，所制备出的植物乳杆菌的胞外代谢产物能够更有效的促进植物乳杆菌产生细菌素。根据本发明，对培养后的发酵产物进行固液分离的方法为本领域常规的选择，例如，可以通过离心的方法，也可以通过过滤的方法，本领域技术人员可以根据实际需求进行具体的选择。本发明优选采用离心的方法，例如，将培养结束(一般培养20-30小时)后的发酵产物于2-6℃下以5000-12000rpm的转速进行离心分离20-40min，得到发酵上清液。步骤(2)中，术语“盐析”一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。能够理解的是，就本申请而言，由于本申请欲制备含有SEQIDNO：1所示的多肽的植物乳杆菌的胞外代谢产物，所以所述“盐析”指的是加(NH4)2SO4使蛋白质凝聚的过程。所述硫酸铵的加入量可以为常规的对蛋白质进行盐析的量。优选的，本发明中所述硫酸铵的加入量使得硫酸铵的最终饱和度为60-75％，更优选为65-72％。根据本发明，为了进一步保证蛋白质的活性以及完整性，所述盐析过程优选在低温(2-6℃)的条件下进行。此外，进一步优选的，所述硫酸铵在搅拌的条件下加入，直至达到预期的饱和度。所述搅拌可以为人工搅拌，可以通过磁力搅拌器搅拌，本发明对此并没有过多的限制。根据本发明，待达到预期的饱和度后，优选在低温(2-6℃)的条件下将其静置18-30小时以充分对目标产物进行沉淀。此外，沉淀结束后，优选通过离心的方法对沉淀物进行收集，所述离心的条件，例如可以为在2-6℃下以5000-12000rpm的转速离心分离20-40min。离心结束后使用水对沉淀物进行复溶以便进行下一步纯化，所述水可以为能够溶解沉淀物的任何水或水溶液，例如，可以为去离子水。为了进一步去除杂质，本发明还优选通过再次离心的方法对所述沉淀物的水溶液进行进一步纯化，所述离心的条件，例如可以为2-6℃下5000-12000rpm的转速离心分离20-40min，离心后弃去沉淀物，保留上清液。步骤(3)中，为了能够更为有效获得本发明的多肽，所述透析过程中使用的透析袋的截留分子量优选为3000-4000Da，更优选为3200-3800Da。在优选的情况下，在透析如上步骤(2)所得到的沉淀物水溶液之前，将所述透析袋在温水(40-60℃)中浸泡20-40min以进行前处理。其中，优选的，所述透析的条件包括：截留分子量为3000-4000Da，温度为2-6℃，时间为8-15小时。另外，所述透析在搅拌的条件下进行，所述搅拌可以通过磁力搅拌器完成，搅拌的速度例如可以为90-100rpm。根据本发明，透析结束后，采用阳离子交换层析对透析产物进行进一步纯化，所述阳离子交换层析所用阳离子交换树脂一般可分为强酸性阳离子交换剂：活性基团是-SO3H(磺酸基)和-CH2SO3H(次甲基磺酸基)；以及弱酸性阳离子交换剂：活性基团有-COOH，-OCH2COOH，C6H5OH等弱酸性基团；本发明优选使用弱酸性阳离子交换剂对透析产物进行离子交换。根据本发明，所述离子交换层析的步骤可以按照常规的步骤进行，例如，加入样品后，先使用平衡缓冲液将样品带入离子交换层析柱中，然后再通过洗脱液对目标产物进行洗脱。本发明中，相对于本申请特定的目标产物，所述平衡缓冲液的为含有3-4g/L柠檬酸和1-2g/L柠檬酸钠的混合溶液，所述洗脱液为1.5-2.5mol/L的氯化钠缓冲液。本发明中，为了得到本发明的目标产物，所述洗脱的条件优选包括：使用所述洗脱液对目标产物进行梯度洗脱，梯度洗脱：0-100体积％的所述洗脱液；洗脱流速为0.8-1.2mL/min，洗脱时间为30-130min。在洗脱过程中，收集紫外吸收值A280nm出现峰值的洗脱样品。其中，所述“梯度洗脱”指的是，在规定的时间内，将洗脱液的浓度随时间以恒定的梯度成线性上升。所述洗脱液的浓度可通过将洗脱液与去离子水或纯净水按照一定的比例进行调节。根据本发明，为了更进一步分离本发明的多肽，还优选通过C18柱对所述洗脱样品进行萃取。本发明中，在萃取前，优选先通过甲醇的水溶液对所述C18柱进行处理，所述甲醇和水的体积比优选为1:0.5-2。使用C18柱对所述洗脱样品进行萃取的步骤优选先通过超纯水进行淋洗，以将样品带入柱子中，然后再使用65-75体积％乙腈的水溶液收集样品。为了进一步纯化本发明的目标产物，还优选在45-60℃的条件下对萃取液进行浓缩至乙腈完全挥发，从而得到本发明的植物乳杆菌的胞外代谢产物。进一步的，本发明可以通过将如上得到的浓缩产物冷冻干燥以制备成冻干粉长期保存，也可以加入适当的无菌水进行稀释，冷藏或冷冻备用。根据本发明，优选的情况下，在所述植物乳杆菌的胞外代谢产物的使用前，将其pH值调节至6-7，并使用无菌过滤器进行除菌过滤。第四方面，本发明还提供了如上所述的多肽和/或如上所述的植物乳杆菌的胞外代谢产物在诱导植物乳杆菌产生细菌素中的应用。其中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)，更优选为保藏号CGMCCNo.6936的植物乳杆菌植物亚种。第五方面，本发明还提供了一种诱导植物乳杆菌产生细菌素的方法，该方法包括：在对所述植物乳杆菌进行培养的过程中，优选在所述植物乳杆菌培养的对数期，向培养液中加入如上所述的多肽和/或如上所述的植物乳杆菌的胞外代谢产物。其中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)，更优选为保藏号CGMCCNo.6936的植物乳杆菌植物亚种。根据本发明，更为优选的，在所述植物乳杆菌培养的对数期前期加入如上所述的多肽和/或如上所述的植物乳杆菌的胞外代谢产物。所述对数前期指的是进入对数期后的0-8h之间。根据本发明，以所述多肽计，相对于每毫升的培养液，如上所述的多肽和/或如上所述的植物乳杆菌的胞外代谢产物的加入量为2-5微克。本发明的发明人在研究的过程中发现，在常规用于培养乳酸菌的培养基例如，MRS培养基中，植物乳杆菌均能够或多或少的表达并分泌细菌素，因此，常规的用于乳酸菌培养的培养基不能够鉴定出植物乳杆菌是否能够产生细菌素。然而本发明的发明人在研究的过程中发现，在脱脂乳培养基中，不经过本发明的多肽或植物乳杆菌的胞外代谢产物诱导的植物乳杆菌不会产生细菌素，而经过本发明的多肽或植物乳杆菌的胞外代谢产物诱导的植物乳杆菌则能够产生细菌素。基于如上的发现，第六方面，脱脂乳培养基在鉴定产生细菌素的植物乳杆菌中的应用。其中，所述脱脂乳培养基中脱脂乳的浓度优选为50-200g/L，更优选为80-150g/L。具体的，使用如上的脱脂乳培养基对产生细菌素的植物乳杆菌进行鉴定的方法包括：将植物乳杆菌培养在如上的脱脂乳培养基中，培养8-15小时，取培养上清液，检测其抑菌情况。所述抑菌的检测可以使用单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)为指示菌。所述抑菌实验为本领域技术人员所公知的，例如，检测抑菌圈，本发明在此不再详细赘述。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。平衡缓冲液：称取3.36224g的柠檬酸，1.1764g的柠檬酸三钠，溶解后，定容到1L的容量瓶中。洗脱液：2mol/LNaCl溶液。TSBYE培养基：胰蛋白胨17.0g、酵母浸粉6.0g、大豆胨3.0g、葡萄糖2.5g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钾2.5g、水1L，pH6.5，121℃灭菌20min，固体培养基则加入1.5％的琼脂。液体脱脂乳培养基：脱脂乳110g、去离子水1L，水加温至脱脂乳完全溶解，分装至玻璃试管中，10mL/管，115℃高压灭菌20min。NAES缓冲液：100mL体系：取1.67mL的3M乙酸钠，2mL0.5M的EDTA母液(0.5M)，称取1g的SDS溶解后定容至100mL。高压灭菌。制备例1本制备例用于说明本发明的多肽的制备方法委托北京恒宇视野生物技术有限公司合成本发明SEQIDNO：1(KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC)所示的多肽。制备例2本制备例用于说明本发明的植物乳杆菌的胞外代谢产物的制备方法(1)按照201410816266.3专利申请中的方法对保藏号为CGMCCNo.6936的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)Zhang-LL菌株扩大培养24h。(2)取发酵液于4℃，8000rpm低温离心30min得到发酵上清液，将所述发酵上清液放置于4℃，并置于磁力搅拌器上，边搅拌边缓缓加入硫酸铵粉末，使硫酸铵的最终饱和度为70％。4℃冰箱沉淀过夜后，8000rpm离心30min，将沉淀悬浮于体积为发酵上清液体积的1/10去离子水中。并4℃，8000rpm离心30min除去残留的不溶物。(3)对(2)步得到的沉淀物水溶液进行透析，透析袋的截留分子量为3500Da，将透析袋于温水(50-60℃)中浸泡30min。在透析袋的一端打两个死结，将溶液移入透析袋内，于4℃下去离子水中用磁力搅拌器缓慢搅拌(100rpm)，过夜透析。(4)将透析液采用阳离子交换层析法(所使用的阳离子交换层析柱购自美国GEHealthcare，货号SP-SepharoseFF，基质6％琼脂糖微球，配体-O-CH2CHOHCH2OCH2CH2CH2SO3-)进行进一步纯化步骤(3)得到的透析产物：用无菌注射器吸取步骤(3)中得到的透析产物3mL，将转换接头入口管接入样品液中。用30mL平衡缓冲液将样品冲洗到阳离子交换层析柱，然后加入洗脱液进行洗脱，每3min收集一管，洗脱过程中同时检测蛋白质浓度即紫外吸收值A280nm，洗脱程序为：等梯度洗脱：0-100％洗脱液；洗脱时间：30min-130min；流速：1mL/min。(5)将所得到的(4)中紫外吸收值A280nm出现峰图值的样液收集并进行C18柱(购自安捷伦Bondelutc18ewp)萃取，萃取的过程为：先使用3mL甲醇、3mL水活化柱子，然后加入3mL样品，之后用6mL超纯水淋洗将样品冲到C18柱，最后采用6mL70％乙腈收取样液浓缩。(6)用真空低温浓缩仪在50℃下将(5)中收集的样液浓缩至乙腈挥发完全，采用透析前体积1/10的无菌水复溶，得到植物乳杆菌的胞外代谢产物，-20℃保存备用，使用前细菌素需调pH6.5，经0.22μm无菌滤器过滤。(7)将鉴定得到的细菌素纯化液中含有氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的多肽。制备例3本制备例用于说明本发明的植物乳杆菌的胞外代谢产物的制备方法按照实施例2的方法进行植物乳杆菌的胞外代谢产物的制备，不同的是，所使用的植物乳杆菌植物亚种CICC(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)。制备例4本制备例用于说明本发明的植物乳杆菌的胞外代谢产物的制备方法按照实施例2的方法进行植物乳杆菌的胞外代谢产物的制备，不同的是，不进行后续透析、离子交换层析以及萃取的步骤。测试例1(1)挑取新鲜培养的保藏号为CGMCCNo.6936的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)Zhang-LL的单菌落，接种于5mLMRS液体养基中，37℃180rpm培养12h。(2)将上述(1)中培养好的菌液以12000rpm、4℃离心收集菌体，复溶到等体积的生理盐水中，以102cfu/mL初始接种浓度接种于液体脱脂乳培养基中，接种后分为5组，每组3个平行。其中四组分别加入调节pH并过滤灭菌后的制备例1中的多肽，以及制备例2-4中的植物乳杆菌的胞外代谢产物，其中，相对于每mL的液体脱脂乳培养基，多肽的加入量为4微克，植物乳杆菌的胞外代谢产物的加入量为50μL，在菌体刚进入对数期时加入。其中1组不加入任何物质，作为空白对照。将处理后的各组于37℃，180rpm培养36h检测培养物细菌素。(3)细菌素检测分别收集如上5组中的培养基的培养物，4℃，12000rpm离心10min，取上清液用0.22μm无菌滤膜过滤，取100μL，以单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)为指示菌。挑取指示菌单菌落于TSBYE培养基，37℃培养12h。将指示菌菌株稀释至107cfu/mL，与加热融化的TSBYE固体培养基混匀后，倾注约15mL于平皿中。仍分为5组，每组3个平行。待培养基凝固后，轻轻放上已灭菌的牛津杯，分别取各组过滤后的上清100μL加入牛津杯中。于4℃冰箱扩散4h后，置于37℃温箱中培养12h，观察抑菌圈的出现，使用制备例1和2以及空白对照诱导的植物乳杆菌脱脂乳培养上清液的抑菌结果见图1。由图1可知，添加本发明的多肽(图1B)和植物乳杆菌的胞外代谢产物培养基培养物的上清液(图1A)对指示菌单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)具有明显的抑菌作用，而对照的不添加任何外源物质的液体脱脂乳培养基培养物的上清不产生抑菌效果(图1C)。说明添加了植物乳杆菌的胞外代谢产物诱导了不产细菌素的液体脱脂乳培养基培养物产生了细菌素。另外，经制备例3-4所制备的植物乳杆菌的胞外代谢产物诱导后的CGMCCNo.6936的上清液也表现出了明显的抑制指示菌单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)的作用，但制备例3-4的作用效果明显低于制备例1的多肽以及制备例2的植物乳杆菌的胞外代谢产物。(3)单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)生长曲线的测定配制液体TSBYE培养基，分为5组，每组3个平行，分别加入1体积％的步骤(3)所述的上清，同时，以1体积％的接种量将单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)接种至TSBYE液体培养基中，37℃培养24h，其中，每隔2小时测定一次培养液的OD600值，并绘制单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)的生长曲线。其中，使用制备例1和2以及空白对照诱导的植物乳杆菌脱脂乳培养上清液的单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)的生长曲线见图2。由图2可知，添加本发明的多肽和植物乳杆菌的胞外代谢产物培养基培养物的上清液对指示菌单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)具有明显的抑菌作用，而对照的不添加任何外源物质的液体脱脂乳培养基培养物的上清不产生抑菌效果。说明添加了植物乳杆菌的胞外代谢产物诱导了不产细菌素的液体脱脂乳培养基培养物产生了细菌素。另外，经制备例3-4所制备的植物乳杆菌的胞外代谢产物诱导后的CGMCCNo.6936的上清液也表现出了明显的抑制指示菌单核细胞增生李斯特菌(ATCC54003)的作用，但制备例3-4的作用效果明显低于制备例1的多肽以及制备例2的植物乳杆菌的胞外代谢产物。测试例2按照测试例1的方法制备例3制备的植物乳杆菌的胞外代谢产物诱导植物乳杆菌产生细菌素的检测，不同的是，所采用的实验菌株为物乳杆菌植物亚种CICC(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)。结果显示，制备例3制备的植物乳杆菌的胞外代谢产物所诱导的植物乳杆菌植物亚种CICC的上清液的抑菌效果与其诱导的植物乳杆菌植物亚种CGMCCNo.6936的上清液的抑菌效果没有显著性的差异。测试例3相关基因表达水平检测1、液体脱脂乳培养基培养物RNA的提取及反转录(1)将新鲜的经制备例2的植物乳杆菌的胞外代谢产物诱导的液体脱脂乳培养基培养物(A组)的菌液以及未加入诱导物质的液体脱脂乳培养基培养物(B组)(培养条件同测试例1)分别进行离心收集菌体。收集过程如下：按菌液：1％EDTA(pH为12)为1:1的比例混匀后4℃，12000rpm离心7min，以去除脱脂乳中多余的蛋白成分。离心后弃上清用1mL的PBS(pH7.4)洗涤菌体，离心后弃上清，留菌体进行后续实验。(2)将菌体重悬于500μL的NAES缓冲液中，并加入500μL的酸性苯酚(水饱和酚)：氯仿(5：1)。(3)将该体系转移至均质管(装有0.3g的0.1mm玻璃珠)中，beadbeater振荡30s，冰浴2min后，12000rpm，4℃离心5min。(4)取450μL上层水相于新离心管中，加入520μL异丙醇，轻轻摇匀，再加入35μL3M乙酸钠，轻轻摇匀，12000g，4℃离心5min，弃尽上清。(5)加入1mL70体积％的乙醇，反复吹打沉淀，4℃，12000rpm离心5min，吸尽上清，用50μL0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解，待检测。(6)取3μL样品进行电泳进行电泳检测，证明RNA提取成功。(7)DnaseⅠ处理：提取的核酸样品12μL、DnaseI1.5μL、DnaseI+MgCl2buffer1.5μL，37℃反应30min；加入1.5μLEDTA液，65℃处理10min得到RNA样品，并立即逆转录。(8)逆转录：参照试剂盒(Takara货号6110A)说明书中的方法进行处理，得到逆转录样品。2、实时定量PCR测定表达量以逆转录样品为模板，16srDNA为内参基因，测定植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)Zhang-LL基因中与细菌素产生相关的基因：papA、papB、papC、papD的基因表达变化，基因相对表达量的变化采用2-ΔΔCt的计算方法。相关基因的引物序列：基因标号引物序列5'-3'反应条件如下：灭菌的去离子水7.6μl上游引物(10μM)0.5μl下游引物(10μM)0.5μlROX-II0.4μlSYBRPremixExTaq10μl模板1μl反应参数，95℃30s，然后进行下列循环：95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40个循环，检测溶解曲线，结束反应。按照公式2-ΔΔCt计算基因相对表达量的变化，得到结果见图3。从结果可以得出，相比于为添加诱导物质的Zhang-LL，添加了制备例2的植物乳杆菌的胞外代谢产物后，Zhang-LL基因中的papA、papB、papC、papD四个与细菌素产生相关的基因的表达水平分别上调了9.41倍，6.75倍，7.94倍及6.63倍。说明添加细菌素纯化液诱导了植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL菌株基因中相关基因的表达。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页1 2 3