本发明属于生物工程和化学工程技术领域，涉及微生物发酵液分离技术，特别涉及从微生物发酵液中分离精制1,2,4-丁三醇的方法。
背景技术：
1,2,4-丁三醇(以下简称bt)是一种重要的中间体，在医药、烟草、化妆品、造纸、农业和高分子材料领域具有广泛用途。自然界中尚未发现天然的bt生物合成途径，现阶段丁三醇的工业化生产主要依靠化学合成法，副产物多、产率低、对环境有危害，清洁高效的丁三醇生物合成途径逐渐引起研究者的关注。
目前生物发酵生产的bt浓度偏低，一般在几克/升的水平，另外，bt本身沸点高，亲水性强，常规的分离技术如精馏等需要耗费大量能源，再加上发酵液成分复杂，进一步增加了分离提纯的难度。因此从发酵液中分离提取bt，已成为其工业化发展的瓶颈之一。
目前，从发酵液中分离提取bt尚处于实验室研究阶段。例如密歇根州立大学的研究表明，bt的下游分离可以利用2-丁醇作为萃取剂，萃取率达到74％，再经过树脂吸附，可得到纯度超过99％的bt。但2-丁醇在水中有中等的溶解度(35.0g/100ml，20℃)，显然该溶剂不适用于大规模使用。bt类似物甘油，早期也一直用溶剂萃取的方法进行分离提纯，涉及的萃取剂包括醚、对二氧六环、正丁醇、异戊醇、苯胺、二甲苯、煤油等等。但因为溶剂成本过高，操作环境不佳，逐渐被淘汰。目前甘油提纯的主流技术为减压蒸馏。
考虑到bt属于一种多元醇，而硼酸和硼酸盐可以非常迅速地与多元醇和α-羟基羧酸形成稳定的螯合物。很多研究报道利用硼酸来络合多元醇，或者利用多元醇络合硼酸等。例如专利cn103073086b发明了用硼酸处理过的树脂吸附废水中所含甘油的方法，将硼酸处理大孔阴离子树脂后形成硼酸型离子树脂，将其置入含甘油的废水处理装置中，吸附后通过酸碱处理洗脱，树脂可循环使用，这一方法正是基于硼酸可与甘油发生反应的原理。
bt发酵液中的多元醇仅有未发酵的残糖，以及一些发酵的副产物，其含量相对较少。如果能选择性将多元醇先进行一步分离，则bt可以从复杂的发酵液混合物中得以有效的初步分离，将极大的减少后期处理成本。然而，单纯的无机硼酸并不能直接用于bt的络合，因为硼酸本身是水溶性，络合产物也是水溶性，无法做到两相分离。考虑到络合后的两相分离，必须采用不溶于水的硼酸产品作为络合剂，并需要考虑络合剂与bt的分离问题。有研究利用带有硼酸基团的树脂作为吸附剂进行多元醇的吸附，但问题在于吸附后需要脱附，脱附后又需要进一步将脱附的洗脱液进行分离，再加上树脂吸附和洗脱本身的速度较缓慢，因此效率不高。
另外，由于发酵产物成分复杂，最终高纯度的产品仍然需要通过蒸馏手段实现。由于bt沸点高，且高温下容易与其他杂质发生进一步反应，因此需要一种减压且受热时间短的分离手段实现。分子蒸馏是一种特殊的液液分离技术，它不同于传统蒸馏依靠沸点差分离原理，而是依不同物质分子运动平均自由程的差别实现分离。专利cn2668212y提出了一种真空分子蒸馏装置，用于分离一些特殊的热敏性物料或在分离过程中易分解的不稳定高分子有机化合物，将该装置应用于bt的分离提纯，结果发现经过多级分子蒸馏提纯后，bt的纯度可达90％以上，同时保持着较高的收率。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，根据本发明的一个方面，提供了一种从发酵液中分离精制bt的方法，其特征是，采用特定的有机硼酸作为bt的络合剂，发酵液首先进行络合萃取，从发酵液中分离获得bt混合液，bt纯度约为50～60％；bt混合液进行分子蒸馏进行提纯，经一级或多级分子蒸馏后，得到纯度≥90％的高纯度bt产品。
根据本发明的分离精制方法，其包括以下步骤：
1)bt发酵液经灭菌、板框过滤等步骤，除去菌体及其他蛋白絮凝有机杂质；
2)向bt发酵液溶液中加入含有有机硼酸的有机溶剂，有机硼酸与bt的质量比为0.1:1至10:1作为萃取剂进行萃取，所述萃取可以为多级萃取，例如进行3至5级萃取，萃取时间为0.2至10小时，温度为0至60℃，优选时间30分钟，温度优选为40℃，萃取结束后分离有机相和水相；
3)将有机相利用减压蒸馏脱除有机溶剂；
4)将步骤3)中得到的脱除有机溶剂后的产品进行分子蒸馏，得到最终bt产品，分子蒸馏温度控制在100～120℃，真空度稳定在0.001mbar，刮板转速为200～400rpm，分子蒸馏可以采用一级或多级，相应的分子蒸馏条件应根据最终产品要求决定。
优选地，步骤2)中所述含有有机硼酸的有机溶剂可以是醚类、醇类、苯类、脂类等，优选为甲醚、乙醚、甲乙醚、丙醚、丁醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯，磷酸三丁酯，对二氧六环、正丁醇、异戊醇、苯胺、二甲苯、煤油等，所述有机硼酸为烷基硼酸或芳基硼酸等，优选为c10-c18烷基硼酸或c6-c18芳基硼酸，进一步优选为正十四烷基硼酸、苯硼酸、2-苯基乙基硼酸、二联苯硼酸，4-丙基苯硼酸、4-戊基苯硼酸等。
优选地，步骤2)中有机硼酸与bt的摩尔比可以为0.1:1至10:1，优选为4:1至1:1，最优选为1:1。
优选地，根据本发明的分离精制方法除了上述有机硼酸以外，不采用其它络合剂。
有益效果
根据本发明的分离精制方法结合了络合萃取与分子蒸馏的方法对发酵法生产bt进行分离纯化。特别是采用了特定的有机硼酸作为bt的络合剂，所述有机硼酸或者萃取前后一直保持液态，或者溶解在一定的稀释剂中，直到分子精馏分离。根据本发明的分离精制方法工艺简单，分离效率高，有利于工业化大规模生产。
具体实施方式
bt作为一种多元醇可以与硼酸和硼酸盐迅速地络合形成稳定的螯合物，但由于形成的螯合物非常稳定，当采用分子蒸馏时，反而使得分子蒸馏的分离提纯效率降低，特别是由于硼酸和硼酸盐不能非常有效地通过分子蒸馏进行分离，造成产物bt中的杂质含量较高。
本发明的发明人惊奇的发现，当采用特定的有机硼酸作为bt的络合剂时，可以有效地避免上述技术问题。在根据本发明的分离精制方法中所述有机硼酸为烷基硼酸或芳基硼酸等，优选为c10-c18烷基硼酸或c6-c18芳基硼酸，进一步优选为正十四烷基硼酸、苯硼酸、2-苯基乙基硼酸、二联苯硼酸等。当采用上述特定的有机硼酸时，即可以确保萃取效率，同时在后面的分子蒸馏中也可以有效地实现有机硼酸与bt的分离，从而提高bt的纯度和收率。
以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。
以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。
实施例1：
将其中bt浓度约为3～6g/l的bt发酵液经加热灭菌、板框过滤，以去除发酵液中的菌体和絮凝的固体蛋白。
过滤后去除菌体的发酵液中加入正十四烷基硼酸的乙酸乙酯溶液，乙酸乙酯与水溶液的总体积比约为1:1，使所述正十四烷基硼酸与发酵液中的bt的摩尔比控制在约为1:1，与水溶液形成两相。其中在60℃条件下，将0.46g正十四烷基硼酸络合剂加入10ml乙酸乙酯中，搅拌溶解后，加入10ml的0.1mol/l氢氧化钠溶液，调节ph值至约为13左右，再加入10ml的bt发酵液，适度缓慢搅拌，60℃下利用有机相中的硼酸试剂与发酵液中的bt之间的络合作用进行选择性络合萃取，搅拌30min后，静置分层，取下层清液测bt浓度。至发酵液中bt浓度小于0.5g/l。分离水相与有机溶剂相，这样重复3次，每次都用相同量的乙酸乙酯和烷基硼酸，合并萃取有机相。将含有“bt-烷基硼酸”有机相进行减压脱溶操作，获得“bt-烷基硼酸”混合液，其中bt纯度约为50～60％。
将得到的“bt-烷基硼酸”混合液进行分子蒸馏，温度120℃，真空度0.001mbar，收集轻相，一级分子蒸馏后bt产品的纯度为79％，经过两级分子蒸馏处理，即可得到纯度≥90％的bt产品。
实施例2：
bt发酵液中bt浓度约为3～6g/l，发酵液经加热灭菌、板框过滤，以去除发酵液中的菌体和絮凝的固体蛋白。
过滤后去除菌体的发酵液中加入苯基硼酸的乙酸乙酯溶液，乙酸乙酯与水溶液的总体积比为约1:1，使所述苯基硼酸与发酵液中的bt的摩尔比控制在约为1:1，与水溶液形成两相，适度缓慢搅拌，利用有机相中的硼酸试剂与发酵液中的bt之间的络合作用进行选择性络合萃取，搅拌30min后，至发酵液中bt浓度小于0.5g/l，分离水相与有机溶剂相，这样重复3次，每次都用相同量的乙酸乙酯和烷基硼酸，合并萃取有机相。将含有“bt-苯基硼酸”有机溶剂相进行减压脱溶操作，获得“bt-苯基硼酸”混合液，bt纯度约为50～60％。
将得到的“bt-苯基硼酸”混合液后进入分子蒸馏，温度120℃，真空度0.001mbar，收集轻相，一级分子蒸馏后bt产品的纯度为79％，经过两级分子蒸馏处理，即可得到纯度≥90％的bt产品。
实施例3
除了采用2-苯基乙基硼酸作为有机硼酸以外，以与实施例1相同的方式获得bt产品。
实施例4
除了采用二联苯硼酸作为有机硼酸以外，以与实施例1相同的方式获得bt产品。
实施例5
除了采用4-丙基苯硼酸作为有机硼酸以外，以与实施例1相同的方式获得bt产品。
实施例6
除了采用4-戊基苯硼酸作为有机硼酸以外，以与实施例1相同的方式获得bt产品。
对比实施例1
除了不采用如何有机硼酸以外，以与实施例1相同的方式获得bt产品。此实验作为空白对比试验。
下表1中为实施例和对比实施例的不同络合剂及空白对萃取的影响对比。
表1
从表中可以看出，添加了有机硼酸的实施例萃取率都要高于对比实施例中不采用有机硼酸的情况，说明有机硼酸能够有效的提高萃取效率。另外，根据本发明的制备方法中采用的c10-c18烷基硼酸或c6-c18芳基硼酸，相比于现有技术中采用的通常的硼酸，水溶性更小，不会因为溶解到水里而造成较大的损失，即使反复多次使用，损失也很小。特别是在大规模工业化生产过程中，有机硼酸的损失不仅造成成本高昂并且还容易污染环境。另外本发明的特定的有机硼酸具有合适的熔点，一般低于100℃，以确保分子蒸馏时bt与有机硼酸能够有效分离，有机硼酸以液体状态出料。