本发明涉及一种循环双水相体系分离纯化菠萝蛋白酶的方法，具体涉及一种聚合物-盐双水相萃取分离菠萝蛋白酶的方法，属于天然产物有效成分的分离纯化技术领域。
背景技术：
菠萝蛋白酶来源于一种热带水果菠萝，其中菠萝蛋白酶根据提取的部位分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。在食品工业中，菠萝蛋白酶是最佳的肉食嫩化剂。在英国，大约95%的肉制品是使用菠萝蛋白酶进行加工处理的。菠萝蛋白酶的最佳反应温度较低，非常有利于其在食品行业的应用。
目前，菠萝蛋白酶分离纯化方法主要有沉淀法、离子交换色谱法、固定化金属离子亲和色谱法等，这些方法中存在的共同问题是：需要连续运行、难以扩大规模，生产成本高，易造成环境污染且所得酶活性也不足以满足医药级别及食品中对酶活性要求较高的应用。与传统的分离提取方法相比，双水相萃取具有操作条件温和，易于扩大生产，成本低廉等显著的优点。已报道的用于萃取分离菠萝蛋白酶的双水相成相物质主要有聚乙二醇和聚丙二醇，这种成相聚合物的最低临界温度都大于100℃，如果使用此物质来萃取具有生物活性的菠萝蛋白酶，不但会破坏蛋白酶的生物活性、破坏其分子结构，且难以将目标物会从聚合物相中分离出来，萃取之后对聚合物回收也有一定难度。
三嵌段聚合物是一种浊点较低、温敏型的聚合物，其分子胶束以疏水性的聚苯醚（PPO）基团为外核和亲水性的聚环氧乙烷（PEO）基团为核中心，随着温度的上升，胶束壳中PEO链水合度迅速减弱，使胶束聚集形成更紧凑的球形结构，从而可以从原溶液中分离出来。将其用于双水相萃取，不但操作条件温和，能够保护被萃取物质的原有结构和特性，且聚合物也可以回收再利用、对环境的危害较小，同时也节约了成本，提高了双水相萃取的经济效益。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服目前菠萝蛋白酶分离技术工艺复杂、难以扩大规模、破坏酶活性和结构等缺陷，提供一种基于嵌段聚合物的双水相萃取菠萝皮中菠萝蛋白酶的方法，该方法工艺流程简单、成本低、操作条件温和，能够保护目标酶的原有结构和活性，并且聚合物可回收再利用，环境污染小。
本发明采用的技术方案概述如下：
一种循环双水相体系分离纯化菠萝蛋白酶的方法，该方法包括以下步骤：
（1）样品预处理：将菠萝皮榨汁并过滤后，所得滤液在4℃的离心机里以8000转/分钟离心20分钟，得到较为澄清的菠萝皮汁，即为粗提取的菠萝汁，用福林法测定其中菠萝蛋白酶活性，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量。
（2）菠萝蛋白酶稳定性研究：将粗提取的菠萝皮汁分别储存在不同pH的盐溶液或聚合物溶液中，在不同温度下存储不同时间后，测定酶活性，计算所得酶活与储存前酶活的比值，以此来考察菠萝蛋白酶的稳定性。
其中，所述盐溶液为K2HPO4, (NH4)3C6H5O7或K3C6H5O7的水溶液，且溶液中盐浓度为8-15%；所述聚合物为L61或L62，聚合物溶液中聚合物浓度为5-15%，优选聚合物为L61；所述不同pH的溶液由0.1M的HCl和0.1M的NaOH调节而成，pH范围为4-10；所述存储温度为8-70℃，优选温度为8 ℃；所述时间为0.5-12 h，优选时间为4 h。
（3）双水相体系一次萃取菠萝蛋白酶：称取一定质量的盐，聚合物和粗提取的菠萝汁放入10 mL的离心管中，加入一定量的蒸馏水，并调节体系pH，使整个体系质量为10 g。剧烈震荡后，在2000转/分钟下离心20分钟，直到溶液完全分相，聚合物和目标物聚集在上相，盐聚集在下相。后放置于8 ℃的冰箱里4 h，福林法测定上相菠萝蛋白酶的活性，从而得到菠萝蛋白酶活回收率；用考马斯亮蓝法测定上相蛋白质含量，结合酶的活性得到纯化因子，以此判断萃取效果。
其中所述萃取体系中盐为K2HPO4, (NH4)3C6H5O7或K3C6H5O7，终浓度为8-15%；所述聚合物为L61或L62，聚合物溶液中聚合物浓度为5-15%，优选聚合物为L61；所述不同pH的溶液由0.1M 的HCl和0.1M 的NaOH调节而成，pH范围为4-10，优选pH为7。所述蛋白酶活回收率Ra计算如下：
式中At --双水相萃取体系的上相酶活。
Ai --萃取之前总的酶活。
所述纯化因子PF 计算如下：
式中At --双水相萃取的上相酶活；
Ai --萃取之前总的酶活；
Ct --双水相萃取体系的上相蛋白质含量；
Ci --萃取之前总蛋白质含量。
（4）浊点法二次萃取菠萝蛋白酶并回收聚合物：将聚合物相取出，加入适量的蒸馏水进行稀释，使溶液总体积为4 mL，将溶液的pH值调成7，放入35℃水浴锅中进行保温，并在35℃下以2000转/分钟离心20分钟，体系分为新的两相，水溶液和目标物聚集在上相，聚合物聚集在下相。
（5）在最优的双水相萃取体系中，将分离后的聚合物用于下一次的双水相体系中进行循环萃取实验，考察聚合物循环使用效率。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明首次构建温敏聚合物-盐循环双水相体系分离纯化菠萝皮中的菠萝蛋白酶；首次将三嵌段聚合物L61-盐体系用于循环双水相萃取菠萝皮中的菠萝蛋白酶。与传统沉淀法、离子交换色谱法分离菠萝蛋白酶等相比，该体系不需要使用大量有机溶剂，减少了环境污染；所用聚合物成本较低，萃取过程简单；不同于传统的从菠萝茎和肉中提取酶，而是从废弃物菠萝皮中提取，实现了资源的有效利用。与现有的聚合物-盐双水相体系分离纯化菠萝蛋白酶相比，本发明实现了温敏聚合物的循环利用，节约了实验成本的同时，通过循环双水相分离纯化实现了酶活回收率和纯化因子的有效提高；实现了资源节约和最大化利用，提高了经济效益。
（2）在现有的萃取菠萝蛋白酶的双水相体系中，聚乙二醇或聚丙二醇为常用组分，与之相比，本发明中使用的温敏聚合物为三嵌段温敏聚合物L61，具有较低的最低临界溶解温度，加入盐后使得分相温度在8℃即可形成双水相体系，有利于菠萝蛋白酶的分离纯化，在低温能有效保持其原有结构和活性不被破坏。因此得到较高的酶活回收率62.5%和纯化因子9.21。
（3）利用三嵌段聚合物L61的温敏特性，可加热高于其浊点时会与目标物分离，因此可以进入下一次的双水相体系中对菠萝蛋白酶进行循环、连续萃取，实现了资源节约和最大化利用，提高了经济效益。
附图说明
图1为本发明方法具体操作的示意图。
具体实施方式
下面的实施实例是为了使本领域的技术人员理解本发明，但不以任何方式限定本发明。在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进替换或变型均属于本发明的保护范围。
下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
（1）样品预处理：将菠萝皮榨汁并过滤后，所得滤液在4℃的离心机里以8000转/分钟离心20分钟，得到较为澄清的菠萝皮汁，用福林法测定其中菠萝蛋白酶活性为90，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量。
（2）菠萝蛋白酶稳定性研究：将粗提取的菠萝皮汁分别储存在pH = 4，浓度为8%的K2HPO4, (NH4)3C6H5O7和K3C6H5O7溶液中，在15 ℃下存储0.5 h后，测定酶活性，所得酶活与储存前酶活比值分别为65.3%，61.4%和60.2%，由此可知，存储在该环境下酶活有所降低，菠萝蛋白酶有一定的损失，但在K2HPO4体系中损失最少。
（3）双水相体系一次萃取菠萝蛋白酶：向三个10 mL的离心管中分别加入一定质量的K2HPO4, (NH4)3C6H5O7和K3C6H5O7，并分别加入聚合物L61和4mL菠萝皮汁，加入蒸馏水并调节体系pH = 4，使萃取体系质量为10 g。在三种L61- K2HPO4/(NH4)3C6H5O7/K3C6H5O7萃取体系中，盐的终浓度为8%，L61终浓度为8%。将混合溶液剧烈震荡后，在2000转/分钟下离心20分钟，直到溶液完全分相，聚合物和目标物聚集在上相，盐聚集在下相。后放置于8 ℃的冰箱里4 h，福林法测定上相菠萝蛋白酶的活性，从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活性回收率分别为44.9%，38.1%和43.4%；用考马斯亮蓝法测定上相蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中纯化因子分别为5.43，4.79和4.62。
（4）浊点法二次萃取菠萝蛋白酶并回收聚合物：将聚合物相取出，加入适量的蒸馏水进行稀释，使溶液总体积为4 mL，将溶液的pH值调成7，放入35 ℃水浴锅中进行保温，并在35 ℃下以2000转/分钟离心20分钟，体系分为新的两相，水溶液和目标物聚集在上相，聚合物聚集在下相。福林法测定菠萝蛋白酶的活性，从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活二次回收率分别为41.2%，32.5%和39.1%；用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中二次萃取纯化因子分别为5.97，6.45和5.78。
实施例2：
（1）样品预处理：将菠萝皮榨汁并过滤后，所得滤液在4 ℃的离心机里以8000转/分钟离心20分钟，得到较为澄清的菠萝皮汁，用福林法测定其中菠萝蛋白酶活性为90，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量。
（2）菠萝蛋白酶稳定性研究：将粗提取的菠萝皮汁分别储存在pH = 10，浓度为15%的K2HPO4, (NH4)3C6H5O7和K3C6H5O7溶液中，在70 ℃下存储12 h后，测定酶活性，所得酶活与储存前酶活比值为2.5%，2.1%和1.8%。因此，在高温、高pH环境下长时间储存会使酶活性明显下降，菠萝蛋白酶损失较多。
（3）双水相体系一次萃取菠萝蛋白酶：向三个10 mL的离心管中分别加入一定质量的K2HPO4, (NH4)3C6H5O7和K3C6H5O7，并分别加入聚合物L61和4mL菠萝皮汁，加入蒸馏水并调节体系pH = 10，使萃取体系质量为10 g。在三种L61- K2HPO4/(NH4)3C6H5O7/K3C6H5O7萃取体系中，盐的终浓度为15%，L61终浓度为12%。将混合溶液剧烈震荡后，在2000转/分钟下离心20分钟，直到溶液完全分相，聚合物和目标物聚集在上相，盐聚集在下相。后放置于8 ℃的冰箱里4 h，福林法测定上相菠萝蛋白酶的活性，从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活性回收率分别为58.1%，50.1%和42%；用考马斯亮蓝法测定上相蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中纯化因子分别为6.19,5.07和4.86。
（4）浊点法二次萃取菠萝蛋白酶并回收聚合物：将聚合物相取出，加入适量的蒸馏水进行稀释，使溶液总体积为4 mL，将溶液的pH值调成7，放入35 ℃水浴锅中进行保温，并在35 ℃下以2000转/分钟离心20分钟，体系分为新的两相，水溶液和目标物聚集在上相，聚合物聚集在下相。福林法测定菠萝蛋白酶的活性，从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活二次回收率分别为52.9%，48.1%和38.7%；用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中二次萃取纯化因子分别为7.8，6.51和5.24。
实施例3：
（1）样品预处理：将菠萝皮榨汁并过滤后，所得滤液在4 ℃的离心机里以8000转/分钟离心20分钟，得到较为澄清的菠萝皮汁，用福林法测定其中菠萝蛋白酶活性为90，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量。
（2）菠萝蛋白酶稳定性研究：将粗提取的菠萝皮汁分别储存在pH = 7.5的12%的K2HPO4, (NH4)3C6H5O7和K3C6H5O7溶液中，在8 ℃下存储4 h后，测定酶活性，所得酶活与储存前酶活比值为82.6%，65.6%和62.5%。因此，存储在该环境下三种盐溶液中酶活略有降低，菠萝蛋白酶损失较少，该环境中的pH、温度和时间为合适的存储环境；且在K2HPO4溶液中损失最少，即K2HPO4对酶活性的抑制最弱。
（3）双水相体系一次萃取菠萝蛋白酶：向三个10 mL的离心管中分别加入一定质量的K2HPO4, (NH4)3C6H5O7和K3C6H5O7，并分别加入聚合物L61和4mL菠萝皮汁，加入蒸馏水并调节体系pH = 7，使萃取体系质量为10 g。在三种L61- K2HPO4/(NH4)3C6H5O7/K3C6H5O7萃取体系中，盐的终浓度为12%，L61终浓度为10%。将混合溶液剧烈震荡后，在2000转/分钟下离心20分钟，直到溶液完全分相，聚合物和目标物聚集在上相，盐聚集在下相。后放置于8 ℃的冰箱里4 h，福林法测定上相菠萝蛋白酶的活性，从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活回收率分别为54.37%，46.22%和49.74%；用考马斯亮蓝法测定上相蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中纯化因子分别为6.12,5.53和5.31。
（4）浊点法二次萃取菠萝蛋白酶并回收聚合物：将聚合物相取出，加入适量的蒸馏水进行稀释，使溶液总体积为4 mL，将溶液的pH值调成7，放入35 ℃水浴锅中进行保温，并在35 ℃下以2000转/分钟离心20分钟，体系分为新的两相，水溶液和目标物聚集在上相，聚合物聚集在下相。福林法测定菠萝蛋白酶的活性，从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活二次回收率分别为49.3%，42.8%和43.5%；用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中二次萃取纯化因子分别为7.31，6.5和6.43。
实施例4：
（1）样品预处理：将菠萝皮榨汁并过滤后，所得滤液在4 ℃的离心机里以8000转/分钟离心20分钟，得到较为澄清的菠萝皮汁，用福林法测定其中菠萝蛋白酶活性，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量。
（2）菠萝蛋白酶稳定性研究：将粗提取的菠萝皮汁分别储存在pH = 7.5的5% L61和5%L62溶液中，在8 ℃下存储4 h后，测定酶活性，所得酶活与储存前酶活比值为89.9%和80.2%。因此，存储在该环境下低浓度的聚合物溶液中，酶活略有降低，菠萝蛋白酶损失很少，即低浓度聚合物对酶活性的抑制较弱。
（3）双水相体系一次萃取菠萝蛋白酶：向三个10 mL的离心管中分别加入一定质量的K2HPO4, (NH4)3C6H5O7和K3C6H5O7，并分别加入聚合物L61和4mL菠萝皮汁，加入蒸馏水并调节体系pH = 7，使萃取体系质量为10 g。在三种L61- K2HPO4/(NH4)3C6H5O7/K3C6H5O7萃取体系中，盐的终浓度为10%，L61终浓度为5%。将混合溶液剧烈震荡后，在2000转/分钟下离心20分钟，直到溶液完全分相，聚合物和目标物聚集在上相，盐聚集在下相。后放置于8 ℃的冰箱里4 h，福林法测定上相菠萝蛋白酶的活性，从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活回收率分别为43.5%，37.8%和42.7%；用考马斯亮蓝法测定上相蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中纯化因子分别为4.86,4.32和3.4。
（4）浊点法二次萃取菠萝蛋白酶并回收聚合物：将聚合物相取出，加入适量的蒸馏水进行稀释，使溶液总体积为4 mL，将溶液的pH值调成7，放入35 ℃水浴锅中进行保温，并在35 ℃下以2000转/分钟离心20分钟，体系分为新的两相，水溶液和目标物聚集在上相，聚合物聚集在下相。福林法测定菠萝蛋白酶的活性，从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活二次回收率分别为39.7%，34.2%和37.8%；用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中二次萃取纯化因子分别为5.85，5.7和5.57。
实施例5：
（1）样品预处理：将菠萝皮榨汁并过滤后，所得滤液在4 ℃的离心机里以8000转/分钟离心20分钟，得到较为澄清的菠萝皮汁，用福林法测定其中菠萝蛋白酶活性，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量。
（2）菠萝蛋白酶稳定性研究：将粗提取的菠萝皮汁分别储存在pH = 7.5的15% L61和15%L62溶液中，在8 ℃下存储4 h后，测定酶活性，所得酶活与储存前酶活比值为69.08%和56.8%。因此，存储在该环境下高浓度聚合物溶液中，酶活降低，菠萝蛋白酶有一定的损失，即高浓度聚合物对酶活性的抑制较强。
（3）双水相体系一次萃取菠萝蛋白酶：向三个10 mL的离心管中分别加入一定质量的K2HPO4, (NH4)3C6H5O7和K3C6H5O7，并分别加入聚合物L61和4mL菠萝皮汁，加入蒸馏水并调节体系pH = 7，使萃取体系质量为10 g。在三种L61- K2HPO4/(NH4)3C6H5O7/K3C6H5O7萃取体系中，盐的终浓度为10%，L61终浓度为15%。将混合溶液剧烈震荡后，在2000转/分钟下离心20分钟，直到溶液完全分相，聚合物和目标物聚集在上相，盐聚集在下相。后放置于8 ℃的冰箱里4 h，福林法测定上相菠萝蛋白酶的活性，从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活回收率分别为60.1%，53.2%和57.2%；用考马斯亮蓝法测定上相蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中纯化因子分别为6.5，6.08和4.76。因此，该条件下菠萝蛋白酶损失较少，得到的酶的纯度也较高。
（4）浊点法二次萃取菠萝蛋白酶并回收聚合物：将聚合物相取出，加入适量的蒸馏水进行稀释，使溶液总体积为4 mL，将溶液的pH值调成7，放入35 ℃水浴锅中进行保温，并在35 ℃下以2000转/分钟离心20分钟，体系分为新的两相，水溶液和目标物聚集在上相，聚合物聚集在下相。从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活二次回收率分别为55.6%，45.7%和53.9%；用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中二次萃取纯化因子分别为7.5，6.73和7.94。因此，该二次萃取条件下菠萝蛋白酶有些损失，但得到酶的纯度较高。
实施例6：
（1）样品预处理：将菠萝皮榨汁并过滤后，所得滤液在4 ℃的离心机里以8000转/分钟离心20分钟，得到较为澄清的菠萝皮汁，用福林法测定其中菠萝蛋白酶活性，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量。
（2）菠萝蛋白酶稳定性研究：将粗提取的菠萝皮汁分别储存在pH = 7.5的12% L61和12%L62溶液中，在8 ℃下存储4 h后，测定酶活性，所得酶活与储存前酶活比值为72.6%和65.1%。因此，存储在该环境下聚合物溶液中，酶活略有降低，菠萝蛋白酶有较少的损失，且在L61体系中损失更少，即聚合物L61对酶活性的抑制较弱。
（3）双水相体系一次萃取菠萝蛋白酶：向三个10 mL的离心管中分别加入一定质量的K2HPO4, (NH4)3C6H5O7和K3C6H5O7，并分别加入聚合物L61和4mL菠萝皮汁，加入蒸馏水并调节体系pH = 7，使萃取体系质量为10 g。在三种L61- K2HPO4/(NH4)3C6H5O7/K3C6H5O7萃取体系中，盐的终浓度为12%，L61终浓度为12%。将混合溶液剧烈震荡后，在2000转/分钟下离心20分钟，直到溶液完全分相，聚合物和目标物聚集在上相，盐聚集在下相。后放置于8 ℃的冰箱里4 h，福林法测定上相菠萝蛋白酶的活性，从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活回收率分别为68.6%，60.27%和64.84%；用考马斯亮蓝法测定上相蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中纯化因子分别为6.53，5.87和5.37。因此，该条件下菠萝蛋白酶损失很少，得到的酶的纯度也较高。
（4）浊点法二次萃取菠萝蛋白酶并回收聚合物：将聚合物相取出，加入适量的蒸馏水进行稀释，使溶液总体积为4 mL，将溶液的pH值调成7，放入35 ℃水浴锅中进行保温，并在35 ℃下以2000转/分钟离心20分钟，体系分为新的两相，水溶液和目标物聚集在上相，聚合物聚集在下相。从而得到三个体系中菠萝蛋白酶活二次回收率分别为62.5%，55.7%和60.6%；用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，结合酶的活性得到三个体系中二次萃取纯化因子分别为9.21，7.54和8.21。因此，该二次萃取条件下菠萝蛋白酶损失较少，得到酶的纯度也很高，尤其在L61- K2HPO4体系中效果最佳。
（5）此实施例中终浓度为12%的L61和12%的K2HPO4的萃取体系，对菠萝蛋白酶活的最终回收率能达到62.5%，纯化因子为9.21，为最优的双水相萃取菠萝蛋白酶的体系。在此基础上，将分离后的聚合物再次用于新的双水相体系中进行循环萃取实验，以此再循环两次，得到最终酶活回收率分别为61.8%和60.4%，证明了该体系中聚合物L61具有很好的循环萃取效果。
在试验中，选择K2HPO4作为分相体系是因为其具有相对较高的盐析能力，能在使用量较少的情况下快速降低浊点，达到分离体系所需的温度。从分离纯化酶活回收率来看，与其他分相盐相比，使用K2HPO4时，能得到相对较高的酶活回收率。这可能是由于菠萝蛋白酶的等电点在9.55，而一定量的K2HPO4溶液的pH值正好在这附近，这样有利于菠萝蛋白酶的分离。