一种精准Fc位点共价偶联标记的生物素化抗体的制作方法

文档序号:12162404阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种精准导向Fc位点偶联的生物试剂,该生物试剂包括Z亲和肽,其特征是:所述Z亲和肽的α1结构域处连接有4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸,所述Z亲和肽的羧基末端残基处依次连接Avi-tag标签蛋白和多聚组氨酸纯化标签蛋白,其中所述Avi-tag标签蛋白上的赖氨酸残基上连接生物素或其衍生物。

2.权利要求1所述的精准导向Fc位点偶联的生物试剂的制备方法,其特征是,包括以下步骤:

(1)首先构建重组质粒pZTAG–Avitag表达载体:其中,目的基因的合成为:首先根据Z亲和肽基因序列,在Z亲和肽基因序列的α1结构域序列所需位点处插入琥珀密码子(TAG),然后在Z亲和肽基因序列下游末端、多聚组氨酸纯化标签基因序列置入Avitag基因序列,最后在上述基因序列的5'端和3'端分别设置限制性内切酶酶切位点,化学合成得到目的基因序列;

(2)然后步骤(1)中的表达载体利用原核微生物表达出重组蛋白ZBpa–Avitag;

(3)最后利用生物素连接酶对重组蛋白ZBpa–Avitag生物素化,得到生物素化的重组蛋白ZBpa–Avitag,即为该生物试剂(ZBpa-Biotin)。

3.如权利要求2所述的制备方法,其特征是:步骤(1)中,将目的基因序列亚克隆至pTBX1质粒中,获得重组质粒pZTAG–Avitag表达载体;优选的,所述多聚组氨酸纯化标签基因序列为6聚组氨酸基因序列;优选的,所述目的基因的5'端设置NdeI限制性内切酶酶切位点,所述目的基因的3'端设置XhoI限制性内切酶酶切位点;优选的,所述目的基因序列如SEQIDNO.1所示。

4.如权利要求2所述的制备方法,其特征是:步骤(2)中,所述表达载体与含有氨酰tRNA合成酶编码基因的pEVOL-pBpF共转化至原核生物中,获得基因工程菌;优选的,将所述基因工程菌30~37℃经过12~18h培养、活化后,转接到2×YT培养基中,37℃培养至OD600为0.6–0.8;然后加入4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸,继续培养0.5~2h;再加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和阿拉伯糖,30~37℃诱导培养5~7h;经过上述培养的工程菌离心收集菌体,采用缓冲液重悬,冻融裂解菌体;离心去除菌体碎片后,采用层析柱纯化目的蛋白。

5.如权利要求2所述的制备方法,其特征是:步骤(3)中,利用BirA酶体外反应体系对重组蛋白ZBpa–Avitag进行生物素化,再通过层析柱和超滤离心管获得生物素化的重组蛋白,精准导向Fc位点偶联的生物试剂;

优选的,所述BirA酶体外反应体系如下:buffer A,buffer B,ZBpa–Avitag,生物素连接酶,25~35℃反应5~7h;所述buffer A为0.5M的N-二(羟乙基)甘氨酸,pH 8.3;所述buffer B为pH 8.0的溶液中,含有100mM ATP,100mM乙酸镁,200mM生物素。

6.权利要求1所述的生物试剂在三维定向固定IgG抗体中的应用。

7.一种精准导向Fc位点偶联的生物素化抗体,其特征是:该抗体是由权利要求1所述生物试剂中Z亲和肽导向的4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸通过共价键与IgG抗体Fc段相连接。

8.权利要求7所述的精准导向Fc位点偶联的生物素化抗体的制备方法,其特征是:将IgG抗体与权利要求1所述的生物试剂混合,先导向Fc位点的生物亲和偶联,继而在365nm紫外光照射下激发光敏基团与IgG抗体的Fc段的氨基产生共价键,即可得到精准导向Fc位点偶联的生物素化抗体。

9.如权利要求8所述的制备方法,其特征是:IgG抗体与所述生物试剂按照1:4~6分子数比例混合,室温振荡20~40min后,将上述反应体系置于冰上,365nm紫外照射2~4h,照射后产物用超滤离心管除去多余的ZBpa–Biotin分子,即可得到精准导向Fc位点偶联的生物素化抗体。

10.一种免疫传感芯片,该免疫芯片包括一基底片,所述基底片上固定有亲和素,亲和素与权利要求7所述的生物素化抗体中的生物素相结合。

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