一种线粒体双光子荧光粘度探针及其制备方法与流程

本发明涉及一种线粒体双光子荧光粘度探针及其制备方法，是一种具有无毒性、对细胞线粒体专一识别且光稳定性良好的双光子吸收材料——乙烯基吡啶硝酸盐衍生物。

背景技术：

线粒体(Mitochondria)是细胞存活的关键细胞器，产生超过90％的身体需要的能量以维持生命并支持生长，在许多重要的生理过程，诸如细胞凋亡，分化，信号转导和活性氧(ROS)的生成中发挥着不可缺少的作用。在细胞分裂和代谢的不同阶段以及在细胞发育分化过程中，线粒体的大小、数量以及形态都会发生不同的变化。近年来的工作已经表明，线粒体的形态和数量，与许多疾病相关，如神经变性疾病帕金森氏病(Parkinson’s disease)、阿兹海默氏病(Alzheimer’s disease)、动脉粥样硬化、心脏病、中风和癌症，其中主要表现为由线粒体肿胀而表现出的粘度增加。因此，借助荧光探针观察活细胞中成像线粒体的形态变化，了解线粒体在生物代谢过程中的作用，在疾病早期诊断和治疗方面具有指导意义。

然而，目前已经商业化生产的有机小分子线粒体探针，大多是通过荧光和磷光技术对线粒体数量及形态进行成像分析，例如Rhodamine123，Mito GreenFM和Mito Red FM，它们主要分为依赖于线粒体膜电位的荧光探针以及非依赖性的线粒体探针，虽然这些染料能够进行活细胞成像，但是它们的细胞毒性大，光不稳定，水溶性差，Stokes位移较小，不能对因疾病而产生的线粒体粘度增加进行识别，从而限制了它们的使用。因此，开发一种无毒、水溶性好、光稳定性高的线粒体荧光探针具有重要的科学意义和明显的应用前景。

申请人对本申请的主题进行了如下的文献检索：

1、scholar.glgoo.org网检索结果：(2016/9/29)

2、中国知网检索结果：

检索方式一：

篇名-线粒体双光子荧光粘度探针：无相关文献。

篇名-一种线粒体双光子荧光粘度探针——乙烯基吡啶硝酸盐衍生物及其制备方法：无相关文献。

检索方式二：

全文-线粒体双光子荧光粘度探针：无相关文献。

全文-一种线粒体双光子荧光粘度探针——乙烯基吡啶硝酸盐衍生物及其制备方法：无相关文献。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种线粒体双光子荧光粘度探针及其制备方法，是以碘甲烷、甲基吡啶、甲基羟乙基胺、对氟苯甲醛为原料，简单高效的合成了D-π-A构型的有机吡啶硝酸盐。本发明目标分子具有良好的细胞亲和性，能够对活细胞线粒体进行长时间稳定的双光子成像，并能识别线粒体粘度变化。为跟踪线粒体在细胞中的变化提供有效的可视化工具，具有良好的开发应用价值。

本发明线粒体双光子荧光粘度探针为乙烯基吡啶硝酸盐衍生物，其结构式为：

本发明线粒体双光子荧光粘度探针的制备方法，包括如下步骤：

1、中间体1的合成

向50mL圆底烧瓶中加入碘甲烷(14.40g，100mmol)，搅拌下缓慢滴入溶于4mL乙醇的对甲基吡啶(6.20g，65mmol)，加热至回流反应20min，析出大量白色晶体，过滤，乙醇洗涤并干燥后得中间体1，14.60g，产率96％。

2、中间体2的合成

向500mL圆底烧瓶中加入DMSO(200mL)、甲基羟乙基胺(165g,2200mmol)、无水碳酸钾(166g，1200mmol)以及3滴Aliquat-336，升温至95℃反应10min，再加入对氟苯甲醛(124g,1000mmol)，95℃下继续反应三天；反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，用盐酸调节pH值至2，剧烈搅拌后收集水层，以NaOH溶液调节pH值至11，收集有机层，反复操作3次，用DCM萃取收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，除去溶剂后得中间体2，为淡黄色固体，142g，产率79％。

3、目标产物B1的合成

向100mL圆底烧瓶中加入中间体2(1.80g，10mmol)、中间体1(2.40g，20mmol)、30mL无水乙醇和3滴哌啶，60℃下搅拌反应24h，得深红色溶液；向所述深红色溶液中滴加含有AgNO₃(1.70g,10mmol)的30mL无水乙醇溶液，回流反应2h，反应结束后冷却，过滤，乙醇洗涤并干燥，再用DCM重结晶，有红色晶体析出，得目标产物2.00g，产率60％。

4、本发明目标分子B1的生物成像研究

在活细胞共聚焦成像中，低浓度(1-10μmol)的目标分子B1与人类肝癌细胞HepG2在10分钟的共培养后，PBS缓冲溶液清洗2-3遍，再与500nM的Mitotracker Far Red培养10分钟。通过双光子激光共聚焦显微镜观察，发现目标分子和线粒体商业染料Mitotracker Far Red很好的重合，并具有响应线粒体粘度(viscosity)变化的作用。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明合成的乙烯基吡啶硝酸盐B1是一种具有生物显影功能的双光子吸收有机小分子材料，能够识别活体细胞中线粒体粘度的变化，可以作为线粒体双光子荧光粘度探针；

2、与文献报道或商品染料相比，本发明的目标产物B1具有双光子吸收特征，对细胞无损伤、水溶性好、光稳定性高等特点，且具有明显的应用价值；

3、本发明的目标产物B1能够专一对线粒体进行显影，并且其极低的细胞毒性以及极高的光稳定性可适用于长时间追踪线粒体在活细胞中的形态及粘度变化。

4、本发明的目标产物B1是一类新型线粒体染料。

5、本发明的目标产物B1的原料易得、合成路线简短，合成条件温和。

附图说明

图1是本发明目标产物B1的晶体结构图，说明B1是有明确结构的新物质。

图2是本发明目标产物B1的水溶性测试，说明B1具有优异的水溶性。

图3是本发明目标产物B1对HepG-2及3T3的细胞增值活性影响的实时监测结果，表明B1对两种细胞无毒，具有良好的生物相容性。

图4是本发明目标产物B1的单、双光子显影及3D成像图，(a)单光子(b)双光子(c)重叠图(d)三维成像，表明B1能够进入细胞内并具有单、双光子显影的功能。

图5是本发明目标产物B1与商业染料Mitotracker Far Red共定位的显影图，pearson’s Rr＝0.8921说明了B1与商业染料MTFR有着高度的重合。

图6是本发明目标产物B1在HepG-2细胞中线粒体的显影图与细胞内荧光成像区域的微粘度梯度分布图像，表明B1具有响应线粒体粘度(viscosity)变化的作用。

图7是本发明目标产物B1对不同种类细胞的成像区域的微粘度梯度分布图像，说明B1可以作为线粒体双光子荧光粘度探针，具有广泛的应用性。

图8是本发明目标产物B1在0-72h内对细胞进行检测的显影，说明了该化合物光稳定性高，可用于长时间对活细胞的线粒体进行追踪。

具体实施方式

本实施例中线粒体双光子荧光粘度探针的制备及生物显影方法如下：

1、中间体1的合成

向50mL圆底烧瓶中加入碘甲烷(14.40g，100mmol)，搅拌下缓慢滴入溶于4mL乙醇的对甲基吡啶(6.20g，65mmol)，加热至78℃回流反应20min，析出大量白色晶体，过滤，乙醇洗涤并干燥后得中间体1，14.60g，产率96％。

2、中间体2的合成

向500mL圆底烧瓶中加入DMSO(200mL)、甲基羟乙基胺(165g,2200mmol)、无水碳酸钾(166g，1200mmol)以及3滴Aliquat-336，升温至95℃反应10min，再加入对氟苯甲醛(124g,1000mmol)，95℃下继续反应三天；反应结束后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，用盐酸调节pH值至2，剧烈搅拌后收集水层，以NaOH溶液调节pH值至11，收集有机层，反复操作3次，用DCM萃取收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，除去溶剂后得中间体2，为淡黄色固体，142g，产率79％。

3、目标产物的合成

向100mL圆底烧瓶中加入中间体2(1.80g，10mmol)、中间体1(2.40g，20mmol)、30mL无水乙醇和3滴哌啶，加热至60℃搅拌反应24h，得深红色溶液；向所述深红色溶液中滴加含有AgNO₃(1.70g,10mmol)的30mL无水乙醇溶液，回流反应2h，反应结束后冷却，过滤，乙醇洗涤并干燥，再用DCM重结晶，有红色晶体析出，得目标产物2.00g，产率60％。

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ＝8.67(d,2H),8.02(d,2H),7.89(d,1H),7.56(d,2H),7.14(d,1H),6.79(d,2H),4.76(s,1H),4.17(s,3H),3.53(d,4H),3.03(d,3H).

¹³C NMR(101MHz,d₆-DMSO)δ＝153.34,151.06,144.25,141.38,130.20,122.04,116.77,111.67,58.14,53.83,46.25,38.70.

Anal.Calcd.for C₁₇H₂₁N₃O₄:C,61.62；H,6.39；N,12.68％.Found:C,56.08；H,7.052；N,11.64％.IR(KBr,cm^-1):3390(m),2925(w),1640(m),1584(s),1518(s),1377(vs),1176(s),1040(w),818(w),535(m).

M.p.＝120℃.ESI:m/z,cal:269.36,found:269.42[M⁺]

4、本发明目标分子B1的生物成像研究

在活细胞共聚焦成像中，低浓度(1-10μmol)的目标分子B1与人类肝癌细胞HepG2在10分钟的共培养后，PBS缓冲溶液清洗2-3遍，再与500nM的Mitotracker Far Red培养10分钟。通过双光子激光共聚焦显微镜观察，发现目标分子和线粒体商业染料Mitotracker Far Red很好的重合，并具有响应线粒体粘度(viscosity)变化的作用。