质谱增敏的异硫氰酸酯类标记试剂及其合成方法和应用与流程

本发明属于有机小分子肽类标记物技术领域，具体涉及一种质谱增敏的异硫氰酸酯类标记试剂及其合成方法和应用。

背景技术：

随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入后基因组时代。近年来，定量蛋白质组学研究在揭示疾病发生发展机制、发现具有重要生物功能的蛋白质、筛选与疾病相关的生物标志物以及寻找药物的靶标等方面都发挥了重要作用。生物质谱技术凭借具有高分辨率、高灵敏度、高通量等优势，已成为当前规模化蛋白质定量研究的首选技术。其中生物质谱结合稳定同位素标记技术已经被广泛应用于生物体系的定量蛋白质组学研究。

现有的通用标记试剂为异硫氰酸苯酯，其母体环是苯环，不具备质谱增敏作用，因而在质谱上响应比较低，导致该试剂的灵敏度不高，难以完成复杂体系中低含量肽类化合物的定量分析。因此，有必要可发一种具备质谱增敏效果的标记试剂来适应目前越来越高的分析要求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种加快标记反应速率、提高标记产物的信号、增强质谱检测肽类化合物准确性和灵敏性的质谱增敏的异硫氰酸酯类标记试剂；本发明同时提供其合成方法和应用。

本发明所述的质谱增敏的异硫氰酸酯类标记试剂，是以苯基哌嗪为母体环，以异硫氰酸酯为活性基团，其化学名称为：1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪，其化学结构式为：

所述的质谱增敏的异硫氰酸酯类标记试剂的合成方法，包括以下步骤：

(1)将1,3-二溴丙烷、KOH溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，向其中滴加N-苯基哌嗪的二甲基亚砜溶液，进行反应，反应完毕后，反应液倾入无水乙醇中，析出固体即为中间体1-(3-溴丙基)-4-苯基哌嗪；

(2)向1-(3-溴丙基)-4-苯基哌嗪中加入硫氰化钾、聚乙二醇、二氯甲烷，进行反应，反应完毕后，反应液倾入水中，回收固体，经重结晶、干燥后得到目标产物1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪。

其中：

步骤(1)中N-苯基哌嗪、KOH、1,3-二溴丙烷的摩尔比为1:1.05:2.5。

步骤(1)中反应温度为70℃，反应时间为4小时。

采用无水乙醇将步骤(1)中所得中间体1-(3-溴丙基)-4-苯基哌嗪洗涤3次，以除去杂质，洗涤后，自然挥发除去无水乙醇。

步骤(2)中1-(3-溴丙基)-4-苯基哌嗪、硫氰化钾的摩尔比为1:1.5，聚乙二醇的用量为1-(3-溴丙基)-4-苯基哌嗪的3％。

步骤(2)中反应温度为60℃，反应时间为3小时。

采用乙腈将步骤(2)中所得目标产物1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪重结晶3次，得到结晶的针状产品。

所述的质谱增敏的异硫氰酸酯类标记试剂的应用：检测样品中微量、痕量小肽的浓度。

具体包括以下步骤：

(1)配制pH＝9.0的硼砂/硼酸缓冲溶液；配制5份小肽标准品的乙腈溶液，浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM、10mM；配制浓度为100mM的1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪的乙腈溶液；

(2)依次将100μL硼砂/硼酸缓冲溶液、100μL小肽标准品的乙腈溶液和50μL 1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于65℃的水浴中反应15分钟，反应完毕后，取10μL进入高效液相色谱-质谱联用仪中分析，得到小肽标准品色谱图，以小肽浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制小肽浓度工作曲线；

(3)将样品用1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪标记后，注入高效液相色谱-质谱联用仪中分析，将所得到的峰面积代入小肽浓度工作曲线中，即可求得样品中小肽的浓度。

本发明的有益效果如下：

本发明所述的异硫氰酸酯标记试剂是以苯基哌嗪为母体环，以异硫氰酸酯为活性基团。其中母体环苯基哌嗪上带有两个N原子，增强了整个化合物接受质子的能力，因而在质谱检测中具有较高的响应，提高了质谱分析的灵敏度。异硫氰酸酯基团在标记肽类化合物时，对肽类化合物选择性专一，而且标记时间短、标记产率高。因此，本发明所述的异硫氰酸酯标记试剂可以快速、准确、灵敏地标记检测肽类化合物，尤其适用于复杂体系中微量、痕量小分子肽类化合物的分离检测，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪合成路线图。

图2是1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪的质谱鉴定图。

图3是同浓度的异硫氰酸苯酯、1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪的质谱响应值比较图。

图4是目标产物核磁1HNMR图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

1、中间体1-(3-溴丙基)-4-苯基哌嗪的制备

向三颈烧瓶中加入4.5g 1,3-二溴丙烷、0.6g KOH，加入50mL DMSO，放入磁子，缓慢升温至70℃，向其中滴加含有1.65g N-苯基哌嗪的DMSO溶液，搅拌反应4小时。反应完毕后，反应液倾入无水乙醇中，析出固体。用无水乙醇冲洗3次，挥发晾干，所得固体即为中间体1-(3-溴丙基)-4-苯基哌嗪，产率72％。

2、目标产物1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪的制备

在圆口烧瓶中加入2.82g 1-(3-溴丙基)-4-苯基哌嗪，1.5g KSCN，3-5滴聚乙二醇-400，50mL二氯甲烷。将反应液加热至60℃，搅拌反应3小时。将反应液倒入水中，将析出的固体抽滤，用二氯甲烷洗涤3次后晾干，用乙腈重结晶3次，所得针状晶体即为目标产物1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪。产率为65％。

上述反应的合成路线见图1。

目标产物的表征数据如下：

目标产物的质谱鉴定图见图2，其中，正离子模式m/z 262.2。

目标产物的核磁1HNMR图见图4。

目标产物元素分析结果：

Found:C 64.40,H 7.31,N16.08,S 12.21；Calculated:C 64.33,H 7.33,N16.08,S 12.27.

实施例2

分别称取异硫氰酸苯酯、1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪，用适量乙腈溶解，配置成相同浓度的溶液，取等量混合，注入高效液相色谱-质谱联用仪中检测。结果表明，同浓度的1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪的质谱响应值为异硫氰酸苯酯的5-6倍，从而说明1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪具有较高的质谱灵敏度。两者质谱响应值比较结果见图3。

实施例3

(1)利用质谱增敏1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪标记检测人体血浆中的小肽含量，配制pH＝9.0的硼砂/硼酸缓冲溶液；配制5种小肽(Gly-His，Gly-Ser，Gly-Leu，Gly-Gly，Gly-Met)标准品的乙腈溶液，每一种小肽的浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM、10mM；配制浓度为100mM的1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪的乙腈溶液；

(2)依次将100μL硼砂/硼酸缓冲溶液、100μL小肽标准品的乙腈溶液和50μL 1-(3-异硫氰酸酯基丙基)-4-苯基哌嗪的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于65℃的水浴中反应15分钟，反应完毕后，取10μL进入高效液相色谱-质谱联用仪中分析，得到小肽标准品色谱图，将五份小肽标准品依次按照上述步骤衍生、分析后，以小肽浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制小肽浓度工作曲线；

(3)人体血浆样品中加入乙腈超声震荡后离心去蛋白，取上清液用，按上述方法标记后，注入高效液相色谱仪中分析，将所得到的峰面积代入工作曲线中，即可求得血浆样品中五种小肽的浓度。