利用鳕鱼内脏制备高纯度海产多不饱和脂肪酸磷脂的方法与流程

本发明属于海洋活性物质制备的
技术领域：
，具体涉及一种从鳕鱼内脏中提取高纯度海产多不饱和脂肪酸磷脂的方法。
背景技术：
：磷脂是一类含磷酸根的类脂化合物，是组织细胞的基本组成成分，包括鞘磷脂和甘油磷脂两大类。前者主要见于高等动物的红细胞膜中，后者在动物肝脏、脑及卵巢中含量丰富。磷脂不仅具有较高的营养价值，还具有生理调节机能，促进人体新陈代谢、增强免疫力、预防疾病等作用。现在，美国、欧洲、日本等发达国家已将磷脂应用于临床中，预防脑、心、肝、肿瘤等疾病。此外，磷脂还具有乳化、润湿、抗氧化、改善物料粘度、防止淀粉老化等特征，使其在食品工业、轻工、化工等领域有着广泛的应用。目前，市场上磷脂产品主要是大豆磷脂和蛋黄磷脂。大豆磷脂虽然存在广泛，价格低廉，但其脂肪酸组成相对简单，不饱和程度较低；蛋黄磷脂的PC纯度较高，但生产成本高，缺少对人体有益的多不饱和脂肪酸。海产动物来源的磷脂因其侧链中富含EPA和DHA等丰富的ω-3多不饱和脂肪酸，具有显著的降血脂、抗衰老、促进神经传导、提高大脑活力、预防心脑血管疾病，保肝、增强免疫力、抑制肿瘤细胞生长等多种功能，开发利用前景广阔。我国海产品加工废弃物原料丰富，高值化利用市场前景好，但目前尚无规模化生产技术。鱼虾贝等加工下脚料大都用于加工低值产品或作为废弃物处理掉，造成了渔业资源的极大浪费，同时还存在着环境污染的隐患。因此，利用这些下脚料提取精制高经济附加值的多不饱和脂肪酸磷脂，对于提高海洋资源利用价值，突破海产磷脂产业化关键技术意义重大，且具有显著的经济价值和社会意义。鳕鱼广泛分布于世界各大海洋，生活在海洋底层和中下层，是海洋渔业捕捞的主要对象之一。全球鳕鱼总产量较高，约占海洋渔业总产量的12％。现代随着人们对健康水平要求的提高，市场对鱼类产品需求越来越大，促使我国的海洋鱼类加工业迅速发展。目前，我国鳕鱼每年加工量约40～50万吨，鳕鱼的加工会产生大量的加工副产物，如鱼头、内脏、鱼皮等，其重量约占原料鱼的50％左右。这些副产物，特别是鳕鱼内脏，大都用于加工低值产品或作为废弃物直接丢弃，既污染了环境，又造成资源的严重浪费。随着科学技术和工业化的快速发展，鱼类加工下脚料的高值化利用越来越受到重视。鳕鱼内脏含有大量的磷脂、不饱和脂肪酸、蛋白质和维生素等，具有极大的利用空间和利用价值。国内外对磷脂的提取纯化进行了很多的研究，常用的方法有：溶剂提取法、吸附色谱法、超临界萃取法、酶解法、无机盐复合沉淀法、微波提取法、膜分离法等。但是，这些方法存在很多的技术缺陷：原料方面主要从大豆和蛋黄中提取，从而和人类抢夺食物资源；超临界萃取法、膜分离法等工艺较为复杂，操作成本高；无机盐沉淀法引入金属离子(Zn2+、Cd2+等)，具有一定的毒性，影响磷脂的质量；硅胶吸附色谱法，常造成死吸附，填料不易重复利用，易造成环境污染等。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一种操作简便，成本低，安全环保的利用鳕鱼内脏制备高纯度多不饱和脂肪酸磷脂的方法。为了实现上述发明目的，本发明提供的技术方案，一种从鳕鱼内脏中提取高纯度海产多不饱和脂肪酸磷脂的方法，将鳕鱼内脏粉碎，用碱性乙醇液搅拌提取，提取液经包合净化剂脱胆固醇、脱色后得到粗磷脂，粗磷脂经超声强化超临界萃取、聚苯乙烯凝胶柱层析得到高纯度多不饱和脂肪酸磷脂。具体的，包括以下步骤：(1)将鳕鱼内脏粉碎，加入85～100％的碱性乙醇液搅拌提取2～3次，每次2～4小时，合并提取液，用盐酸调pH值到中性；(2)提取液中加入包合净化剂,搅拌30～50min，离心取上清液，于低于50℃下减压浓缩，得到脱胆固醇的粗磷脂；(3)粗磷脂用少量无水乙醇溶解，用适量活性白土分散，挥干溶剂，进行超声强化超临界CO2提取，超声频率为10～25KHz，萃取温度为20～24℃，萃取压力为20～26Mpa,萃取时间为1～2.5h，CO2流量为10～15L/h，萃取结束后收集总磷脂；(4)总磷脂用少量二氯甲烷溶解后，过滤，经Bio-BeadsS-X2聚苯乙烯凝胶柱层析，环己烷洗脱除去小极性杂质后，环己烷-乙酸乙酯洗脱剂洗脱，收集洗脱液，薄层色谱检测后，合并洗脱液，于低于50℃下减压浓缩，干燥，得到精制磷脂。其中：所述的鳕鱼内脏，包括生殖腺(卵和鱼白)、心脏、肝脏、胃和肠等；所述的原料与碱性乙醇液按照质量体积比1:6～1:12混合；所述的碱性乙醇液为向乙醇液中添加碱性物质，使其pH达到9.0～10.0，碱性物质为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠或醋酸钠等。所述的包合净化剂为β-环糊精和活性炭的混合物，其中，β-环糊精和活性炭的重量比例为1:10，两者直接混合即可；包合净化剂用量为每1000mL提取液中加入10～40g包合净化剂；所述步骤(2)中离心转速为3000～5000rpm。所述步骤(3)中活性白土的用量为粗磷脂重量的2～4倍，超声频率为18～24KHz，萃取温度为20～24℃，萃取压力为22～24Mpa，萃取时间为1.5～2h，CO2流量为10～15L/h；所述步骤(4)中洗脱剂为环己烷-乙酸乙酯按照1:1比例混合后的溶剂，洗脱速度为每小时0.5～1.5倍柱体积。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)利用鳕鱼加工下脚料，进行废物利用，一方面解决大量剩余海洋副产物资源的浪费问题，减少环境污染；另一方面丰富了磷脂的制备来源，且原料来源广泛廉价，降低了磷脂提取成本，具有重要的生态、经济和社会意义；(2)提取过程中通过向乙醇中添加碱性物质，对磷脂起到增溶作用，提高了磷脂的收率；(3)提取过程中温度均控制在50℃以下，避免丧失磷脂的生理活性，适合海产多不饱和脂肪酸磷脂的提取；(4)提取过程操作简便，提取效率高；柱层析所用填料机械强度好，死吸附少，可重复使用。(5)净化过程中采用β-环糊精和活性炭组成的包合净化剂，除去胆固醇的同时进行脱色，快速高效的达到净化的目的。(6)超临界萃取过程中采用更低的萃取温度、更低的萃取压力，但是却具有更短的萃取时间，萃取率得到明显提高，节约能源，降低成本；(7)本发明方法得到的鳕鱼内脏高纯度多不饱和脂肪酸磷脂，磷脂的纯度大于等于97％。附图说明图1为本发明实施例1至实施例4得到的高纯度磷脂薄层层析结果图：其中图1中1、2、3、4分别为实施例1、2、3、4对应的层析结果。图2为磷酸二氢钾的标准曲线。图3为实施例1得到的高纯度磷脂气质色谱分析结果。具体实施方式下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。实施例1称取100g冷冻鳕鱼内脏，用组织粉碎机粉碎，加入1000mL90％的乙醇液(醋酸钠使其pH为9.0)，室温下搅拌提取2小时，减压抽滤得到提取液；滤渣加入相同碱性乙醇液重复搅拌提取1次，抽滤得到提取液，合并两次提取液，盐酸调节pH至中性；提取液中加入22g包合净化剂(净化剂中β-环糊精与活性炭的重量比为1:10)，搅拌30min，静置后离心10min，取上清液于47℃下减压浓缩去除溶剂得到粗磷脂；粗磷脂用少量无水乙醇溶解后，用3倍粗磷脂重量的活性白土分散，挥干溶剂，投入萃取釜中，在频率为24KHz的超声条件下进行强化超临界CO2萃取得到总磷脂，其萃取条件为：萃取压力为22MPa，萃取时间为90min，萃取温度为20℃，CO2流量为15L/h；少量二氯甲烷溶解总磷脂，过滤后，滤液上Bio-BeadsS-X2层析柱，环己烷洗脱除去小极性杂质后，环己烷-乙酸乙酯按比例1:1等度洗脱，流速为每小时1.0倍柱体积，用薄层层析法检识，展开剂为10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-无水乙醇-三乙胺-水体系，根据Rf值和显色特征来判断、合并含磷脂部分，45℃减压浓缩洗脱液，真空干燥后得到高纯度磷脂，其收率为2.8％(对投料冷冻鳕鱼内脏计)，磷脂纯度为97.17％。产品经薄层检测分析，结果如图1中1所示，图中可以看出，所提取的鳕鱼内脏磷脂中主要组分包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷酯酰丝氨酸(PS)、双磷脂酰甘油(CP)及鞘磷脂(SM)等。取本实施例得到的高纯度磷脂样本50mg，加200μL水，匀浆三次，每次5500RPM，20秒，氮气保护。加400μLMTBE、80μL甲醇和200μL水。涡旋30秒，超声10分钟。离心15min，取上层MTBE层蒸干。用100μL二氯甲烷：甲醇(1:1)复溶后进行HPLC-MS分析，经鉴定其所含各类磷脂中主成分结构为PC(16:0/18:1)，PE(18:0p/20:5)，CP(18:2/18:2/18:2/18:2)，SM(d18:1/14:0)，LPC(18:1)，LPE(20:5)，LPI(20:5)，PA(18:0/20:5)，PG(16:0/20:2)，PI(18:0/20:5)，PS(18:0/20:5)。实施例2称取100g冷冻鳕鱼内脏，组织粉碎机粉碎后加入600mL95％的乙醇液(碳酸氢钠调节其pH为10.0)，室温下搅拌提取4小时，减压抽滤得到提取液；滤渣加入相同碱性乙醇液重复搅拌提取2次，每次提取4小时，抽滤得到提取液，合并提取液，盐酸调节pH至中性；向提取液中加入36g包合净化剂(净化剂中β-环糊精与活性炭的重量比为1:10)，搅拌30min，静置后离心10min，取上清液于45℃下减压浓缩去除溶剂，得到粗磷脂；粗磷脂用少量无水乙醇溶解后，用2倍粗磷脂重量的活性白土分散，挥干溶剂，投入萃取釜中，在频率为22KHz的超声条件下进行强化超临界CO2萃取得到总磷脂，其萃取条件为：萃取压力为23MPa，萃取时间为2小时，萃取温度为23℃，CO2流量为12L/h；总磷脂用少量二氯甲烷溶解，过滤后，滤液上Bio-BeadsS-X2层析柱，环己烷洗脱除去小极性杂质后，环己烷-乙酸乙酯按比例1:1洗脱，流速为每小时0.5倍柱体积，用薄层层析法检识，展开剂为10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-无水乙醇-三乙胺-水体系，根据Rf值和显色特征来判断、合并含磷脂部分，43℃减压浓缩洗脱液，真空干燥，得到高纯度磷脂，其收率为3.4％(对投料冷冻鳕鱼卵计)，磷脂纯度为98.54％。产品经薄层检测分析，结果如图1中2所示。实施例3称取100g冷冻鳕鱼内脏，用组织粉碎机进行粉碎，加入1200mL碱性乙醇(碳酸氢钠调节其pH为10.0)，室温下搅拌提取4小时，减压抽滤得到提取液；滤渣加入相同碱性乙醇重复搅拌提取1次，抽滤得到提取液，合并提取液，盐酸调节pH至中性；向提取液中加入72g包合净化剂(净化剂中β-环糊精与活性炭的重量比为1:10)，搅拌40min，离心10min，取上清液于43℃下减压浓缩去除溶剂，得到粗磷脂；粗磷脂用少量无水乙醇溶解后，用4倍粗磷脂重量的活性白土分散，挥干溶剂，投入萃取釜中，在频率为20KHz的超声条件下进行强化超临界CO2萃取得到总磷脂，其萃取条件为：萃取压力为22MPa，萃取时间为100min，萃取温度为24℃，CO2流量为10L/h；少量二氯甲烷溶解总磷脂，过滤后，滤液上Bio-BeadsS-X2层析柱，环己烷洗脱除去小极性杂质后，环己烷-乙酸乙酯按1:1的比例进行洗脱，流速为每小时1.5倍柱体积，用薄层层析法检识，展开剂为10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-无水乙醇-三乙胺-水体系，根据Rf值和显色特征来判断、合并含磷脂部分，43℃减压浓缩洗脱液，于低于50℃下真空干燥，得到高纯度磷脂，其收率为3.9％(对投料冷冻鳕鱼卵计)，磷脂纯度为97.81％。产品经薄层检测分析，结果如图1中3所示。实施例4称取100g冷冻鳕鱼卵，组织粉碎机进行粉碎，加入800mL85％的乙醇液(醋酸钠调节其pH为9.5)，室温下搅拌提取3小时，减压抽滤得到提取液；滤渣加入相同碱性乙醇液重复搅拌提取2次，抽滤得到提取液，合并提取液，盐酸调节pH至中性；向提取液中加入96g包合净化剂(净化剂中β-环糊精与活性炭的重量比为1:10)，搅拌50min，离心10min后取上清液，于48℃下减压浓缩去除溶剂，得到粗磷脂；粗磷脂用少量无水乙醇溶解后，用3倍粗磷脂重量的活性白土分散，挥干溶剂，投入萃取釜中，在频率为18KHz的超声条件下进行强化超临界CO2萃取得到总磷脂，其萃取条件为：萃取压力为24MPa，萃取时间为110min，萃取温度为21℃，CO2流量为14L/h；少量二氯甲烷溶解总磷脂，过滤后，滤液上Bio-BeadsS-X2层析柱，环己烷洗脱除去小极性杂质后，环己烷-乙酸乙酯按1:1的比例进行洗脱，流速为每小时1.0倍柱体积，用薄层层析法检识，展开剂为10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-无水乙醇-三乙胺-水体系，根据Rf值和显色特征来判断、合并含磷脂部分，43℃减压浓缩洗脱液，真空干燥，得到高纯度磷脂，其收率为3.2％(对投料冷冻鳕鱼卵计)，磷脂纯度为97.52％。产品经薄层检测分析，结果如图1中4所示。对比例1称取冷冻鳕鱼卵，组织粉碎机进行粉碎，分成相等重量2份，各100g，一份加入800mL85％的碱性乙醇液(醋酸钠调节其pH为9.5)，一份加入800mL85％的乙醇液，然后其他提取分离参数与实施例4相同，制备为相应的磷脂产品，得到的磷脂纯度和产品收率如表1所示。可见，相同的原料和制备过程，碱性物质的添加有利于磷脂的提取。表1中性乙醇提取碱性乙醇提取磷脂收率1.6％3.2％磷脂纯度79.89％97.52％对比例2称取冷冻鳕鱼卵200g，组织粉碎机进行粉碎，加入2000mL90％的乙醇液(醋酸钠使其pH为9.0)，室温下搅拌提取2小时，重复搅拌提取1次，提取液调节pH至中性，加入包合净化剂，搅拌30min，静置后离心取上清液于47℃下减压浓缩去除溶剂得到粗磷脂。粗磷脂分为相等重量2份，一份进行超声强化超临界CO2萃取，一份进行普通超临界CO2萃取，，实验结果如表2所示。可见，超声强化超临界萃取采用更低的萃取温度和萃取压力，却在更短的萃取时间里，提高产品的收率和磷脂纯度，达到节能高效的目的。表2超声强化超临界CO2萃取常规超临界CO2萃取萃取压力24MPa30MPa萃取温度20℃35℃萃取时间90min120minCO2流量15L/h20L/h超声辅助是否收率2.7％1.3％磷脂纯度97.09％89.39％试验例①测定方法采用分光光度法(钼蓝比色法)测定磷脂的含量。做出的磷酸二氢钾的标准曲线，如附图2所示。准确量取0.3mL磷脂样品溶液(0.5mg/mL的二氯甲烷溶液)置于10mL的刻度试管中(空白对照量取0.3mL二氯甲烷溶剂)，水浴挥干溶剂，加入4滴浓硫酸、3滴高氯酸于电炉上消化至无色澄清，冷却后补水至2mL，加入1滴酚酞指示剂，用50％氢氧化钠溶液中和至溶液显红色，缓慢滴加稀硫酸(5/200，v/v)使红色消失，补水至5mL，摇匀，依次加入1.0mL调节酸度的硫酸，摇匀，1.0mL钼酸铵溶液，摇匀，0.6mL抗坏血酸溶液，补水至10mL，加塞混匀，迅速放入70℃的水浴中显色30min取出置冷水中冷却10min,以0mL为参比，在波长820nm处测定吸光值，代入标准曲线，得到无机磷的含量，再乘以系数26.3即得总磷脂的含量。②脂肪酸成分分析量取甲醇110mL，缓慢加入氯化乙酰21.5mL，冰浴中搅拌混匀，加完后封口，冰藏，作为反应液备用。另取5mg实施例1得到的高纯度磷脂样品，置于5mL安培管中，滴3滴苯，溶解样品，加5ml上述反应液，振荡，封口，100℃水浴1h。取出反应液，按照1:5加入正己烷萃取，收集正己烷层，浓缩，进行GC-MS分析，结果如图3所示。该结果说明本发明得到的鳕鱼内脏磷脂中富含多不饱和脂肪酸EPA和DHA，相比大豆磷脂和蛋黄磷脂具有更大的营养价值和药用价值。以上所述，仅是本发明的优选实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是在未脱离本发明原理的前提下，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。当前第1页1 2 3