本发明涉及的是一种微生物发酵工艺，尤其涉及的是一种利用瘤胃液生产维生素B12的稻草发酵培养基及其方法和应用。
背景技术：
瘤胃是反刍动物独特的消化器官，瘤胃内营养丰富，温度适宜，且瘤胃液中含有大量的微生物，因此反刍动物瘤胃是一个天然的发酵罐。瘤胃微生物对营养物质的分解和合成作用称为瘤胃发酵，产物主要是氨基酸、NH3、挥发性脂肪酸、B族维生素等，瘤胃微生物依靠瘤胃内饲料的营养物质生存和繁殖，而反刍动物又依靠瘤胃微生物的发酵物进行生存。反刍动物与瘤胃微生物之间形成密切的共生关系，而瘤胃微生物相互之间相互制约，维持着微生物区系生态系统的协调(司振书,江成,瘤胃微生物对纤维素的降解及其应用,微生物学杂志,2003)。瘤胃微生物主要有厌氧细菌、原虫、真菌等。通过微生物纯培养，可以分离得到纯种菌株，并可以获得其生长代谢的详细资料，然而纯培养并没有考虑微生物群居生活方式及相互影响的重要性。一般而言，降解有机物质，尤其是植物细胞壁成分，如纤维素，需要微生物间的相互作用，其降解过程是由高度分化的专性微生物群对底物协同降解的过程。菌种之间的协同作用和相互依赖程度并不相同，它们可以从极简单的养分的交差，如维生素、碳源和能源到极特殊的完全依赖，电子传递就是瘤胃微生物相互作用的典型例子。
维生素B12又称为钴胺素或氰钴素，是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素。自然界中的维生素B12都是由微生物合成的，高等动植物自身不能合成。维生素B12是几种变位酶的辅酶，常以辅酶的形式参与多种代谢过程，促进蛋白质和核酸的合成，促进红细胞的发育和成熟，促进脂肪、碳水化合物和蛋白质的代谢，维持神经系统功能的健全，临床上可以用于预防和治疗恶性贫血、末梢神经炎、脊髓炎等(王华等,维生素B12功能及营养作用研究,中国食物与营养,2007)。在饲料工业方面，大多数动物的植物性饲料中不含维生素B12，其生长发育所需的维生素B12，一方面来源于消化道中的微生物的合成，另一方面来源于外界的添加。猪、鸡等非反刍动物缺乏维生素B12主要表现在生长发育停滞、贫血、繁殖率降低等。饲料维生素B12能预防怀孕母猪贫血，促进家禽家畜，特别是幼禽幼畜的生长发育，提高饲料蛋白的利用率，预防和治疗由于维生素B12缺乏引起的非反刍动物的贫血和生长发育不良，缺钴地区反刍动物的地方性消瘦病等。
目前在工业制造中，微生物发酵法是获得微生素B12的主要途径，且大部分产品被用于动物饲料添加剂。瘤胃微生物有很强的分解纤维素的能力(李莉,侯先志,瘤胃纤维素分解菌的研究进展,黄牛杂志,2002)，而且能合成维生素B12。植物秸秆资源丰富，目前不能被充分利用，不但造成资源浪费，还对环境造成一定的污染。目前，可利用植物秸秆等资源进行微生物发酵生产维生素等，将植物秸秆变废为宝，实现废物利用，具有重要的应用价值。但是，目前，利用植物秸秆生产维生素时，收率较低，而目前尚无利用植物秸秆定向生产维生素B12的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用瘤胃液生产维生素B12的稻草发酵培养基及其方法和应用，以提供一种利用稻草等废弃物定向生产维生素B12的方法，提高维生素B12的得率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种利用瘤胃液生产维生素B12的稻草发酵培养基，所述稻草发酵培养基包括干稻草粉和营养盐溶液，所述营养盐溶液的配方包括：尿素为50g/L，ZnCl2·2H2O为0.25g/L，MnCl2·4H2O为0.04g/L，CoCl2·6H2O为0.5g/L，NH4HCO3为5g/L，NaHCO3为0.5g/L，Na2HPO4·12H2O为0.45g/L，KH2PO4为0.32g/L，MgSO4·7H2O为0.06g/L。
进一步地，每10L营养盐溶液中，干稻草粉的添加量为6kg。
本发明提供了一种利用上述稻草发酵培养基生产维生素B12的方法，包括以下步骤：
(1)将稻草干燥后粉碎，获得干稻草粉；
(2)按配方进行称取，制备营养盐溶液，所述配方包括：尿素为50g/L，ZnCl2·2H2O为0.25g/L，MnCl2·4H2O为0.04g/L，CoCl2·6H2O为0.5g/L，NH4HCO3为5g/L，NaHCO3为0.5g/L，Na2HPO4·12H2O为0.45g/L，KH2PO4为0.32g/L，MgSO4·7H2O为0.06g/L：
(3)将干稻草粉与营养盐溶液混合，获得稻草发酵培养基；
(4)取健康牛的瘤胃液，加入稻草发酵培养基中进行厌氧发酵，所述厌氧发酵的条件为：温度为38-39℃，发酵时间为168h，即制备获得富含维生素B12的发酵基。
进一步地，所述瘤胃液的制备方法，包括以下步骤：
Ⅰ)选择1头健康的皖北黄牛作为试验动物，禁食24h，禁水12h，无菌法安装瘘管并术后护理；
Ⅱ)每次饲喂前向安装瘘管的皖北黄牛瘤胃取内容物，迅速搅拌并用四层纱布过滤，滤液保存于充满二氧化碳的塑料瓶中，即得瘤胃液；此步操作要迅速，尽量减少瘤胃液与氧气的接触。
本发明还提供了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂为利用上述稻草发酵培养基生产维生素B12的方法制备获得的富含维生素B12的发酵产物，该饲料添加剂中不仅还有丰富的维生素B12还含有多种益生菌，将其直接添加在畜禽饲料中，可以作为生血剂，预防和治疗畜禽贫血症，也可以促进畜禽，特别是幼禽幼畜的生长发育，提高饲料蛋白的利用率，预防和治疗由于维生素B12缺乏引起的非反刍动物的贫血和生长发育不良等。
本发明还提供了上述饲料添加剂在预防和治疗畜禽贫血病中的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种利用瘤胃液生产维生素B12的稻草发酵培养基及其方法和应用，该发明利用反刍动物瘤胃的生理特点(即其中的微生物菌群能够消化分解纤维素，转化为能够被宿主动物利用的糖类及维生素等物质),利用瘤胃液中的微生物菌群来发酵稻草粉，将其转化为富含维生素B12的发酵饲料。与维生素B12的传统生产相比，本发明生产的维生素B12不需要提纯，可以在发酵饲料中直接使用，简化了生产工艺。同时该发明将稻草秸秆转化为可被动物直接利用的营养物质，原料来源广泛，变废为宝，降低了生产成本，保护了环境。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1稻草粉的制备
将稻草干燥后，获得干稻草，将干稻草粉碎，过40目筛，获得稻草粉。
2.2营养盐溶液的制备
分别称取尿素500g，ZnCl2·2H2O为2.5g；MnCl2·4H2O为0.4g，CoCl2·6H2O为5.0g，NH4HCO3为50g，NaHCO3为5.0g,Na2HPO4·12H2O为4.45g，KH2PO4为3.2g MgSO4·7H2O为0.6g，溶于10L蒸馏水中，得营养盐溶液。
2.3稻草发酵培养基的制备
称取稻草粉6kg，与10L营养盐溶液混合均匀，即得稻草发酵培养基。
2.4瘤胃液的制备
2.4.1选择1头健康的皖北黄牛作为试验动物，禁食24h，禁水12h，无菌法安装瘘管并术后护理；
2.4.2每次饲喂前向安装瘘管的皖北黄牛瘤胃取内容物，迅速搅拌并用四层纱布过滤，滤液保存于充满二氧化碳的塑料瓶中，即得瘤胃液；此步操作要迅速，尽量减少瘤胃液与氧气的接触。
2.5发酵反应
抽取1L瘤胃液，与8kg稻草发酵培养基一同加入到10L的厌氧发酵罐中，调节发酵温度为38-39℃进行固体发酵，发酵168h后完成反应，获得发酵基。
3结果检测
3.1维生素B12的含量测定：
按照紫外-可见分光光度法进行测定，步骤包括：
3.1.1配置标准溶液：所述标准溶液维生素B12的含量为25μg/ml；
3.1.2配置样品溶液：避光操作，精密称取样品0.02g，用少量的蒸馏水溶解，倒入500ml容量瓶，并定容至刻度线，摇匀，用0.45μm滤膜过滤。将空白液(纯化水)与样品液分别盛于1cm厚的石英比色皿中，用紫外-可见分光光度计测量其在361nm处的吸光值A样，维生素B12的吸收系数按207计算，即得。
3.1.3计算：根据比尔定律，得出样品的比吸光系数为：
E样＝A样/C样*L＝A样/0.0025
样品中维生素B12的含量(质量百分比)为：
维生素B12的含量％＝E样/E标×100％＝E样/207×100％
3.2对照试验
在上述步骤2方法的基础上，以步骤2所述方法为实验组，同时设置对照组，对照组中，用等体积的蒸馏水代替营养盐溶液，其它条件同实验组。
试验设计如下表1所示：
表1：盐溶液对瘤胃液发酵生产维生素B12的影响设计表
发酵168h后，对实验组和对照组发酵产物分别取样，测定其维生素B12的含量。测定结果显示，实验组维生素B12的含量为0.0321％，对照组维生素B12的含量为0.0084％。由测定结果可看出，本发明利用瘤胃液体外发酵稻草粉能产生大量的维生素B12，说明营养盐溶液能显著提高维生素B12的产量。
4、应用
将步骤2所述方法制备获得的发酵产物按照每顿饲料中添加10-20g的量加入母猪饲料中，对10头具有贫血症的妊娠母猪进行饲喂，连续饲喂1个月后，检测试验母猪血液中血红蛋白含量是否达到正常妊娠母猪血液中血红蛋白水平。结果证明，该发酵产物作为母猪饲料添加剂，对妊娠母猪的贫血症具有一定疗效，10头试验母猪中，有9头母猪的血液中血红蛋白含量达到正常妊娠母猪血液中血红蛋白水平，贫血症得到缓解。
本发明的发酵产物中富含大量维生素B12(0.0321％)，可直接作为畜禽的饲料添加剂添加至饲料中，具有预防和治疗由于维生素B12缺乏引起的非反刍动物的贫血和生长发育不良，及生血等作用，可直接用于预防和治疗妊娠母猪贫血症，也可促进家禽家畜，特别是幼禽幼畜的生长发育。本发明利用发酵技术将稻草秸秆转化为可被动物直接利用的营养物质，产物不需要提纯即可直接作为饲料添加剂使用，简化了生产工艺，该发酵产物中还含有丰富的益生菌，营养价值丰富，可提高饲料蛋白的利用率。利用稻草发酵，原料来源广泛，将稻草变废为宝，降低了生产成本，保护了环境。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。