本发明属于化学药物领域，涉及环二肽及其制备方法和应用。
背景技术：
：环二肽(cyclicdipeptides)又叫2,5-二酮哌嗪的衍生物，该类化合物在人、脊椎动物、无脊椎动物、植物、细菌和真菌中均有发现。由于环二肽形成一个稳定的六元环结构，具有一定的构象约束作用，有两个氢键给体和两个氢键受体，氢键是药物与受体相互作用的主要方式之一，因此环二肽在药物化学中是一个重要的药效团。目前发现很多环二肽具有强的生理活性，例如具有植物生长调节剂作用、抗肿瘤活性、抗菌及提高免疫功能。美洲大蠊(periplanetaamericana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，是世界上生命力最强、最古老，至今繁衍最成功的昆虫类群之一。美洲大蠊是传统的中药材，入药始载于《神农本草经》，被列为中品，谓“味咸、寒”。众多研究表明，美洲大蠊中的化学成分主要分为两大类。第一类为信息素是大蠊向体外释放的具有挥发性的信息素成分，主要包括性信息素和聚集信息素。第二类为氨基酸和各种昆虫神经肽，是存在于其机体内的化学成分。本发明人对美洲大蠊乙醇提取物的水部分的化学成分进行了研究，分离并鉴定了2个环二肽，这2个环二肽系新的天然产物，是首次从美洲大蠊中分离得到的。经研究发现这两个环二肽具有创面修复的功能。技术实现要素：本发明所述的用于创面修复的环二肽为环-(酪氨酸-苏氨酸)、环-(酪氨酸-天冬氨酸)中的任意一种。所述的环-(酪氨酸-苏氨酸)、环-(酪氨酸-天冬氨酸)的结构式分别为：本发明还提供了环二肽的药物组合物，所述药物组合物包括环-(酪氨酸-苏氨酸)或环-(酪氨酸-天冬氨酸)中的任意一种，或其药学上可接受的衍生物及其盐类。进一步的，所述药物组合物为药物制剂，由环-(酪氨酸-苏氨酸)或环-(酪氨酸-天冬氨酸)中的任意一种，或其药学上可接受的衍生物及其盐类作为活性成分和药学上可接受的赋形剂组成。其中固体制剂包括：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；半固体制剂包括软膏剂、栓剂等；液体制剂包括：溶液剂、注射剂、喷雾剂等；眼用制剂包括：滴眼剂、眼用凝胶剂等。本发明还公布了环二肽的制备方法：a.取美洲大蠊粉碎置于70～95％的乙醇中浸泡12h，回流提取2～3次，浓缩至无醇味，获得提取液，往提取液中加入水，混合均匀后，静置，冷却，过滤，减压浓缩至大蠊重量的0.1～0.2倍，得到总提取液；b.总提取液行mcigelchp20p柱梯度洗脱得11个组分，分别为f1～f11，流动相为甲醇-水，洗脱流程为：0min，甲醇：水的体积比为20％：80％到40min，甲醇：水的体积比为100％：0％，洗脱流速为1ml/min；f4经rp-18柱得6个组分，分别为f4.1～f4.6，流动相为甲醇-水，洗脱流程为：0min，甲醇：水的体积比为10％：90％到30min，甲醇：水的体积比为100％：0％，洗脱流速为0.5ml/min；将f4.2经sephadexlh-20凝胶色谱过滤和半制备hplc得环-(酪氨酸-苏氨酸)和环-(酪氨酸-天冬氨酸)。进一步的，所述的sephadexlh-20凝胶色谱以甲醇-水等体积混合液为流动相，流速为10ml/min。进一步的，所述的半制备hplc的色谱柱为zorbaxsb-c18，流动相甲醇：水＝40：60，流速3ml/min。进一步的，所述的环二肽是通过从美洲大蠊中提取获得或通过人工合成获得。本发明还公开了环二肽在治疗创面愈合中的应用，所述的创面包括烧烫伤创面、体外创伤创面、胃溃疡创面、压疮创面等。本发明的有益效果：1.本发明首次公开了从美洲大蠊中提取分离所述的2个环二肽的方法。2.本发明所述的2个环二肽系新的天然产物，是首次从美洲大蠊中分离鉴定得到的。3.本发明所述的2个环二肽通过小鼠胃溃疡实验与小鼠压疮实验，结果显示本发明所述的2个环二肽具有良好的创面修复作用，且具有治疗效果明显，创面愈合速度快的优点。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步描述。实施例1本发明所述环二肽的提取分离及结构鉴定美洲大蠊来源于四川好医生攀西药业有限责任公司美洲大蠊gap基地，美洲大蠊提取物是康复新液的主要成分。取25kg美洲大蠊粉碎置于70～95％的乙醇中浸泡12h，回流提取2～3次，浓缩至无醇味，获得提取液，往提取液中加入水，混合均匀后，静置，冷却，过滤，减压浓缩得到总提取液2.5kg。总提取液经mcigelchp20p柱梯度洗脱得11个组分，分别为f1～f11，流动相为甲醇-水，洗脱流程为：0min，甲醇：水的体积比为20％：80％到40min，甲醇：水的体积比为100％：0％，洗脱流速为1ml/min；f4经rp-18柱得6个组分，分别为f4.1～f4.6，流动相为甲醇-水，洗脱流程为：0min，甲醇：水的体积比为10％：90％到30min，甲醇：水的体积比为100％：0％，洗脱流速为0.5ml/min；将f4.2经sephadexlh-20凝胶过滤，以甲醇-水等体积混合液为流动相，流速为10ml/min。再行半制备hplc得环-(酪氨酸-苏氨酸)(540mg)，环-(酪氨酸-天冬氨酸)(480mg)，半制备hplc的色谱柱为zorbaxsb-c18，流动相甲醇：水＝40：60，流速3ml/min。其中，化合物20环-(酪氨酸-苏氨酸)和化合物21环-(酪氨酸-天冬氨酸)的化学结构如下所示：分离得到的这两个化合物的结构解析分别如下：环-(酪氨酸-苏氨酸)：淡黄色固体，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:7.99(1h,s,h-1/4),7.78(1h,s,h-1/4),6.96(2h,d,j＝8.3hz,h-11,h-15),6.66(2h,d,j＝8.3hz,h-12,h-14),3.84(1h,m,h-7),3.68(1h,m,h-6),3.50(1h,m,h-3),2.96(2h,m,h-9),0.97(3h,d,j＝6.5hz,h-8)；13cnmr(150mhz,dmso-d6)δ:167.5(c-2),166.6(c-5),156.0(c-13),130.7(c-11,c-15),127.2(c-10),115.0(c-12,c-14),67.2(c-7),60.3(c-3),56.1(c-6),40.0(c-9),19.7(c-8)。环-(酪氨酸-天冬氨酸)：淡黄色固体，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.00(1h,s,13-oh),7.62(1h,s,h-1/4),7.62(1h,s,h-1/4),6.96(2h,d,j＝8.0hz,h-11,h-15),6.66(2h,d,j＝8.2hz,h-12,h-14),4.08(1h,m,h-6),4.02(1h,m,h-3),2.98(1h,dd,j＝4.6,13.7hz,hb-9),2.81(1h,dd,j＝4.6,13.7hz,ha-9),2.32(1h,dd,j＝4.0,15.7hz,hb-7),1.52(1h,dd,j＝8.7,15.7hz,ha-7)；13cnmr(150mhz,dmso-d6)δ:171.7(c-8),166.9(c-2),166.5(c-5),156.2(c-13),131.1(c-11,c-15),126.2(c-10),115.0(c-12,c-14),55.4(c-6),51.2(c-3),38.2(c-9),37.4(c-7)。上述实验所用试剂均可在市上购买得到。实施例2本发明所述的环二肽在溃疡中的应用1、实验材料1.1样品：按实施例1制得样品：环-(酪氨酸-苏氨酸)、环-(酪氨酸-天冬氨酸)1.2实验动物：km小鼠，18～22g，120只，雌雄各半。sd大鼠，200～220g，180只，雌雄各半。1.3实验试剂：盐酸雷尼替丁胶囊、达喜(铝碳酸镁片)2、样品对胃溃疡粘膜的保护功能评价方法2.1无水乙醇致小鼠胃粘膜损伤模型试验40只km小鼠按性别与体重随机分组(详见表1)，各组给予相应的药物，各组小鼠给药连续10天，第9天给药后禁食24h，自由饮水。每组的小鼠在末次给药3h后，所有小鼠给予0.2ml无水乙醇进行灌胃，1小时后处死动物，结扎幽门，1％甲醛固定，观察并评定溃疡指数(标准：条索状损伤的长度大于1mm者，测定其长度，每毫米计1分，其宽度大于1mm者计分加倍，长度与宽度均小于1mm，计0.5分，将计分相加即为该鼠的溃疡指数)并计算溃疡抑制百分率。重复试验3次。2.2乙酸致大鼠慢性胃溃疡模型试验除假手术组(12只)，其余大鼠采用10％醋酸按0.05ml/只平刺于胃浆膜下0.4-0.5mm造模。术后造模大鼠进一步分组(详见表2)，并于第2日开始给药，每日1次，各组给药14天，末日给药后禁食禁水一夜后处死动物。以游标卡尺测定溃疡最大长径及垂直于最大长径的最大宽径。计算溃疡指数(溃疡指数＝溃疡最大长径×垂直于最大长径的最大宽径)及溃疡抑制率。重复试验3次。3、样品对胃溃疡粘膜的保护功能评价结果3.1样品对无水乙醇致小鼠胃粘膜损伤的影响表1样品对无水乙醇致小鼠胃粘膜损伤的影响(第一次)组别给药天数n溃疡指数抑制率(％)对照组(生理盐水)101045.0±4.87/阳性组(雷尼替丁)101027.7±4.33*38.44实施例1环-(酪氨酸-苏氨酸)101015.8±5.56*#64.89实施例1环-(酪氨酸-天冬氨酸)101014.9±5.78*#66.89注：*：p<0.001与对照组比较；#：p<0.05与阳性组比较结果显示，与对照组比较，实施例1制备的环二肽均可使无水乙醇致小鼠胃粘膜损伤的溃疡指数明显降低，具有统计学意义(p<0.001)；与阳性组(雷尼替丁)比较，实施例1制备的环二肽在溃疡指数的抑制效果上明显高于雷尼替丁的治疗(p<0.05)。实验结果中还显示本发明所述的2种环二肽对无水乙醇致胃粘膜损伤有较好的保护作用。其余两次的重复试验结果与表1中的结果趋势一样，不做进一步说明。3.2样品对乙酸致大鼠慢性胃溃疡模型的影响表2样品对乙酸致大鼠慢性胃溃疡模型的影响(第一次)组别给药天数n溃疡指数(cm2)抑制率(％)假手术组(生理盐水)14120.0000±0.000/模型组(生理盐水)14120.0842±0.0274/阳性组(达喜)14120.0413±0.0278*50.95实施例1环-(酪氨酸-苏氨酸)14120.0271±0.0057*67.81实施例1环-(酪氨酸-天冬氨酸)14120.0258±0.0147*69.36注：*表示与模型组比较p<0.05由表2显示，实施例1制备的环二肽对大鼠的溃疡指数与模型组比较有明显统计学意义(p＜0.05)，与达喜治疗组(阳性组)比较，实施例1制备的环二肽在治疗大鼠胃溃疡的效果上最优。其余两次的重复试验结果与表1中的结果趋势一样，不做进一步说明。3.3功能评价结果由上述实验结果表明：本发明实施例1中所述的环二肽对急、慢性胃溃疡的黏膜具有修复作用，且疗效显著，溃疡抑制率高。与普通药物相比，缩短了治疗时间。实施例3本发明所述的环二肽对小鼠压疮修复的实验研究1.实验材料1.1样品环-(酪氨酸-苏氨酸)：取实施例1中制备的环-(酪氨酸-苏氨酸)0.4g，加入5ml无菌水混合均匀，再加入吐温-800.10g作为增溶剂制备得到环-(酪氨酸-苏氨酸)溶液。环-(酪氨酸-天冬氨酸)：取实施例1中制备的环-(酪氨酸-天冬氨酸)0.4g，加入5ml无菌水混合均匀，再加入吐温-800.10g作为增溶剂制备得到环-(酪氨酸-天冬氨酸)溶液。肤创宁(上海效佳生物有限公司)1.2动物12周balb/c小鼠88只，均为雄性，spf级，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。2.小鼠压疮创面修复的试验方法2.1实验编号与分组将88只试验小鼠随机分为4组，每组22只。分为模型对照组、阳性对照组、实施例1环-(酪氨酸-苏氨酸)组、实施例1环-(酪氨酸-天冬氨酸)组。2.2造模方法小鼠自由饮水，标准膳食，小鼠适应性生活2周后，体外用一对圆形铁氧体磁片夹起小鼠背部厚约5mm皮肤，磁通量密度1000高斯，直径12mm，厚5mm，重2.4g，皮肤桥之间两磁片产生约50mmhg的持续压力。夹起12h后松开12h，经过三个“缺血-再灌注”周期，缺血时间总计36h。“缺血-再灌注”周期中为了避免小鼠背部磁铁互相干扰，小鼠单笼喂养。“缺血-再灌注”后第三天，参照美国国家压疮指导专家组提出的压疮六期分类标准，肉眼观察到小鼠背部皮肤表皮层或真皮层部分表层或部分破损，表现为水肿或者干燥的浅表溃疡，压疮早期模型(ⅰ、ⅱ期)制备成功。每只小鼠制模所用磁片大小一致，背部定位一致，以保证初始压疮面积大小基本一致。在本实验中，造模成功后，四组小鼠压疮面积经硫酸铜板纸测量后，经统计分析无明显统计学意义，即基本上不同组间小鼠初始压疮面积是一致的。2.3处理措施四组小鼠换药时均以无菌生理盐水清创，无菌操作剪去翘起的坏死组织或易脱落的痂壳。模型对照组采用生理盐水均匀喷洒于创面；阳性组使用肤创宁液均匀喷洒于创面；环-(酪氨酸-苏氨酸)组采用环-(酪氨酸-苏氨酸)均匀喷洒于创面；环-(酪氨酸-天冬氨酸)组采用环-(酪氨酸-天冬氨酸)均匀喷洒于创面。喷洒完后，四组小鼠的创面均再覆盖喷湿内层的四层无菌纱布，用胶带包绕小鼠身体两圈进行固定。每天定时换药一次，观察溃疡面愈合情况。2.4创面愈合率检测于换药后0d、3d、7d、14d测量小鼠压疮面积，由于创面可能是不规则愈合，用透明玻璃纸贴在压疮皮肤表面，用笔在纸上描出压疮面积(cm2)。用公式p＝(1-a1/ao)x100％计算创面愈合率，评价创面的愈合速度。(p：愈合率；a1：现有伤口面积；ao：原伤口面积。)3.小鼠压疮创面修复功能评价结果3.1样品对小鼠压疮创面溃疡愈合率的影响表3各组创面溃疡愈合率％组别3d7d14d模型对照组10.27±6.3220.63±7.0047.56±7.70肤创宁组13.34±6.0929.73±8.7958.68±6.50环-(酪氨酸-苏氨酸)组14.34±8.5531.26±9.0276.24±8.34*环-(酪氨酸-天冬氨酸)组14.89±6.3235.74±8.4379.76±7.19*注：*表示与模型组比较p<0.05根据表3的统计结果：换药3d、7d、14d后，各组各时间段创面愈合率以环-(酪氨酸-苏氨酸)组和环-(酪氨酸-天冬氨酸氨酸)组最高，在第14天时，分别达到了76.24％和79.76％；而肤创宁组次之，模型对照组相对愈合率较低。由表3显示，实施例1制备的环二肽对小鼠的压疮愈合率与模型组相比有统计学意义。综上，实施例1给出了环-(酪氨酸-苏氨酸)、环-(酪氨酸-天冬氨酸)的制备方法，实验例2-3则是所述环二肽的创面修复效果做的进一步说明，试验结果表明，本发明所述的环二肽对急慢性胃溃疡、压疮等创面具有明显的修复能力，且创面修复速度快。当前第1页12