一种水杨醇类化合物及其在制备抗肠道病毒药物中的应用的制作方法

本发明属于属于天然产物领域，具体涉及1个结构新颖的水杨醇类化合物及其在制备抗肠道病毒药物中的应用。

背景技术：
：

具有高度物种多样性的红树内生真菌能够产生结构新颖的次生代谢产物，是发现新型药物先导化合物的重要资源。在对红树植物秋茄(Kandelia candel)内生真菌拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)SCSIO 3.9199的次生代谢产物的研究过程中，我们分离获得1个结构简单的新水杨醇类化合物(Vaccinol J)，它具有很强的抗肠道病毒(EV71)活性，且在有效剂量下，未发现有细胞毒性。因此是开发成为结构简单、活性高效、低毒副作用的抗肠道病毒(EV71)药物的理想侯选化合物。

技术实现要素：
：

本发明的第一个目的的是提供1个具有抗肠道病毒(EV71)活性的新水杨醇类化合物及其药用盐。

本发明涉及的水杨醇类化合物(英文俗名：Vaccinol J)或其药用盐，其结构如式(Ⅰ)所示：

本发明的第二个目的是提供上述水杨醇类化合物的制备方法，所述的水杨醇类化合物是从拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)SCSIO 3.9199的发酵培养物中制备分离得到的。

优选，具体步骤如下：

a、制备拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)SCSIO 3.9199的发酵培养物；

b、将发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，合并浸提液，浸提液回收丙酮后剩余水混合液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩后得到浸膏B，将浸膏A和浸膏B合并，得到粗提物；粗提物经中压正相硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇从体积比100:0梯度洗脱至0:100，收集二氯甲烷/甲醇体积比为99:1洗脱的馏分；将该馏分进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析纯化处理，以二氯甲烷/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱，收集馏分再经纯化后得到如式(Ⅰ)所示的水杨醇类化合物。

所述的a步骤的制备拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)SCSIO 3.9199的发酵培养物优选通过以下方法制备：将活化的拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)SCSIO 3.9199接入种子培养基中，25℃，180rpm，培养72h制得种子液，将种子液以体积百分比5％的接种量接入到发酵培养基中，静置培养28天，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方为每升培养基中含有：甘露醇20g、麦芽糖20g、葡萄糖10g、谷氨酸钠10g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O0.3g、酵母浸膏3g、玉米干粉0.3g、余量为水，pH 7.5。按上述组份和含量混合均匀，然后121℃，灭菌30min。

本发明的第三个目的是提供拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)SCSIO 3.9199在制备上述如式(Ⅰ)所示的水杨醇类化合物中的应用。

本发明通过实验发现，如式(Ⅰ)所示的水杨醇类化合物(Vaccinol J)对肠道病毒(EV71)具有很强的抑制作用，在浓度为30μM时，其抑制率为66.0％，在相同浓度下，对宿主细胞无细胞毒活性，因此可望开发成为无毒/低毒的抗肠道病毒(EV71)新药。

因此，本发明的第四个目的是提供如式(Ⅰ)所示的水杨醇类化合物在制备抗肠道病毒(EV71)药物中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种抗肠道病毒(EV71)药物，其特征在于，其含有如式(Ⅰ)所示的水杨醇类化合物作为活性成分。

综上可知，本发明的拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)SCSIO 3.9199能够产生具有抗肠道病毒(EV71)活性的新颖水杨醇类化合物，该类化合物对肠道病毒(EV71)具有很强的抑制作用，因此能够用于制备抗肠道病毒(EV71)药物。

本发明为制备具有抗肠道病毒(EV71)活性的一类水杨醇化合物的生产制备提供了一种新的方法，为开发高效、低毒的抗肠道病毒(EV71)药物提供了理想的侯选化合物。

本发明的拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)SCSIO 3.9199于2016年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.13162。

附图说明：

图1是拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)SCSIO 3.9199的形态照片；

图2是水杨醇类化合物(Vaccinol J)关键的¹H–¹H COSY(加粗黑线)和HMBC(单箭头)相关。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：如式(Ⅰ)所示的水杨醇类化合物(Vaccinol J)的制备和结构鉴定

一、如式(Ⅰ)所示的水杨醇类化合物的制备

1、种子培养基(发酵培养基)：按每升培养基中重量计算，含有甘露醇20g，麦芽糖20g，葡萄糖10g,谷氨酸钠10g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，酵母浸膏3g，玉米干粉0.3g，余量为水，pH 7.5。每升是这样配制的：将甘露醇20g，麦芽糖20g，葡萄糖10g,谷氨酸钠10g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，酵母浸膏3g，玉米干粉0.3g加入到水中，然后用水定容至1L，调pH值至7.5，然后121℃，灭菌30min。

2、发酵

2.1、种子培养：将活化的拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)SCSIO 3.9199接入每瓶含有50mL种子培养基的250mL的锥形培养瓶中，25℃，180rpm，培养72h制得种子液。

2.2、发酵培养：将种子液以5％的接种量(体积百分比)接入到30L发酵培养基中，25℃，静置培养28天，而制得发酵培养物。

3、萃取：将发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮超声提取3次，每次15min，合并浸提液，浸提液减压回收丙酮后剩余水混合液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液减压蒸馏浓缩后得到浸膏B，将浸膏A和浸膏B合并，得到粗提物(23.7g)。

4、化合物1的分离

将浸膏A和浸膏B合并的粗提物(23.7g)正相硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇从体积比100:0梯度洗脱至0:100，收集二氯甲烷/甲醇体积比为99:1洗脱的馏分，进一步经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱子，采用二氯氯仿-甲醇(体积比1:1)洗脱，洗脱得到的馏分命名为洗脱物；

上述洗脱物采用高效液相HPLC进行精细分离，洗脱体系为：甲醇/水(体积比72：28)，柱子：YMC-pack ODS-A,10×250mm,5μm，流速为4mL/min，得到化合物1(4.7mg，保留时间是18.7min)。

二、化合物1(水杨醇类化合物Vaccinol J)的结构鉴定

对化合物1进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：

化合物1:白色无定型粉末；UV(MeOH)λ_max(logε)204(4.10),264(3.31),291(3.24)nm；¹H和¹³C NMR数据见表1；HRESIMS m/z 295.1315[M+Na]⁺(calcd for C₁₇H₂₀NaO₃,295.1305).

表1.化合物1的¹H-和¹³C-NMR数据归属。

在Bruker Avance 500NMR色谱仪上测量所得，溶剂为CD₃OD。

化合物1关键的¹H–¹H COSY(加粗黑线)和HMBC(单箭头)相关如图2所示。

由此鉴定化合物1为水杨醇类化合物，其结构如式(Ⅰ)所示。

实施例3化合物1的抗肠道病毒(EV71)活性测定

化合物1对肠道病毒(EV71)具有显著抑制活性，实验方法参考文献(Jia Y.L.；Wei M.Y.；Chen H.Y.；Guan F.F.；Wang C.Y.；Shao C.L.(+)-and(-)-Pestaloxazine A,a pair of antiviral enantiomeric alkaloid dimers with a symmetric spiro[oxazinane-piperazinedione]skeleton from Pestalotiopsis sp.Org.Lett.2015,17,4216–4219)。活性结果显示：化合物1抑制肠道病毒(EV71)活性强于阳性对照药病毒唑(Ribavirin)(见表2)。此外，在30μM的浓度下，化合物1(Vaccinol J)没有表现出明显的细胞毒活性，因此提示该化合物能够被用于制备低毒高效的抗肠道病毒(EV71)药物。

表2.化合物1对肠道病毒(EV71)的抑制活性结果