一种重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体制剂的制作方法

本申请是申请号为“201610554636x”，发明名称为“一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂”的专利申请的分案申请。

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体的制剂配方。

背景技术：

肿瘤坏死因子(tnf-α)是由多种类型的细胞产生的细胞因子，包括单核细胞和巨噬细胞，最初是根据它们诱导某些小鼠肿瘤坏死的能力鉴定的(参见old，l.(1985)science230:630-632)。随后，证实了与恶病质相关的被称为恶病蛋白的因子是与tnf-α相同的分子。已证实了tnf-α与介导休克相关，与多种其他人类疾病和失调的病理生理学相关，包括脓毒症，感染，自身免疫性疾病，移植排斥和移植物抗宿主病等。

tnf-α是一种重要的炎症细胞因子，在正常的免疫功能和引起炎症过程的级联反应中起重要的作用。在类风湿关节炎病人关节滑液中，tnf-α和其他炎症因子大量表达。tnf-α作为关键炎症因子，在炎症过程级联反应中的作用及在类风湿关节炎中可能的机制包括：(1)诱导il-1，il-6，il-8，tgf，gm-csf等其它炎症因子的合成；(2)刺激前列腺素e2和白三烯b4等炎症介质的产生；(3)通过上调e-选择素、血管细胞黏附分子及细胞内黏附分子活化白细胞并协助其向炎症部位渗出；(4)刺激中性粒细胞和纤维原细胞产生胶原酶和基质金属蛋白酶。另外，tnf-α还可诱导细胞凋亡及产生急性相反应。因此阻断tnf-α的生成和作用，与阻断其他细胞因子(如il-1)相比，更能全面、有效地抑制类风湿关节炎的发展。

tnf-α抑制剂是目前治疗类风湿关节炎最有效的治疗手段，起效快，疗效确切，尤其是抗tnf-α单抗。但最初制备获得的是鼠源抗tnf-α单克隆抗体，用于类风湿关节炎中和tnf-α的治疗。但研究发现鼠源单抗作为治疗药物存在许多缺陷，鼠源单抗用于人体具有强烈的免疫原性，体内消除快，半衰期短，导致临床疗效有限，副作用大。人源化单抗技术部分克服了抗tnf-α鼠源单抗的缺陷。其中人鼠全人源抗tnf-α单抗(infliximab，)利用基因工程上游构建技术制备获得，其可变区仍取自鼠源tnf-α单抗，保留了与肿瘤坏死因子可溶性片段和跨膜区结合的特异性和亲和力(ka＝1010m-1)，恒定区为人igg1的恒定区所取代，体内半衰期大大延长。

infliximab是一种特异性阻断tnf-α的人鼠嵌合型单克隆抗体，其通过与可溶和跨膜形式tnf-α高亲和力的结合，中和tnf-α的生物学活性，阻断tnf-α与其受体的结合。同时infliximab通过抗体依赖的细胞毒作用和补体依赖的细胞毒作用进一步杀死表达tnf-α的细胞。但infliximab不中和与tnf-α共用相同受体的细胞因子tnfβ(又称为淋巴毒素)的作用。

是infliximab的商品名，其产品为静脉输注用无菌、白色、冻干粉针，每瓶含infliximab100毫克、蔗糖500毫克、聚山梨酯800.5毫克、磷酸二氢钠2.2毫克和磷酸氢二钠6.1毫克，不含防腐剂。使用前用10毫升usp无菌注射用水溶解，ph7.2，再用生理盐水稀释后静脉滴注。

抗体、与其他蛋白质治疗剂一样都是复杂的分子，并且由于在哺乳动物特别是人类中的治疗有效剂量，通常不得在药物制剂中使用大量的抗体。蛋白质治疗剂的液体制剂应当保留蛋白质治疗剂的完整生物活性并保护蛋白质治疗剂的官能团在生产和贮存期限免于降解，蛋白质的降解途径可以涉及化学不稳定性或物理不稳定性。

抗体药物制剂应当是长期稳定的、含有安全且有效量的药物制剂，由抗体的特殊结构及性质决定，抗体类药物在制备、保存、运输过程中需要能够使其稳定的环境。对于不同种类的蛋白质，不同种类的抗体，其理化性质和降解反应等都不同，因此，抗体类药物制剂的制剂缓冲液组合物配方也不尽相同。

为了解决抗体药物的稳定性问题，使其在运输和贮藏过程中仍然保证有效性，很多抗体类药物制剂是以粉针剂的形式供给患者使用。但是，粉针剂在使用时需要使用无菌注射用水或是经过配制的使用于溶解抗体的液体制剂，这样使用会给患者带来不必要的麻烦。

目前通过皮下(sc)注射是单克隆抗体治疗慢性疾病的一种优选实施方式，将抗体药物制备成预充针式的液体制剂，极大地方便患者携带及使用。但是，制剂中药物的含量、药物的物理性质、化学性质等因素都会影响制剂的有效性，需要合适的缓冲体系来确保药物治疗性能的同时，提高高浓度抗体制剂的稳定性。已经尝试了不同的配制剂策略以降低高浓度单克隆抗体液体溶液的粘度，用盐、氨基酸、或糖进行配制。糖和多元醇属于非特异性蛋白质稳定剂，其中蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇等最为常用。

市售的tnf-α抗体制剂humira，其制剂配方为：抗体50mg/ml，氯化钠6.16mg/ml，磷酸二氢钠二水合物0.86mg/ml，磷酸氢二钠二水合物1.53mg/ml，柠檬酸钠0.3mg/ml，柠檬酸一水合物1.3mg/ml，tween801mg/ml，甘露醇12mg/ml，ph5.2。

技术实现要素：

为了解决上述问题，获得稳定的、免疫原性低的抗tnf-α抗体药物制剂，本发明提供了一种新型抗tnf-α抗体，其轻链具有seqidno：1所述氨基酸序列，及重链具有seqidno：3所述氨基酸序列。本发明还公开了一种用于该新型重组抗tnf-α全人源单克隆抗体的稳定制剂。

本发明还包含水药物制剂，包括存在于缓冲液中的治疗有效剂量的抗体，形成了ph约为4-8的制剂，并且在液体状态下的保质期至少为24个月。

本发明提供的稳定制剂，在一种实施方案中，所述药物制剂具有增强了的稳定性，在另一种实施方案中经过冻融循环试验之后是稳定的，在其他实施方案中经过高温、振荡、光照以及长期试验之后均是稳定的。本发明所述的稳定的制剂中含有抗tnf-α抗体，其中所述的抗tnf-α抗体是cmab815。

本发明公开了：

一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂，其特征在于，液体药物制剂，包括存在于缓冲液中的治疗有效剂量的抗体，该制剂的ph约为4-8，保质期至少24个月。

如上所述一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂，其特征在于，所述抗体浓度约为1-100mg/ml。

如上所述一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂，其特征在于，所述抗体浓度约为50mg/ml。

如上所述一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂，其特征在于，所述抗体为cmab815，轻链具有seqidno：1所述核苷酸序列，及重链具有seqidno：3所述核苷酸序列。

如上所述一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂，其特征在于，包括1-100mg/ml的cmab815；0.1-10mg/ml聚山梨酯80；5-20mg/ml甘露糖醇；和含有柠檬酸盐和/或磷酸盐的缓冲系统，ph为4-8。

如上所述一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂，其特征在于，所述缓冲液ph4.9-5.5。

如上所述一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂，其特征在于，缓冲液ph5.2包括50mg/ml的cmab815；1.0mg/ml聚山梨酯80；12.0mg/ml甘露糖醇；6.16mg/ml氯化钠；1.19mg/ml无水柠檬酸；0.3mg/ml柠檬酸二水合物；0.86mg/ml磷酸二氢钠二水合物；1.53mg/ml磷酸氢二钠二水合物。

如上所述一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗其中tnf-α活性是有害的病症的药物。

如上述一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂的用途，其特征在于，制备类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、斑块性银屑病等药物。

本发明对cmab815抗体的制剂进行研究，在本发明的一种优选实施例方案中，所述液体药物制剂包含：包括50mg/ml的cmab815；1.0mg/ml聚山梨酯80；12.0mg/ml甘露糖醇；6.16mg/ml氯化钠；1.19mg/ml无水柠檬酸；0.3mg/ml柠檬酸二水合物；0.86mg/ml磷酸二氢钠二水合物；1.53mg/ml磷酸氢二钠二水合物，ph为5.2。

附图说明

图1、cmab815制剂热稳定性常规图谱

图2、cmab815制剂热稳定性衍生图谱

图3、振荡、高温、光照、强力破坏试验中ph变化图谱

图4、振荡、高温、光照、强力破坏试验中蛋白质含量变化图谱

图5、振荡、高温、光照、强力破坏试验中蛋白质还原电泳纯度变化图谱

图6、振荡、高温、光照、强力破坏试验中高分子杂质变化图谱

图7、振荡、高温、光照、强力破坏试验中电荷异质体变化图谱

图8、振荡、高温、光照、强力破坏试验中蛋白质生物活性变化图谱

图9、冻融试验中蛋白质含量变化图谱

图10、冻融试验中蛋白质还原电泳纯度变化图谱

图11、冻融试验中高分子量杂质变化图谱

图12、冻融试验中蛋白质生物活性变化图谱

图13、不同批次长期稳定性试验蛋白含量检测图谱

图14、不同批次长期稳定性试验生物活性检测图谱

图15、不同批次长期稳定性试验还原电泳纯度检测图谱

图16、不同批次长期稳定性试验sec-hplc/uplc高分子量杂质检测图谱

图17、不同批次长期稳定性试验电荷异质体分布检测图谱。

具体实施方式

实施例1、重组抗tnf-α全人源单克隆抗体cmab815的制备

人工合成重组抗tnf-α全人源单克隆抗体cmab815核苷酸序列，将其核苷酸序列经过酶切后与质粒pcdna3.1(+)(invitrogen公司)进行连接，构建成全人源轻链、重链真核表达载体，seqidno:1和seqidno:3分别显示了全人源单克隆抗体cmab815的重链核苷酸序列；seqidno:2和seqidno:4分别显示了全人源单克隆抗体cmab815的氨基酸序列。于3.5cm组织培养皿中接种3×10⁵cho-k1细胞(atcccrl-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染。

将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养：针对无血清培养经过反复比较优化，最终确定了适于重组抗tnf-α全人源单克隆抗体cmab815的培养基(chom-b08)和补充培养基(chom-s08)，工程细胞在经优化的培养基中表达量大于30pg/cell.day，利用fed-batch培养模式，2周培养周期收获的培养上清中，目的抗体的产量可在3g/l以上。

用proteina亲和柱(ge公司产品)分离纯化全人源单克隆抗体cmab815。

采用上述制备方法获得的cmab815具有不同于已有产品的糖型。

实施例2、制剂的制备

根据实施例1中所述的cmab815的制备方法，获得cmab815抗体。在cmab815的纯化步骤中，采用分子排阻层析，将cmab815抗体纯化溶解在含有1.0mg/ml聚山梨酯80；0mg/ml或12.0mg/ml甘露糖醇；6.16mg/ml氯化钠；1.19mg/ml无水柠檬酸；0.3mg/ml柠檬酸二水合物；0.86mg/ml磷酸二氢钠二水合物；1.53mg/ml磷酸氢二钠二水合物的缓冲液中。

获得上述cmab815抗体溶液后，在该制剂溶液中加入不同浓度的蔗糖，分组，进行稳定性试验检测。分组情况如表1。

表1、不同配方缓冲液分组

试验例1、热稳定性试验分析

取不同制剂配方的缓冲液进行热稳定性试验，利用lifetechnologies推出的proteinthermalshiftdyekit(4461146)试剂及软件，实时定量pcr来分析抗体的热稳定性。选取较优制剂配方。

按照试剂盒中所述试验步骤进行热稳定性试验：

1)、将试验样品与proteinthermalshift染料混合

2)、实时定量pcr仪上运行溶解曲线试验，蛋白受热时解折叠，染料与暴露的疏水区域结合并发出荧光。

3)、利用proteinthermalshift软件进行分析，获得热稳定性分析结果，见图1、图2及表2。

表2、不同配方缓冲液的试验结果如下：

其中最高温度70.91℃最低温度70.32℃之间的极差为0.59℃，未达到试剂盒规定的显著差异指标1℃；

因此从tmb的角度考察上述所有配方均无显著差异。

综合各种试验结果，选用ph5.2、蔗糖20.0g/l、聚山梨酯1.0g/l、氯化钠6.16g/l、无水柠檬酸1.19g/l、柠檬酸钠二水合物0.3g/l、磷酸二氢钠二水合物0.86g/l、磷酸氢二钠二水合物1.53g/l的制剂配方。

试验例2、稳定性试验

选取选用ph5.2、蔗糖20.0g/l、聚山梨酯1.0g/l、氯化钠6.16g/l、无水柠檬酸1.19g/l、柠檬酸钠二水合物0.3g/l、磷酸二氢钠二水合物0.86g/l、磷酸氢二钠二水合物1.53g/l的制剂配方，进行振荡试验、高温试验、光照试验、冻融试验、强力破坏试验，进一步验证制剂稳定性。试验设计见表3及表4。

表3影响因素试验及放置条件

表4原液影响因素试验考察时间点及考察项目

研究结果：

强力破坏试验结果显示，重组抗tnfα全人源单克隆抗体原液在40℃及60％相对湿度条件下，高分子量杂质随放置时间呈增长趋势，至第10天，高分子量杂质超过原液质量标准限度要求(1.0％)；电荷异质体(k0+k1+k2)比例随放置时间呈下降趋势，观察期末，尚符合质量标准。

振荡试验结果显示，重组抗tnfα全人源单克隆抗体原液在2～8℃，300rpm条件下，高分子量杂质随放置时间略有升高，但变化不显著，至观察期末，仍符合质量标准。

高温试验结果显示，重组抗tnfα全人源单克隆抗体原液在25℃及60％相对湿度条件下，高分子量杂质随放置时间略有升高，但变化不显著，至观察期末，仍符合质量标准。

光照试验结果显示，重组抗tnfα全人源单克隆抗体原液在2～8℃，4500lx照度下，侧向放置，高分子量杂质随放置时间呈增长趋势，至第3天，高分子量杂质即超过原液质量标准限度要求(1.0％)，观察期末，高分子量杂质达到1.7％；电荷异质体(k0+k1+k2)比例随放置时间呈下降趋势，观察期末比例为63.9％，超出质量标准。

冻融试验结果显示，重组抗tnfα全人源单克隆抗体原液经历-80℃～25℃反复冻融，10循环或-20℃～25℃反复冻融，10循环，各项质量指标均未观察到显著影响。

以上结果提示，重组抗tnfα全人源单克隆抗体原液应在低温下避光保存，避免振荡。在工艺过程有需要时，可以在有限的范围内进行冻融，不会影响原液的质量。

振荡、高温、光照、强力破坏试验中ph变化图谱见图3、蛋白质含量变化图谱见图4、蛋白质还原电泳纯度变化图谱见图5、高分子杂质变化图谱见图6、电荷异质体变化图谱见图7、蛋白质生物活性变化图谱见图8。冻融试验中蛋白质含量变化图谱见图9、蛋白质还原电泳纯度变化图谱见图10、高分子量杂质变化图谱见图11、蛋白质生物活性变化图谱见图12。

根据上述实验结果，优选ph5.2、蔗糖20.0g/l、聚山梨酯1.0g/l、氯化钠6.16g/l、无水柠檬酸1.19g/l、柠檬酸钠二水合物0.3g/l、磷酸二氢钠二水合物0.86g/l、磷酸氢二钠二水合物1.53g/l的制剂配方。

试验例3、长期稳定性试验

选取选用ph5.2、蔗糖20.0g/l、聚山梨酯1.0g/l、氯化钠6.16g/l、无水柠檬酸1.19g/l、柠檬酸钠二水合物0.3g/l、磷酸二氢钠二水合物0.86g/l、磷酸氢二钠二水合物1.53g/l的制剂配方，进行制剂配方的长期稳定性试验。

将上述抗体药物制剂放置于-18℃以下，取1402批、1403批、1404批次的抗体药物制剂，定期取样品进行稳定性考察指标测定。其中长期试验考察的时间及项目见表5。

表5、长期试验考察时间点及项目

取1402批、1403批、1404批次的抗体药物制剂，进行长期稳定性研究，1402批药物制剂的长期稳定性试验结果见表6，1403批药物制剂的长期稳定性试验结果见表7，1404批药物制剂的长期稳定性试验结果见表8。

表6、1402批长期试验结果

表7、1403批长期试验结果

表8、1404批长期试验结果

长期稳定性试验结果显示，重组抗tnfα全人源单克隆抗体原液置于－18℃以下，分析结果显示，蛋白含量、生物活性、还原电泳纯度、sec-hplc/uplc高分子量杂质、电荷异质体分布等各项质量指标均未发生显著变化。蛋白含量试验结果图谱见图13、生物活性试验结果见图14、还原电泳纯度试验结果见图15、sec-hplc/uplc高分子量杂质试验结果见图16、电荷异质体分布试验结果见图17。

以上结果提示，重组抗tnfα全人源单克隆抗体原液保存于－18℃以下，一定时间范围内不会影响原液的质量。

原液长期稳定性试验将继续观察至36个月。

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<110>泰州迈博太科药业有限公司

<120>一种重组抗tnf-α全人源单克隆抗体制剂

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