本发明涉及胶原溶液的制备领域，特别涉及高浓度酸溶性胶原溶液及水溶性胶原溶液的制备方法。
背景技术：
胶原是细胞外基质的主要结构蛋白,是生物体内含量最高的蛋白质,它广泛存在于人体及动物体内。作为一种来源广泛的天然高分子材料,胶原具有许多优异的性能,如与细胞的高亲和力,与血小板产生血凝作用,可促进伤口收敛及表皮细胞的爬行覆盖,可生物降解等,因而被广泛应用于医药卫生领域。胶原通常是以溶液的形态从动物皮中提取得到，再进行冻干处理后得到精制胶原海绵，这种胶原在酸性溶液中可溶解，称为酸溶胶原。中国专利申请“一种水溶性未变性胶原及其制备方法”(201610348502.2)。该法利用聚羧酸-nhs酯对酸溶性胶原进行改性，nhs酯基与胶原氨基反应，使胶原与聚羧酸连接起来，聚羧酸上所带的大量羧基可降低胶原等电点，增强胶原在中性条件下的溶解性能。改性之后，将胶原冷冻干燥，得到水溶性胶原海绵。胶原海绵可重新溶解于溶剂中，以溶液的形态得到应用，也可将胶原溶液进一步制成胶原纤维、胶原凝胶等产品形态加以应用。
在许多应用场合中，希望胶原溶液具有较高的浓度，以利于加工成各种所需的产品形态。然而，由于胶原分子的特性，其在溶液中易于形成分子间氢键，进而进一步形成聚集体，从而使胶原溶液变稠，胶原溶液的浓度难以进一步提高。一般情况下胶原溶液在约20g/l的浓度时即已十分粘稠，达20g/l的浓度后再加入胶原难以继续溶解，使其浓度受到极大的限制。现有文献报道通过浓缩的方法对胶原溶液进行增稠，即采用自然蒸发溶剂或负压下蒸发溶剂的方法，可使胶原的浓度有效提高，达到高浓度(大于30g/l)胶原溶液的要求。但是自然蒸发浓缩的方法周期太长，通常需要数周才能达到目标浓度，且这种方法的处理量太小，难以实现大量制备。负压下蒸发溶剂可略为缩短制备周期，但制备周期依然过长。且蒸发浓缩法导致胶原溶液的内外层浓度不均一，极端情况下甚至导致表层胶原干燥成膜。
技术实现要素：
为此，发明人提供了通过破坏胶原分子的氢键，可高效的进行浓度均匀的高浓度胶原溶液制备的方案。为实现上述目的，发明人提供了一种高浓度酸溶性胶原溶液制备方法，包括以下步骤：
a1：将酸溶性胶原海绵剪碎至细条状，制成第一海绵细条；
a2：将第一海绵细条加入醋酸-尿素溶液或醋酸-硫脲溶液，搅拌至第一海绵细条完全溶解，制成第一混合溶液，其中第一海绵细条的浓度为40-80g/l；
a3：将所述第一混合溶液装入第一透析袋，所述第一透析袋置于醋酸溶液中透析24-72小时，制成高浓度酸溶性胶原溶液。
酸溶性胶原海绵在含有尿素或硫脲的酸性溶剂中进行溶解，由于尿素和硫脲为氢键破坏剂，可破坏胶原之间形成的氢键，避免溶液中的胶原形成胶原聚合体，从而降低胶原溶液的粘度，提高胶原在溶液中的溶解度，使得胶原在溶液中的浓度增加，再通过透析置换出尿素或硫脲，从而得到高浓度的均匀一致的酸溶性胶原溶液。
进一步地，所述a1步骤中，所述酸溶性胶原海绵的通过以下方法制备而得：
b1：将动物皮切块后绞碎，制成第一胶质物；
b2：将所述第一胶质物加入质量百分比3％的胃蛋白酶和浓度为0.5mol/l的醋酸溶液,制成第一悬浊液；将所述第一悬浊液置于4℃恒温摇床中振荡，摇床转速为180r/min，振荡时间为72小时，制成第二混合溶液；
b3：将所述第二混合溶液进行离心取上清液，所述上清液进行盐析，制成第一粗制胶原悬浊液，所述第一粗制胶原悬浊液进行离心，弃上清液，制成第一粗制胶原；
b4：将所述第一粗制胶原加入0.1mol/l醋酸溶液，搅拌至完全溶解，制成第三混合溶液；
b5：将所述第三混合溶液装入第二透析袋，所述第二透析袋置于去离子水中进行透析，透析时间为72小时，制得第四混合溶液；
b6：将所述第四混合溶液进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为72小时，制得酸溶性胶原海绵。
进一步地，所述a2步骤中所述醋酸-尿素溶液和醋酸-硫脲溶液，醋酸摩尔浓度为0.01-0.5mol/l，尿素和硫脲的浓度为5-30g/l。
进一步地，所述a2步骤中，温度控制在4-10℃，溶解时间控制在30-180分钟。
进一步地，所述a3步骤中，醋酸溶液的浓度为0.01-0.1mol/l，醋酸溶液每隔12小时换液1次。
此外，发明者还提供了一种高浓度水溶性胶原溶液制备方法，包括以下步骤：
c1：将水溶性胶原海绵剪碎至细条状，制成第二海绵细条；
c2：将第二海绵细条加入尿素溶液或硫脲溶液，搅拌至第二海绵细条完全溶解，制成第五混合溶液，其中第二海绵细条的浓度为40-80g/l；
c3：将所述第五混合溶液装入第三透析袋，所述第三透析袋置于去离子水中透析24-72小时，制成高浓度水溶性胶原溶液。
水溶性胶原海绵在尿素或硫脲溶剂中进行溶解，由于尿素和硫脲为氢键破坏剂，可破坏胶原之间形成的氢键，避免溶液中的胶原形成胶原聚合体，从而降低胶原溶液的粘度，提高胶原在溶液中的溶解度，使得胶原在溶液中的浓度增加，再通过透析置换出尿素或硫脲，从而得到高浓度的均匀一致的水溶性胶原溶液。
进一步地，所述c2步骤中所述尿素溶液和硫脲溶液，尿素和硫脲的浓度为5-30g/l。
进一步地，所述c2步骤中，温度控制在4-10℃，溶解时间控制在60-180分钟。
进一步地，所述c3步骤中，去离子水每隔12小时换液1次。
区别于现有技术，上述技术方案将胶原海绵在含氢键破坏剂的溶剂中进行溶解，由于氢键破坏剂可破坏胶原之间形成的氢键，避免溶液中的胶原形成胶原聚合体，从而降低胶原溶液的粘度，提高胶原在溶液中的溶解度，使得胶原在溶液中的浓度增加至30g/l以上，再通过透析置换出含氢键破坏剂的溶剂，从而得到高浓度均匀一致的胶原溶液。该方案可用胶原海绵在较短时间内大批量制备浓度均匀的高浓度酸溶性胶原溶液和水溶性胶原溶液，改变了目前行业内高浓度的酸溶性胶原溶液和水溶性胶原溶液制备产量较小、制备周期过长，以及难以获得均匀一致的高浓胶原溶液的情况。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。
本发明高浓度酸溶性胶原溶液及水溶性胶原溶液的制备方法技术路线为：胶原海绵剪碎至细条→在含氢键破坏剂的溶液中进行溶解，达到所需浓度→透析置换出氢键破坏剂→得到高浓胶原溶液。
本实施方式中所述的胶原是未经降解处理的天然胶原。
实施例1：
(1)将牛皮切成小块，放入绞肉机中绞碎。将湿重10g的绞碎牛皮放入锥形瓶中，加入0.3g的胃蛋白酶和500ml浓度为0.5mol/l的醋酸，然后将锥形瓶放入4℃恒温摇床中振荡提取胶原，摇床转速设为180r/min，工作时间72小时。振荡提取后的溶液经离心后取上清液，加入氯化钠至0.7mol/l浓度进行盐析后再次离心，弃上清液，所得的粗制胶原溶于0.1mol/l的醋酸中进行溶解，将溶解好的胶原溶液装入透析袋中，用去离子水透析72小时，最后真空冷冻干燥72小时制得酸溶性胶原海绵。
(2)取醋酸0.01mol和尿素30g,配制1l的醋酸-尿素溶液(其中醋酸摩尔浓度0.01mol/l，尿素浓度为30g/l)，将80g酸溶性胶原海绵剪碎至细条状，逐渐加入该溶剂中，在4℃搅拌120分钟，至海绵完全溶解。将溶解后的混合溶液装入透析袋，在透析液(0.01mol/l醋酸溶液)中透析72小时，期间每12小时换液1次，透析完成后即得高浓度的透明状酸溶性胶原溶液。
(3)将透明状酸溶性胶原溶液用0.01mol/l醋酸溶液稀释10倍后，用biurets法在540nm进行浓度检测，测出稀释后胶原溶液浓度为7.82g/l，实施例1所得酸性胶原溶液浓度为78.2g/l。
实施例1用酸溶性胶原海绵制备浓度为78.2g/l的酸性胶原溶液所需时间为74小时；而传统自然蒸发法所需时间为27-29天，负压蒸发法所需时间为16-17天。
实施例2
(1)将猪皮切成小块，放入绞肉机中绞碎。将湿重10g的绞碎猪皮放入1l的锥形瓶中，加入0.3g的胃蛋白酶和500ml浓度为0.5mol/l的醋酸，然后将锥形瓶放入4℃恒温摇床中振荡，工作转速为180r/min，工作时间为72小时。振荡后的溶液经离心后取上清液，加入氯化钠至0.7mol/l浓度进行盐析后再次离心，弃上清液，所得的粗制胶原溶于0.1mol/l的醋酸中，将溶解好的胶原溶液装入透析袋中对去离子水透析72小时，最后真空冷冻干燥72小时，制得酸溶性胶原海绵。
(2)取醋酸0.05mol和硫脲5g，配制1l醋酸-硫脲溶液(醋酸摩尔浓度0.5mol/l，硫脲浓度为5g/l)，将60g酸溶性胶原海绵剪碎至细条状，逐渐加入该溶剂中，在7℃搅拌溶液60分钟，至海绵完全溶解。将混合溶液装入透析袋，在透析液(0.1mol/l醋酸溶液)中透析24小时，期间每12小时换液1次，透析完成后即得高浓度的透明状酸溶性胶原溶液。
(3)将透明状酸溶性胶原溶液用0.1mol/l醋酸溶液稀释10倍后，用biurets法在540nm进行检测，测出稀释后胶原溶液浓度为5.90g/l，实施例2所得酸溶性胶原溶液浓度为59.0g/l。
实施例2用酸溶性胶原海绵制备浓度为59.0g/l的酸性胶原溶液的所需时间为25小时；而自然蒸发法所需时间为20-21天，负压蒸发法所需时间为12-13天。
实施例3
(1)将鱼皮切成小块，放入绞肉机中绞碎。将湿重10g的绞碎鱼皮放入锥形瓶中，加入0.3g的胃蛋白酶和500ml浓度为0.5mol/l的醋酸，然后将锥形瓶放入4℃恒温摇床中振荡，工作转速为180r/min，工作时间72小时。振荡后的溶液经离心后取上清液，加入氯化钠至0.7mol/l浓度进行盐析后再次离心，弃上清液，所得的粗制胶原溶于0.1mol/l的醋酸中，将溶解好的胶原溶液装入透析袋中对去离子水透析72小时，最后真空冷冻干燥72小时，制得酸溶性胶原海绵。
(2)取醋酸0.25mol和尿素17.5g,配制1l醋酸-尿素溶液(醋酸摩尔浓度0.25mol/l，尿素浓度17.5g/l)，将40g的酸溶性胶原海绵剪碎至细条状，逐渐加入该溶剂中在10℃搅拌180分钟，至海绵完全溶解。将混合溶液装入透析袋，在透析液(0.05mol/l醋酸溶液)中透析48小时，期间每12小时换液1次，透析完成后即得高浓度的透明状酸溶性胶原溶液。
(3)将透明状酸溶性胶原溶液用0.05mol/l醋酸溶液稀释10倍后，用biurets法在540nm进行检测，测出稀释后胶原溶液浓度为3.92g/l，实施例3所得酸溶性胶原溶液浓度为39.2g/l。
实施例3用酸溶性胶原海绵制备浓度39.2g/l的酸性胶原溶液的所需时间为51小时，传统自然蒸发法所需时间为15-16天，负压蒸发法所需时间为8-9天。
实施例4
(1)将500mg的聚谷氨酸加入10ml的二甲基亚砜溶液中，搅拌，直至聚谷氨酸完全溶解；加入100mg的丁二酰亚胺，搅拌，再加入33mg的碳化二亚胺，常温下反应9h，加入无水乙醇使产物析出；用无水乙醇洗涤2次，正己烷洗涤2次后，真空干燥，得聚谷氨酸-nhs酯。
(2)将天然胶原溶解于盐酸溶液中(ph3.0)，浓度为10mg/ml；聚谷氨酸-nhs酯溶解于dmso中，浓度为50mg/ml；取胶原溶液40ml，加入聚谷氨酸-nhs酯溶液1200μl(1/5)，搅拌，常温下反应12小时；用去离子水透析1天，冷冻干燥后得到水溶性胶原海绵。
(3)配制浓度为5g/l的尿素溶液1l，将40g的胶原海绵剪碎至细条状，逐渐加入该溶剂中，在温度7℃搅拌120分钟，至海绵完全溶解。将混合溶液装入透析袋，在去离子水中透析24小时，期间每12小时换液1次，透析完成后即得高浓度的透明状水溶性胶原溶液。
(4)将透明状水溶性胶原溶液用去离子水稀释10倍后，用biurets法在540nm进行检测，测出稀释后胶原溶液浓度为3.95g/l，实施例4所得水溶性胶原溶液浓度为39.5g/l。
实施例4用水溶性胶原海绵制备浓度39.5g/l的水性胶原溶液的所需时间为26小时，而传统自然蒸发法所需时间为16-17天，负压蒸发法所需时间为9-10天。
实施例5
(1)将1000mg的聚苹果酸加入20ml的dmso溶液中，搅拌，直至聚苹果酸完全溶解。加入50mg的nhs，搅拌，再加入50mg的edc，常温下反应18h，加入无水乙醇使产物析出。用无水乙醇洗涤2次，正己烷洗涤1次后，真空干燥，得聚苹果酸-nhs酯。
(2)将天然胶原溶解于盐酸溶液中(ph2.5)，得浓度为5mg/ml的胶原溶液；将聚苹果酸-nhs酯溶解于dmso中，浓度为100mg/ml；取胶原溶液20ml，加入聚苹果酸-nhs酯溶液500μl(1/2)，搅拌，常温下反应18h；用去离子水透析2d，冷冻干燥后得到水溶性胶原海绵。
(3)配制30g/l的硫脲溶液1l，将60g的水溶性胶原海绵剪碎至细条状，逐渐加入该溶剂中，在4℃搅拌60分钟，至海绵完全溶解。将混合溶液装入透析袋，在去离子水中透析48小时，期间每12小时换液1次，透析完成后即得高浓度的透明状水溶性胶原溶液。
(4)将透明状水溶性胶原溶液用去离子水稀释10倍后，用biurets法在540nm进行浓度检测，测出稀释后胶原溶液浓度为5.93g/l，实施例5所得水溶性胶原溶液浓度为59.3g/l。
实施例5用水溶性胶原海绵制备59.3g/l的水性胶原溶液的所需时间为49小时，而传统自然蒸发法所需时间为21-22天，负压蒸发法所需时间为14-15天。
实施例6
(1)将2000mg的聚谷氨酸加入50ml的dmso溶液中，搅拌，直至聚谷氨酸完全溶解；加入1000mg的nhs，搅拌，再加入800mg的edc，常温下反应15h，加入丙酮使产物析出；用无水乙醇洗涤3次，正己烷洗涤2次后，真空干燥，得聚谷氨酸-nhs酯。经测定，聚谷氨酸-nhs酯的酯化度为15.3％。
(2)将天然胶原溶解于盐酸溶液中(ph4.5)，浓度为1mg/ml；聚谷氨酸-nhs酯溶解于dmso中，浓度为10mg/ml；取胶原溶液30ml，加入聚谷氨酸-nhs酯溶液150μl(1/20)，搅拌，常温下反应24小时。用去离子水透析3天，冷冻干燥后得到水溶性胶原海绵。
(3)配制17.5g/l的硫脲溶液1l，将80g的胶原海绵剪碎至细条状，逐渐加入该溶剂中，在10℃搅拌180分钟，至海绵完全溶解。将混合溶液装入透析袋，在去离子水中透析72小时，期间每12小时换液1次，透析完成后即得高浓度的透明状水溶性胶原溶液。
(4)将透明状水溶性胶原溶液用去离子水稀释10倍后，用biurets法在540nm进行检测，测出稀释后胶原溶液浓度为7.97g/l，实施例6所得水溶性胶原溶液浓度为79.7g/l。
实施例6用水溶性胶原海绵制备的79.7g/l水性胶原溶液的所需时间为75小时，而传统自然蒸发法所需时间为28-30天，负压蒸发法所需时间为18-19天。
综合以上实施例，本发明所制备的酸溶性胶原溶液的浓度为39.2-78.2g/l，本发明所制备的水溶性胶原溶液的浓度为39.5-79.7g/l；胶原溶液的浓度均超过39g/l，达到高浓度胶原溶液(胶原溶液的浓度超过30g/l)的要求，可满足各种加工产品的需要。本发明高浓度胶原溶液制备时间最高为75小时，远低于同浓度传统自然蒸发法和负压蒸发法的制备时间。同时，由于蒸发法的原理，要生产高浓度胶原溶液需配置几倍量的低浓度胶原溶液进行蒸发，因此在相同的生产条件下，采用本发明制备方法的生产批量数倍于蒸发法。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。