一种具生物活性的霍乱毒素B亚基蛋白的制备方法与流程

本发明涉及生物技术和资源利用与可持续发展领域，具体涉及一种具生物活性的霍乱毒素b亚基蛋白的制备方法。

背景技术：

霍乱弧菌(vibriocholerae)引起一种烈性肠道传染病，表现为腹泻脱水、休克甚至死亡，属于国际检疫传染病。世界卫生组织2016年统计数据显示，全球每年爆发130～400万起霍乱病例，每年因为霍乱造成2.1～14.3万人死亡。霍乱严重危害人类健康，而霍乱毒素(choleratoxin，ct)是霍乱弧菌分泌的一种具有adp-核糖基转移酶活性的毒素，是引起腹泻的主要因素。ct是一种典型的ab5结构的毒素，5个b亚基非共价结合成非常紧凑稳定的圆桶状五聚体；a亚基(cta)呈球形，由cta1和cta2两部分组成，cta1与cta2由肽键和二硫键相连，cta2肽插入ctb五聚体的桶状中心，并与b5非共价紧密结合，形成支架将a1与b5连在一起。ct通过ctb与肠道上皮细胞膜gm1受体(单唾液酸神经节苷脂)结合后，内吞经脂质筏运输到达高尔基体(orlandiandfishman,1998；wolfetal.,1998)，再到内质网。在内质网中，霍乱毒素与内质网腔中的一些宿主蛋白相互作用，使a亚基的a1部分和毒素其它部分分离，并且被去折叠，形成无结构的多肽链，进入细胞质基质，重新形成有结构的具有酶活性的蛋白(tsaietal.,2001；tsaiandrapoport,2002；fujinagaetal.,2003)。

由于霍乱毒素b亚基(ctb)是霍乱毒素无毒性细胞结合部位，易于与细胞膜表面gm1受体结合(merrittetal.,1994)而进入细胞的特性，且神经组织中gm1含量较为丰富，因此ctb常作为一种经典神经环路示踪分子载体且具有高灵敏度，与特定探针连接后，即可作为一种示踪剂。在神经磁共振成像(mri)中，已经有研究ctb与dota-gd共价连接后作为造影剂，具有特异性，信号增强，并且可稳定存在一周以上(wu,c.w.-h.,etal.2011.)。更重要的是，ctb可作为配体与不同物质结合制备新型神经示踪剂，这些研究都显示ctb在神经解剖学示踪剂的发展中的广泛应用价值。

大量研究结果表明，霍乱毒素b亚基(ctb)不具有毒性，但仍有很强的免疫原性，口服后能产生较高的抗体效价，现在已被用于开发作为霍乱弧菌的保护性疫苗。同时ctb也具有较强的免疫佐剂活性，可以作为抗原输送载体使用，抗原分子与ctb融合后与肠相关淋巴组织细胞表面的gm1具有很强的亲和力，有利于抗原的传递和免疫识别。对于一些通过吸附粘膜侵入机体的病原体，通过粘膜途径给药的疫苗比皮下注射疫苗更具有优势，因此粘膜佐剂的研究对于开发口服、鼻饲等通过粘膜给药的疫苗具有重要意义。

另外，已有研究证实霍乱毒素能在体外诱导大鼠和人的脑癌细胞分化为正常细胞(li,y.,etal.2007.)，对引起恶性高血压的肾上腺髓质瘤细胞也有逆转作用，该研究意味着霍乱毒素在特定癌症治疗方面有了新的应用价值。

天然霍乱毒素来源于霍乱弧菌，由于霍乱弧菌的高传染性，对于普通生化实验室无法直接通过大量培养霍乱弧菌提取天然霍乱毒素，而商业化的霍乱毒素价格昂贵，纯度有限，且通常只是非标记样品，无法充分满足实验室研究及各种标记方法发展需要，也难以对毒素进行改造以扩展其应用，特别是神经环路的示踪。因此原核重组高效表达具有生物活性的霍乱毒素显得十分必要。虽然文献中也有多次报道ctb体外表达，包括原核，真核表达，但表达量并不高，所得到的蛋白是否具有生物活性也并不清楚。

本发明就是利用原核表达载体，在大肠杆菌中大量表达霍乱毒素亚基，然后在体外进行高效复性，得到大量具有生物活性的霍乱毒素b亚基，普通实验室均可操作，无污染。最重要的优点是，可以根据实验需求，进行各种荧光，同位素，示踪剂标记。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具生物活性的霍乱毒素b亚基蛋白的制备方法，按照常规原核表达方式获得的ctb蛋白包涵体，均可使用本发明提供的方法以获得功能蛋白，蛋白复性效率高，并具有生物活性。该方法简单，操作方便，安全可靠。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种具生物活性的霍乱毒素b亚基蛋白的制备方法，包括下述步骤：

将纯化后的霍乱毒素b亚基蛋白包涵体依次进行下述处理：

1)含有4m尿素缓冲液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,5mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,4murea，ph8.5)透析12-24小时；

2)含有2m尿素缓冲液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,5mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,2murea，ph8.5)透析12-24小时；

3)含有1m尿素缓冲液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,5mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,1murea，ph8.5)透析12-24小时；

4)不含尿素缓冲液(20mmtris,100mmnacl,ph8.5)透析10-24小时，并继续透析2-3遍，即得具备活性的霍乱毒素b亚基蛋白；

以上所述透析过程中所用透析袋的规格为10kd。

以上所述方案中，优选的：

将纯化后的霍乱毒素b亚基蛋白包涵体依次进行下述处理：

1)含有4m尿素缓冲液透析24小时；

2)含有2m尿素缓冲液透析24小时；

3)含有1m尿素缓冲液透析24小时；

4)不含尿素缓冲液透析24小时；

5)不含尿素缓冲液透析10小时；

6)不含尿素缓冲液透析10小时，即得具备活性的霍乱毒素b亚基蛋白。

以上所述方案中，优选的，所述的纯化的霍乱毒素b亚基蛋白包涵体的浓度为0.2mg/ml。以上所述方案中，优选的，纯化的霍乱毒素b亚基蛋白包涵体的制备方法包括：

1.原核表达载体的构建：将seqidno.1所示核苷酸序列克隆到pet28a-oh载体上，得到ctb-pet28a-oh表达载体；

pet28a-oh载体是通过pcr删掉pet-28a(+)的n端his-tag以后至bamhi以前的序列得到。

2.表达载体转化：将ctb-pet28a-oh表达载体转入大肠杆菌bl21(de3)中。

3.单克隆活化：挑取含有ctb-pet28a-oh表达载体的单克隆，在5ml含有卡纳抗性的lb培养基中，37℃，220rpm振荡培养进行活化。

4.放大培养：将活化12小时的菌液转入1l含有50mg/l卡那霉素的lb培养基中，37℃，220rpm继续振荡放大培养。

5.诱导表达：放大培养4小时，菌液od600为0.8，加入终浓度为1.0mm的iptg，37℃，220rpm继续振荡培养6小时。

6.细菌收集：6000rpm，离心10min，收集细菌。

7.超声波破碎细菌：收集的细菌用50ml裂解缓冲液(100mmtris,500mmnacl,0.1％tritonx-100,5mmedta,ph8.0)悬浮，冰水中超声(6#变幅杆、25w、3son/6soff)破碎细菌。

8.包涵体收集：超声后破碎的细菌，12000g，离心20min，去掉上清，留包涵体。

9.包涵体清洗：包涵体用50ml清洗缓冲液(50mmtris,500mmnacl,10mmβ-巯基乙醇，2murea,ph8.5)悬浮，并使用研磨器充分研磨包涵体10min混匀，然后12000g，离心20min，去上清，得包涵体。包涵体再按照本步骤重复清洗3遍。

10.包涵体溶解：清洗后的包涵体用100ml溶解缓冲液(50mmtris,500mmnacl,10mmβ-巯基乙醇,6m盐酸胍,ph8.5)溶解，并在4℃，200rpm持续搅拌20小时，使包涵体充分溶解。

11.包涵体的亲和纯化：使用镍柱亲和纯化，结合缓冲液的配方为：50mmtris,500mmnacl,20mm咪唑,8murea,ph8.5,平衡10个柱长；盐酸胍溶解的包涵体离心20000rpm，30min，上清与镍柱亲和(2ml/min)，再使用洗脱缓冲液(50mmtris,500mmnacl,250mm咪唑,8murea,ph8.5)将蛋白洗脱下来，洗脱速度是2ml/min，既得纯度≥95％以上的ctb包涵体。

本与现有技术相比，具有以下优点和显著的效果：

蛋白表达量高，包涵体处理后纯度高，有生物活性，复性效率大大提升，操作方便，设备简单，安全可靠，适用于大量制备样品标准品。

附图说明

图1为¹⁹fnmr观测ctb包涵体复性过程。

图2为sds-page观测ctb包涵体复性过程。

图3为ctb-fitc侵染t84细胞的荧光实验以验证ctb活性示意图；

其中图3中a、b和c:fitc-ctb(表达复性)；图3中d、e和f:fitc-ctb(sigma公司购买)；图3中g、h和i:fitc(空白对照)

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1:

一种具生物活性的霍乱毒素b亚基蛋白的制备方法，包括下述步骤：

1.原核表达载体的构建：将ctb基因(seqidno.1所示核苷酸序列，对应的氨基酸序列为seqidno.2所示)克隆到pet28a-oh载体上(酶切位点bamhi和xhoi)，得到

ctb-pet28a-oh表达载体。

pet28a-oh载体是通过pet-28a(+)载体改造得到，具体是通过pcr删掉pet-28a(+)的n端his-tag以后至bamhi以前的序列，这样改造可以使克隆后的ctb-pet28a-oh表达载体n端只有his-tag，提高ctb的表达量同时，减少后期酶切程序。

2.表达载体转化：将ctb-pet28a-oh表达载体转入大肠杆菌bl21(de3)中。

3.单克隆活化：挑取含有ctb-pet28a-oh表达载体的单克隆，在5ml含有卡纳抗性的lb培养基中，37℃，220rpm振荡培养进行活化。

4.放大培养：将活化12小时的菌液转入1l含有卡那霉素(50mg/l)的lb培养基中，37℃，220rpm继续振荡放大培养。

5.诱导表达：放大培养4小时，菌液od600为0.8，加入终浓度为1.0mm的iptg，37℃，220rpm继续振荡培养6小时。

6.细菌收集：6000rpm，离心10min，收集细菌。

7.超声波破碎细菌：收集的细菌用50ml裂解缓冲液(100mmtris,500mmnacl,0.1％tritonx-100,5mmedta,ph8.0)悬浮，冰水中超声(6#变幅杆、25w、3son/6soff)破碎细菌。

8.包涵体收集：超声后破碎的细菌，12000g，离心20min，去掉上清，留包涵体。

9.包涵体清洗：包涵体用50ml清洗缓冲液(50mmtris,500mmnacl,10mmβ-巯基乙醇，2murea,ph8.5)悬浮，并使用研磨器充分研磨包涵体10min混匀，然后12000g，离心20min，去上清，得包涵体。包涵体再按照本步骤重复清洗3遍。

10.包涵体溶解：清洗后的包涵体用100ml溶解缓冲液(50mmtris,500mmnacl,10mmβ-巯基乙醇,6m盐酸胍,ph8.5)溶解，并在4℃，200rpm持续搅拌20小时，使包涵体充分溶解。

11.包涵体的亲和纯化：使用镍柱亲和纯化，结合缓冲液的配方为：50mmtris,500mmnacl,20mm咪唑,8murea,ph8.5,平衡10个柱长；盐酸胍溶解的包涵体离心20000rpm，30min，上清与镍柱亲和(2ml/min)，再使用洗脱缓冲液(50mmtris,500mmnacl,250mm咪唑,8murea,ph8.5)将蛋白洗脱下来，洗脱速度是2ml/min。此时能得到纯度≥95％以上的ctb包涵体，1llb菌液(od600为0.8)可得到ctb包涵体50mg。

12.包涵体复性:亲和纯化的包涵体用洗脱缓冲液稀释至浓度为0.2mg/ml，装入10kd透析袋按照下述顺序依次进行梯度透析：

a：含有4m尿素缓冲液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,5mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,4murea，ph8.5)透析24小时；

b：含有2m尿素缓冲液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,2mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,2murea，ph8.5)透析24小时；

c：含有1m尿素缓冲液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,1mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,1murea，ph8.5)透析24小时；

d：不含尿素缓冲液(20mmtris,100mmnacl,2.5％glycerol,0.5％glycine,0.1mmgssg,0.1mmgsh,ph8.5)透析24小时；

e：不含尿素缓冲液(20mmtris,100mmnacl,ph8.5)透析10小时；

f：不含尿素缓冲液(20mmtris,100mmnacl,ph8.5)透析10小时；

13.复性结束的蛋白收集浓缩：透析结束后，收集所有透析袋里的样品，20000g,，30min离心，取上清，即为正确复性的霍乱毒素b亚基复合物。

14.蛋白浓缩：用30kd蛋白浓缩管，4000rpm离心浓缩蛋白，置于冷冻干燥机，得到霍乱毒素b亚基蛋白粉末，用于实施例2。

通过以上方法，1llb菌液(od600为0.8)可以得到40mg霍乱毒素b亚基蛋白。根据最终得到的有生物活性的蛋白的量，可得计算出，按照本发明提供的方法，霍乱毒素b亚基蛋白复性率为80％。

实施例2:

霍乱毒素b亚基蛋白的活性检测：

1.在霍乱毒素b亚基表达过程中，在培养基中，加入5-氟-色氨酸标记ctb的第88位色氨酸，目的是用¹⁹fnmr直接观测包涵体复性过程，在复性过程中，每次更换缓冲液时，取450ul透析袋中样品加入50uld2o，混匀，装入5mm核磁管中，在600mhz核磁谱仪上采氟谱，根据¹⁹f的峰可以清晰观测变性-中间体-复性过程(图1)。同时将每一次采谱的样品取10ul跑sds-page，也可以清楚的看到ctb复性后五聚体的出现(图2)。

2.复性后的霍乱毒素b亚基，为了检测其生物活性，我们用异硫氰酸荧光素(fitc)对蛋白进行标记，得到具有荧光的fitc-ctb，然后取1mgfitc-ctb样品用1mlpbs溶解后孵育人结肠癌上皮细胞，孵育3h，然后用pbs清洗细胞，清洗3遍，确保去掉背景信号。然后使用荧光共聚焦显微镜观察，发现细胞里存在大量荧光(图3中a、b和c)。按照同样的方法，我们用sigma公司购买的fitc-ctb做正对照，看到同样的结果(图3中d、e和f)；用fitc试剂做负对照，细胞里并未观察到荧光(图3中g、h和i)，说明fitc是无法自主进入细胞内的。以上实验可说明实施例1制备的霍乱毒素b亚基蛋白可以自主进入细胞内，具有生物活性。

sequencelisting

<110>中国科学院武汉物理与数学研究所

<120>一种具生物活性的霍乱毒素b亚基蛋白的制备方法

<130>一种具生物活性的霍乱毒素b亚基蛋白的制备方法

<160>2

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>312

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

acacctcaaaatattactgatttgtgtgcagaataccacaacacacaaatacatacgcta60

aatgataagatattttcgtatacagaatctctagctggaaaaagagagatggctatcatt120

acttttaagaatggtgcaacttttcaagtagaagtaccaggtagtcaacatatagattca180

caaaaaaaagcgattgaaaggatgaaggataccctgaggattgcatatcttactgaagct240

aaagtcgaaaagttatgtgtatggaataataaaacgcctcatgcgattgccgcaattagt300

atggcaaattaa312

<210>2

<211>103

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

thrproglnasnilethraspleucysalaglutyrhisasnthrgln

151015

ilehisthrleuasnasplysilephesertyrthrgluserleuala

202530

glylysargglumetalaileilethrphelysasnglyalathrphe

354045

glnvalgluvalproglyserglnhisileaspserglnlyslysala

505560

ilegluargmetlysaspthrleuargilealatyrleuthrgluala

65707580

lysvalglulysleucysvaltrpasnasnlysthrprohisalaile

859095

alaalailesermetalaasn

100